2017-2018年安徽部分地区猪链球菌的分离鉴定及其生物学特性研究

论文摘要

猪链球菌（Strepptococcussuis,S suis）是猪链球菌病主要病原菌,能够引起猪的脑膜炎、肺炎、败血症、多发性关节炎和皮肤化脓性感染,造成了世界养猪业的经济出现严重的损失,也是一种重要的人畜共患病原菌,对人畜公共卫生安全造成了严重的威胁,且如何进行该病的防控受到了越来越多人员的关注。本研究针对2017～2018年从安徽地区屠宰场表观健康猪只中采集的病料（肺脏）中分离得到的猪链球菌的血清型、耐药性、生物被膜形成能力和基因型进行检测分析,以期为安徽地区猪链球菌病致病菌的分子流行病学研究和对安徽地区猪链球菌病的防治提供了一定的理论基础。在2017年至2018年间,从安徽省多个不同规模屠宰场中表观健康的猪只进行肺脏组织的采集,通过细菌的分离培养和基于gdh基因的特异性PCR方法对疑似猪链球菌进行了 PCR鉴定,共分离鉴定出53株猪链球菌。通过基于cps基因的特异性PCR方法对53株猪链球菌的血清型进行鉴定。其中有11株猪链球菌3型,10株2型,6株8型,5株1型,3株9型,3株29型,分别占 20.7%、18.9%、1 1.3%、9.4%、5.7%、5.7%。另外,猪链球菌 5 型、7 型、12型和31型各有1株,均占1.9%,而且仍有11株为未知血清型（占20.7%）。这表明安徽部分地区屠宰场中表观健康猪只携带的猪链球菌的血清型具有复杂多样的特点,其中猪链球菌血清3型占有主导地位。选取18种临床常用抗菌药物,应用稀释法对猪链球菌分离株进行药物敏感性试验。结果显示,猪链球菌对氟苯尼考、庆大霉素、四环素、林可霉素、红霉素、泰妙菌素、替米考星、链霉素、强力霉素和甲氧苄啶/磺胺甲嗯唑的耐药率都比较高,其中对红霉素、庆大霉素、链霉素、泰妙菌素和甲氧苄啶/磺胺甲嗯唑的耐药率最高,达到了 1 00%;对阿莫西林、头孢噻肟、头孢噻呋、恩诺沙星及青霉素的敏感程度较高,分别达到了 85.71%、78.57%、76.19%和83.33%。此外,不同血清型分离株的耐药性比较结果显示,猪链球菌2型对四环素的耐药率（达到100%）显著高于其他血清型,猪链球菌3型、8型、9型和29型对林可霉素的耐药率（达到100%）显著高于于其他血清型。这表明猪链球菌在一定程度上对临床常用药物产生了耐药性,而恩诺沙星、头孢噻肟和头孢噻呋和青霉素依然是临床用药上的主要治疗药物。而且猪链球菌的血清型与耐药性之间存在一定的相关性,也反应了不同血清型获得抗性的能力差异。利用96孔微板法进行生物被膜培养及用结晶紫染色法对生物被膜形成量进行测定,结果显示这些分离株表现出不同的生物被膜形成能力,共有32株猪链球菌为生物被膜阳性菌株,其中表现出强生物被膜形成菌株和弱生物被膜形成菌株各有16株,其余的21株猪链球菌（包括11株未定型菌株）不能形成生物被膜。此外,猪链球菌能够形成生物被膜的能力比较强的分离株有13株,且以S.suis 032的成膜能力最强。另外,猪链球菌血清2型主要以弱生物被膜形成能力为主,猪链球菌血清3型和8型主要以强生物被膜形成能力为主。此外,所有形成生物被膜的菌株和非生物被膜形成菌株均显示出对阿莫西林、头孢噻呋、头孢喹肟、恩诺沙星、氟苯尼考、庆大霉素、林可霉素、青霉素和替米考星的耐药性,且生物被膜形成菌株对抗生素的抗药性高于非生物被膜形成菌株。然而,与非生物被膜生产者相比,生物被膜生产者对甲氧苄啶/磺胺甲噁唑的耐药率较低。这表明猪链球菌生物被膜存在与抗生素耐药性之间存在正相关,特别是与β-内酰胺类抗生素有关。且猪链球菌生物被膜形成能力与其菌株的血清型存在一定的的关系。运用ERIC-PCR技术对42株猪链球菌分离株的基因组多样性进行表征。这些菌株显示14种不同的模式,包括1至9个条带,范围从约90-1200bp。大多数菌株属于两种密切相关的ERIC-PCR类型（A和D）,而其他类型仅包含少数几种分离株。ERIC-PCR模式与大多数分离株的血清型相关,大多数血清型2（7/10）和血清型3（6/11）菌株属于ERIC-PCRA型,且血清型2、3和2、3、8分别对应于ERIC-PCR类型A和D。这表明不同地区的菌株间具有亲缘关系和较高的遗传异质性,基因型与血清型具有一定的相关性,且ERIC-PCR可能是一种检测猪链球菌分离株血清型的可行的分子技术。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 主要缩略语列表
• 文献综述
• 引言
• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 病料及菌株来源
•     1.1.2 主要试剂与药品
•     1.1.3 主要仪器设备
•     1.1.4 主要溶液的配制
•       1.1.4.1 主要培养基的配制
•       1.1.4.2 主要溶液的配制
•   1.2 方法
•     1.2.1 猪链球菌的分离和初步鉴定
•     1.2.2 猪链球菌的PCR鉴定
•       1.2.2.1 DNA模板制备
•       1.2.2.2 引物的合成
•       1.2.2.3 猪链球菌鉴定的PCR扩增
•       1.2.2.4 猪链球菌的保存
•     1.2.3 猪链球菌血清型鉴定
•       1.2.3.1 猪链球菌的复苏培养
•       1.2.3.2 DNA模板制备
•       1.2.3.3 分型引物合成
•       1.2.3.4 PCR扩增
•     1.2.4 猪链球菌的最小抑菌浓度测定
•       1.2.4.1 质控菌株与试验菌株的复壮
•       1.2.4.2 菌悬液的制备
•       1.2.4.3 药敏板的制备与孵育
•       1.2.4.4 结果判读
•     1.2.5 猪链球菌生物被膜形成能力的测定
•       1.2.5.1 猪链球菌的的培养
•       1.2.5.2 生物被膜的培养
•       1.2.5.3 生物被膜的固定及染色
•       1.2.5.4 结果判定
•     1.2.6 ERIC-PCR法扩增猪链球菌的DNA指纹图谱
•       1.2.6.1 猪链球菌的复苏培养
•       1.2.6.2 DNA模板制备
•       1.2.6.3 引物合成
•       1.2.6.4 ERIC-PCR法扩增
• 2 结果与分析
•   2.1 猪链球菌的分离鉴定
•   2.2 猪链球菌PCR鉴定结果
•   2.3 猪链球菌的PCR分型结果
•   2.4 猪链球菌的耐药性
•   2.5 猪链球菌的生物被膜形成能力
•   2.6 猪链球菌ERIC-PCR分型
•     2.6.1 ERIC-PCR对42株猪链球菌分型结果
•     2.6.2 ERIC-PCR聚类分析
•   2.7 耐药性与血清型及生物被膜形成的关系
•     2.7.1 耐药性与血清型的关系
•     2.7.2 耐药性与生物被膜形成的关系
• 3 讨论
•   3.1 猪链球菌的分离鉴定
•   3.2 猪链球菌血清型分布特征
•   3.3 猪链球菌耐药性分布特征
•   3.4 猪链球菌生物被膜形成
•   3.5 猪链球菌的DNA指纹图谱
•   3.6 猪链球菌耐药性、血清型及生物生物被膜形成的关系
• 4 结论
• 参考文献
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 赵顾

导师: 孙裴

关键词: 猪链球菌,分离与鉴定,血清型,耐药性,生物被膜,基因分型

来源: 安徽农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 安徽农业大学

分类号: S852.61

DOI: 10.26919/d.cnki.gannu.2019.000120

总页数: 68

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