秀丽线虫SET-18调控线粒体和内质网未折叠蛋白压力应答的研究

论文摘要

细胞受到病毒感染,氧化损伤等应激时,导致细胞内积累大量的错误折叠或未折叠蛋白质。为了维持细胞内的蛋白稳态,细胞通过增强蛋白折叠、加速未折叠蛋白质的降解等方式清除未折叠的蛋白质,该过程被称为未折叠蛋白压力应答（unfolded protein response,UPR）。该应答过程主要发生在线粒体和内质网两个细胞器,分别为线粒体和内质网未折叠蛋白压力应答,即UPRmt和UPRER。已有研究发现,UPRmt和UPRER能力与生物体衰老密切相关。在生物体衰老进程中,UPRmt或者UPRER的应答能力发生下降。而激活秀丽线虫UPRmt或者UPRER能够延长线虫的寿命。秀丽线虫是研究衰老调控的经典模式生物之一。本实验室已有的研究发现,具有组蛋白H3K36二甲基转移酶活性的SET-18,通过与哺乳动物高度保守的Insulin/IGF-1信号通路促进线虫衰老。SET-18通过对该信号通路中的FOXO转录因子daf-16a的启动子进行H3K36me2修饰,抑制了daf-16a转录,从而加速了衰老进程。但是SET-18对衰老的促进作用是通过调控何种细胞活动而实现的,目前仍不清楚。由于SET-18主要在线虫肌肉特异性表达,而肌肉是相应UPRmt和UPRER的重要场所。另外有研究发现,与SET-18同源的哺乳动物中SMYD1基因参与UPRER反应。因此,本论文将就SET-18是否调控UPRmt和UPRER进行探讨。HSP-6和HSP-60是应答UPRmt的主要标记基因。我们首先利用杂交技术,构建了带有hsp-6::GFP和hsp-60::GFP的set-18（gk334）突变体线虫。经基因型鉴定构建成功后,通过荧光显微镜观察发现,set-18基因缺失不影响HSP-6和HSP-60的表达水平。在通过RNAi抑制细胞色素C氧化酶cco-1而诱发UPRmt的情况下,野生型线虫N2和set-18（gk334）突变体线虫中HSP-6和HSP-60的表达水平仍然接近。由此说明,SET-18不参与UPRmt过程的调控。HSP-4是应答UPRER的主要标记基因。我们通过杂交技术和基因型鉴定,首先成功构建了带有hsp-4::GFP的set-18（gk334）突变体线虫,然后我们分别对带有该GFP标签的野生型N2和set-18（gk334）突变体线虫进行热激和衣霉素（tunicamycin,TM）处理以激活UPRER。我们发现,day 1时期（成虫第一天）的N2线虫在热激和TM处理后,HSP-4的表达水平明显提高。但是day 1时期的set-18（gk334）突变体线虫中,热激和TM处理和未处理,HSP-4的表达水平没有明显变化。这说明,set-18基因缺失影响了UPRER应答的过程。另外,我们又检测了线虫衰老进程,即从成虫第三天到第11天,set-18（gk334）突变体线虫应答UPRER的情况。我们发现,随着衰老进程,野生型N2线虫应答由TM诱导的UPRER的能力逐渐减弱。但对于不同衰老程度（day 1、day 3、day7、day 11）的set-18（gk334）突变体线虫,TM处理都不能激活HSP-4的表达。这说明SET-18对UPRER的调控并不随着衰老进程而发生变化。另外,我们在set-18（gk334）突变体线虫针对SET-18的靶基因daf-16进行RNAi处理,发现daf-16RNAi并不影响set-18基因缺失对UPRER应答的影响。以上研究表明,组蛋白H3K36me2甲基转移酶SET-18,参与UPRER调控过程,但不参与UPRmt调控。另外,SET-18对UPRER的调控不随着衰老而发生改变,且不依赖DAF-16的活性。该研究为进一步探讨组蛋白H3K36me2修饰促进衰老的细胞学机制奠定了一定的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 研究背景
•   一、未折叠蛋白压力应答（UPR）
• mt)'>    （一）线粒体未折叠蛋白压力应答(UPR^mt)
• ER)'>    （二）内质网未折叠蛋白压力应答(UPR^ER)
•   二、生物体衰老的调控
•     （一）衰老的标志
•     （二）秀丽线虫是研究衰老的经典的模式生物之一
•     （三）调控衰老的Insulin/IGF-1（IIS）信号通路
•     （四）转录因子FOXO/DAF-16 对衰老的调控
•   三、UPR与衰老的关系
• mt与衰老的关系'>    （一）UPR^mt与衰老的关系
• ER与衰老的关系'>    （二）UPR^ER与衰老的关系
•   四、组蛋白H3K36me2 转移酶SET-18 对衰老的调控
•     （一）组蛋白甲基化修饰
•     （二）组蛋白赖氨酸甲基化修饰与衰老调控
•     （三）SET-18 与衰老调控
•   五、研究内容
•     （一）立题依据
•     （二）研究内容
• 第二部分 实验材料与方法
•   一、实验材料
•     （一）秀丽线虫品系
•     （二）细菌菌株
•     （三）试剂
•     （四）主要仪器
•   二、实验方法
•     （一）配制实验中母液及试剂
•     （二）线虫的培养方法
•     （三）线虫基因组DNA提取及PCR扩增方法
•     （四）秀丽线虫突变体的杂交实验
•     （五）提取线虫RNA及 RT-PCR
•     （六）线虫RNAi的处理
•     （七）检测hsp-4::GFP荧光的方法
•     （八）检测hsp-6::GFP和 hsp-60::GFP荧光的方法
• 第三部分 实验结果与分析
• mt的调控'>  一、SET-18 不参与UPR^mt的调控
• ER过程'>  二、SET-18 调控UPR^ER过程
• ER的调控不随着衰老进程而改变'>  三、SET-18对UPR^ER的调控不随着衰老进程而改变
• ER的调控过程不依赖DAF-16 的活性'>  四、SET-18对UPR^ER的调控过程不依赖DAF-16 的活性
• 第四部分 讨论
•   一、SET-18 与线粒体功能
• ER'>  二、SET-18与UPR^ER
• 主要结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张永俊

导师: 李晓雪

关键词: 衰老

来源: 东北师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 东北师范大学

分类号: Q75

总页数: 50

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