七鳃鳗serpin蛋白在病原体感染的天然免疫防御中的功能研究

论文摘要

七鳃鳗（Lamprey）血清含有大量免疫相关分子如:C3、C1q、VLRB分子等,参与天然免疫以及适应性免疫防御,保护宿主抵御大量外来病原体的入侵。血清中serpin分子属于补体成分,通过抑制补体经典激活途径、凝集素途径中C1分子,在补体系统中发挥重要的调节作用。七鳃鳗serpin（L-serpin）在病原体刺激后其表达量明显上调,说明L-serpin可能参与病原体感染时的免疫防御过程。序列分析结果表明,L-serpin CDS全长为1433 bp,开放阅读框为1371 bp,编码456个氨基酸,包含有1个serpin结构域（Serine protease inhibitor domain）。L-serpin由3个β-片层和8个α-螺旋以及一个暴露的反应中心环（RCL）组成,位于RCL区域的靶蛋白识别位点P1、P1’的氨基酸残基为苏氨酸-丝氨酸。利用生物信息学相关软件预测和分析L-serpin编码氨基酸序列的结构特征、理化性质。L-serpin属于分泌蛋白,不存在跨膜结构,包含1个N-末端信号肽和1个N-型糖基化位点。进化树分析L-serpin属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族F分枝。PCR扩增L-serpin基因,构建到pCold?原核表达载体中,诱导大量rL-serpin蛋白用于多克隆抗体的制备和功能研究。利用半定量分析和免疫印迹方法鉴定L-serpin在七鳃鳗的鳃、神经轴体、肝、肠、肾、心、白细胞以及血清中都有表达,且在神经轴体、肝、白细胞中表达量相对较高。利用实时定量PCR和Western Blot的方法得知,七鳃鳗腹腔注射鳗弧菌、金黄色葡萄球菌和PolyI:C后,其体内的L-serpin表达上调。值得注意的是,在鳗弧菌刺激时,L-serpin表达量变化最为明显,并在8h时达到峰值（P<0.01）。通过免疫荧光证明,L-serpin主要定位于白细胞和肝细胞的胞浆中。利用点突变方法,将L-serpin与蛋白酶识别活性位点P1、P1’分别进行突变,随之进行蛋白表达以及纯化,并利用表面等离子共振与免疫共沉淀方法确定七鳃鳗血清中L-serpin-WT蛋白与七鳃鳗补体分子丝氨酸蛋白酶C1q蛋白存在相互作用,而突变体则失去了相互结合作用。通过流式细胞术、高内涵筛选检测和CCK8检测实验得知,L-serpin会抑制血清对靶细胞的杀伤作用。在体外条件下,利用QPCR和高内涵检测方法得知,在细胞中过表达L-serpin和外源性添加rL-serpin可以抑制LPS诱导的炎症因子产生和细胞死亡。通过免疫荧光与表面等离子共振方法证明了原核重组的L-serpin（rL-serpin）蛋白可结合革兰氏阴性菌表面标记物LPS。并通过菌结合实验证明L-serpin具有与包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌在内的多种微生物结合能力。综上所述,七鳃鳗serpin属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的F分枝,具有典型的serpin结构域和三维构象特征。阐明了L-serpin在病原体感染的天然免疫防御过程中,不仅通过七鳃鳗C1q分子参与免疫过程,并且可通过识别菌等外来病原体,发挥抗菌抗炎的功能,为七鳃鳗补体分子参与防御病原体感染的研究提供了新视角。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 全文专业词汇的英文缩写及中文对照
• 第1章 绪论
•   1.1 serpin基本特征
•     1.1.1 serpin基因及其超家族分类
•     1.1.2 serpin的结构特征及其作用机制
•   1.2 serpin蛋白调节补体系统
•     1.2.1 补体系统
•     1.2.2 serpin抑制C1 复合物的形成
•     1.2.3 C1 复合物的功能
•   1.3 本文研究意义
• 第2章 七鳃鳗L-serpin基因分子克隆和生物信息学分析
•   2.1 材料
•     2.1.1 动物材料
•     2.1.2 药品及试剂
•     2.1.3 主要仪器
•   2.2 方法
•     2.2.1 引物设计
•     2.2.2 PCR扩增
•     2.2.3 L-serpin目的片段回收
•     2.2.4 L-serpin目的片段与T载体连接并测序
•     2.2.5 生物信息学分析
•   2.3 结果
•     2.3.1 L-serpin基因的分子克隆
•     2.3.2 L-serpin生物信息学分析
•   2.4 讨论
• 第3章 L-serpin原核重组质粒构建和蛋白表达纯化及多抗制备
•   3.1 材料
•     3.1.1 动物材料
•     3.1.2 质粒载体和菌株
•     3.1.3 药品及试剂
•     3.1.4 主要仪器
•   3.2 方法
•     3.2.1 原核表达质粒的构建
•     3.2.2 pCold?-L-serpin蛋白小量诱导表达
•     3.2.3 pCold?-L-serpin蛋白大量表达并纯化
•     3.2.4 免疫
•     3.2.5 ELISA检测抗体效价
•     3.2.6 多克隆抗体纯化
•     3.2.7 免疫印迹检测抗体特异性
•   3.3 结果
•     3.3.1 pCold?-L-serpin原核表达载体构建及测序
•     3.3.2 L-serpin蛋白诱导表达和纯化
•     3.3.3 L-serpin多克隆抗体效价检测
•     3.3.4 L-serpin多克隆抗体特异性检测
•   3.4 讨论
• 第4章 L-serpin的组织分布与细胞定位及不同抗原刺激下L-serpin的表达变化
•   4.1 材料
•     4.1.1 实验材料
•     4.1.2 实验药品和试剂
•     4.1.3 主要仪器
•   4.2 方法
•     4.2.1 半定量检测各组织中L-serpin基因的相对表达量
•     4.2.2 QPCR检测L-serpin基因在病原体刺激后相对表达量变化
•     4.2.3 Western Blot检测L-serpin在病原体刺激后表达量变化
•     4.2.4 免疫荧光检测
•     4.2.5 统计
•   4.3 结果
•     4.3.1 L-serpin基因在七鳃鳗各组织的相对表达量
•     4.3.2 Western Blot检测L-serpin蛋白水平七鳃鳗各组织表达量
•     4.3.3 激光共聚焦检测L-serpin在七鳃鳗白细胞的亚细胞定位
•   4.4 讨论
• 第5章 L-serpin与 L-C1q相互作用参与免疫学活性研究
•   5.1 材料
•     5.1.1 实验材料
•     5.1.2 实验药品和试剂
•     5.1.3 仪器设备
•   5.2 方法
•     5.2.1 L-serpin突变体的设计和表达以及纯化
•     5.2.2蛋白酶抑制活性实验
•     5.2.3 Co-IP检测L-serpin与 L-C1qDC-1 相互作用
•     5.2.4 Biacore检测L-serpin与 L-C1qDC-1 相互作用
•     5.2.5 高内涵检测L-serpin对七鳃鳗血清细胞杀伤效果的影响
•     5.2.6 CCK8 检测L-serpin对七鳃鳗血清细胞杀伤效果的影响
•     5.2.7 流式细胞术检测L-serpin影响Hela细胞表面L-C3 沉积实验
•     5.2.8 统计
•   5.3 结果
•     5.3.1 L-serpin突变体的设计和表达以及纯化
•     5.3.2 L-serpin蛋白酶抑制活性检测
•     5.3.3 L-serpin与 L-C1q相互作用
•     5.3.4 L-serpin抑制七鳃鳗血清细胞杀伤活性
•     5.3.5 L-serpin降低Hela细胞表面L-C3 沉积实验
•   5.4 讨论
• 第6章 L-serpin对 LPS刺激下细胞炎症因子产生的影响
•   6.1 材料
•     6.1.1 主要试剂
•     6.1.2 主要仪器
•   6.2 实验方法
•     6.2.1 真核表达载体的构建
•     6.2.2 LPS刺激过表达pIRES2-AcGFP1-Nuc-L-serpin的 H293T细胞
•     6.2.3 高内涵筛选检测LPS刺激下过表达pIRES2-AcGFP1-Nuc-L-serpin的H293T细胞死亡率
•     6.2.4 体外以LPS和 r L-serpin刺激RAW264.7和HUVEC细胞
•     6.2.5 体外以LPS和 r L-serpin刺激七鳃鳗SB细胞和白细胞
•     6.2.6 免疫荧光检测LPS与 L-serpin相互作用
•     6.2.7 Biacore检测LPS与 L-serpin相互作用
•     6.2.8 菌结合实验
•     6.2.9 统计
•   6.3 结果
•     6.3.1 pIRES2-AcGFP1-Nuc-L-serpin真核表达载体的构建
•     6.3.2 L-serpin抑制LPS引起的细胞炎症因子表达上调和细胞死亡
•     6.3.3 L-serpin抑制LPS引起七鳃鳗细胞炎症因子表达的上调
•     6.3.4 r L-serpin与 LPS相互作用
•     6.3.5 L-serpin具有多种菌结合能力
•   6.4 讨论
• 结论
• 本论文的创新点
• 参考文献
• 附录 A 附录内容名称
• 攻读硕士期间论文发表情况
• 项目支持
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王大宇

导师: 李庆伟,逄越

关键词: 七鳃鳗,丝氨酸蛋白酶抑制剂,补体免疫,补体,抗炎

来源: 辽宁师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 辽宁师范大学

基金: 国家自然科学基金项目七鳃鰻免疫蛋白LIP的基因表达调控及其对病原体防御作用的分子机制,(项目编号:31772884),国家科技部973计划课题(子课题)(项目编号:2013CB835304),全国海洋公益项目(项目编号:201305016),国家自然科学基金项目(项目编号:31202020)

分类号: Q95;Q51

总页数: 84

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