结核分枝杆菌H37Rv新基因Rv2742克隆表达及纯化

论文摘要

Rv2742是本课题组前期基于蛋白质基因组学策略从结核分枝杆菌Mycobacteriumtuberculosis H37Rv中发现、鉴定的遗漏注释基因。文中旨在建立结核分枝杆菌H37Rv漏注释蛋白Rv2742的可溶性诱导表达、纯化体系,为进一步探索Rv2742基因参与的生物学功能奠定基础。前期实验发现构建的pGEX-4T-2-Rv2742、pET-28a-Rv2742、pET-32a-Rv2742及pMAL-c2X-Rv2742原核表达载体均无法实现目的蛋白的诱导表达。但经密码子优化后,仅有pMAL-c2X-Rv2742载体能够实现目的蛋白的可溶性诱导表达。此外,通过比较不同宿主菌、温度及IPTG浓度对目的蛋白表达量的影响,发现目的蛋白在Rosetta （DE3）中,16℃及0.5mmol/LIPTG诱导条件下表达量最高。直链淀粉树脂（Amyloseresin）亲和层析柱纯化获得较纯的产物,经LC-MS/MS验证确认是Rv2742融合蛋白肽段序列。成功获得结核分枝杆菌H37Rv新基因Rv2742的重组蛋白,可进一步开展其潜在相互作用及免疫原性研究工作。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 菌株及质粒
•     1.1.2 主要试剂
•     1.1.3 主要仪器设备
•   1.2 方法
•     1.2.1 重组表达质粒的构建
•     1.2.2 Rv2742基因密码子优化及优化产物重组表达质粒的构建
•     1.2.3 重组质粒原核表达及鉴定
•     1.2.4 Rv2742新蛋白诱导表达条件的优化
•     1.2.5 Rv2742融合蛋白的纯化及LC-MS/MS鉴定
•     1.2.6 数据库搜索
•     1.2.7 IPTG诱导表达Rv2742蛋白生长曲线的测定
• 2 结果与分析
•   2.1 重组表达质粒的构建
•   2.2 四种表达载体均未实现Rv2742目的蛋白的诱导表达
•   2.3 Rv2742基因序列密码子优化前后比较
•   2.4 Rv2742新基因密码子优化后实现了目的蛋白的诱导表达
•   2.5 宿主菌Rosetta（DE3）实现了目的蛋白的高表达及诱导条件的优化
•   2.6 Rv2742目的融合蛋白的纯化及LC-MS/MS鉴定
•   2.7 IPTG诱导表达Rv2742蛋白生长曲线的测定
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 赵加玲,武舒佳,王红,李芊璘,孙金帅,常蕾,戴二黑,武军驻,张瑶,徐平

关键词: 结核分枝杆菌,新基因,原核表达,亲和纯化

来源: 生物工程学报 2019年09期

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 武汉大学药学院,军事科学院军事医学研究院生命组学研究所国家蛋白质科学中心(北京)北京蛋白质组研究中心蛋白质组学国家重点实验室,武汉大学基础医学院,华北理工大学公共卫生学院和附属石家庄市第五医院,河北大学生命科学学院,中山大学生命科学学院

基金: 国家精准医学重大专项(No.2017YFC0906600),国家传染病重大专项(No.2018ZX10302302001003),国家自然科学基金(Nos.31670834,31870824,91839302),广东省基础及应用基础研究博士科研启动项目(No.2018A030310257)资助~~

分类号: Q78;R378.911

DOI: 10.13345/j.cjb.190092

页码: 1771-1786

总页数: 16

文件大小: 3100K

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