温州市中医院中医外科浙江温州325000
【摘要】目的：研究半边莲对EGF诱导的HaCaT细胞增殖与凋亡的影响。方法：采用MTT法检测不同浓度EGF对HaCaT细胞增殖的影响及不同浓度半边莲对EGF诱导的HaCaT细胞增殖的影响；FITC-AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡率。结果：半边莲可抑制EGF诱导的HaCaT细胞增殖，并可促进其凋亡。
【关键词】银屑病；半边莲；HaCaT细胞
银屑病是皮肤科常见的一种慢性炎症性疾病，近年在全国的发病率有逐年提高的趋势，本病在青壮年时期高发[1]，具有顽固性和复发性的特点。细胞异常增殖是银屑病的主要病理表现，抑制细胞增殖以及诱导细胞凋亡对其具有重要意义。本课题通过EGF诱导HaCaT细胞的高增殖模型，检测不同浓度的半边莲对HaCaT细胞增殖的抑制作用。报道如下。
资料与方法
1.采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)分别检测不同浓度（2.5ng/ml-120ng/ml）EGF对HaCaT细胞增殖的影响；2.配置不同浓度半边莲并作用于对EGF诱导增殖的HaCaT细胞，通过检测OD值，评估其对HaCaT细胞增殖的影响；3.根据MTT结果及IC50（半数致死浓度），选择模型组（无半边莲作用）及浓度为10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml的半边莲作用于HaCaT细胞，细胞凋亡率流式细胞仪采用FITC-AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡率。
4.统计学分析：
实验数据以均数±标准差（）表示。根据资料的性质，运用SPSS18.0统计软件，组间比较进行单因素方差分析，认为P<0.05具有统计学意义。
结果
（一）不同浓度EGF对HaCaT细胞增殖的影响
使用MTT法检测不同浓度EGF对HaCaT细胞增殖的影响结果显示，正常对照组OD值最低，各EGF组的OD值均高于正常对照组；5ng/ml的EGF可明显促进HaCaT细胞增殖（P＜0.05），至10ng/ml的EGF基本达到最大效应（P＜0.01）；在20ng/ml至120ng/ml，其增殖能力与10ng/ml比没有统计学意义（P>0.05）（见表1）。以上结果表明，EGF在一定浓度范围内呈剂量相关性的促进HaCaT细胞增殖，10ng/ml的EGF可选为最佳增殖浓度。
注：与正常对照组比：*P<0.05，**P<0.01
图1EGF对HaCaT细胞增殖影响的曲线
（二）不同浓度半边莲提取液对HaCaT细胞高增殖模型增殖的影响
使用MTT法检测不同浓度半边莲提取液对EGF诱导的HaCaT细胞增殖的影响结果显示，模型组OD值最高，各加药组的OD值均低于模型组（P＜0.01）；30mg/ml至60mg/ml半边莲组对细胞的抑制能力缓慢降低（见表2）。以上结果表明，随着药物浓度的增加活细胞数降低，半边莲具有抑制细胞增殖的作用，抑制作用随着浓度增加而增强。
注：与模型组比：**P<0.01
（三）流式细胞仪检测HaCaT细胞凋亡情况
v根据MTT结果及IC50（半数致死浓度），选择模型组，及浓度为10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml的半边莲作用于HaCaT细胞，凋亡率分别为2.9%、11.6%、22.6%、35.3%（见图3）。可见随着药物浓度的增加，细胞凋亡率增加。半边莲有诱导细胞凋亡的作用，浓度越高诱导凋亡作用越强。但30mg/ml的半边莲组细胞继发性坏死率较高达33.9%，故认为20mg/ml的半边莲对细胞的促凋亡作用最佳。
图3.430mg/ml半边莲组细胞凋亡率为35.3%
图3流式细胞仪检测细胞凋亡
讨论
银屑病的治疗，目前临床上缺乏毒副作用小，具有确切疗效的治疗方法。因而，中药因其在临床上的安全性和有效性已在银屑病治疗方面得到广泛研究及关注。半边莲为桔梗科植物，性味辛平，具有清热解毒、利水消肿的功效。半边莲中含半边莲碱、芹菜素、香叶木苷、延胡索酸等多种化学成分[2]，临床上作为常用中药用于银屑病的治疗。
银屑病以角质形成细胞（Keratinocyte，KC）过度增殖、炎症细胞浸润、新生血管形成为其组织病理改变的三要素[3]。但是引发上述病理变化的具体机制目前尚未完全明确，多年来国内外学者从细胞水平到分子水平及免疫学、生化学方面对其做了许多细致而深入的研究。HaCaT细胞系是由成人角质细胞转化而来，是永生性非肿瘤细胞系，是研究角质形成细胞增殖和分化等特性的良好模型。目前已经明确角质形成细胞是表皮生长因子（Epidermalgrowthfactor，EGF）的主要靶细胞之一，在银屑病的发病机制中起明确的促发病情作用。EGF诱导HaCaT细胞的高增殖模型已被用于包括银屑病在内的多种皮肤病的体外研究[4]。
细胞异常增殖是一些炎症性疾病如银屑病，以及肿瘤疾病的主要病理表现，EGF诱导HaCaT细胞高增殖状态可以模拟体内多种增生性疾病如银屑病和鳞癌等[5]，因此抑制细胞增殖以及诱导细胞凋亡对这类疾病具有重要意义。
本课题通过EGF诱导HaCaT细胞的高增殖模型，检测不同浓度的半边莲对HaCaT细胞增殖的抑制作用，得出以下结论：1.5ng/ml的EGF可明显促进HaCaT细胞增殖，10ng/ml的EGF基本达到最大效应，从而建立10ng/mlEGF诱导的HaCaT细胞高增殖模型。2.半边莲能抑制HaCaT细胞增殖，并呈浓度依赖性增强。3.半边莲能诱导HaCaT细胞凋亡，随着药物浓度的增加细胞凋亡率增加。浓度为20mg/ml时对细胞的促凋亡作用最佳。
参考文献：
[1]张学军.皮肤性病学[M].北京:人民卫生出版社,2005:129-133.
[2]黄泰康,等.常用中药成分与药理手册[M].北京:中国医药科技出版社,1994.775.
[3]曾武城，等.表皮生长因子对HaCaT细胞miR-21/PDCD4的表达研究[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2016，15(4):1205-208.
[4]BarkerJN.Pathogenenesisofpsoriasis.JDermatol,1998;25(12):778-78.
[5]WangY.N,ChangW.C.Inductionofdisease-associatedkeratin16geneexpressionbyepidermalgrowthfactorisregulatedthroughcooperationoftranscriptionfactorsSplandc-Jun.JBiolChem,2003.278(46):45848-45857.