猪源沙门菌质粒介导的广谱头孢菌素和黏菌素耐药性研究

论文摘要

沙门菌是一种重要的人畜共患性和食源性病原菌,对动物健康和人类健康可造成严重的威胁。广谱头孢菌素、尤其是第三代头孢菌素是治疗沙门菌感染的首选药物之一,而多黏菌素被认为是治疗革兰氏阴性菌严重感染的“最后一道防线”。近年来,国内外研究表明,沙门菌对这两类抗菌药物耐药性的问题日益严重。质粒是一种能够进行独立复制、可移动的遗传因子,可携带介导头孢菌素类药物和黏菌素耐药的基因,并介导耐药基因在不同细菌之间的水平转移。因此,加强沙门菌对这两类药物产生耐药性的机制、尤其是质粒介导的耐药机制的研究,具有重要的理论和应用意义。本研究拟从实验室分离鉴定的多重耐药猪源沙门菌中,筛选出头孢噻肟耐药的菌株,并针对其开展质粒介导的广谱头孢菌素和黏菌素耐药机制研究。主要结果如下:1.头孢噻肟耐药沙门菌的筛选及其药物敏感性评价采用含4μg/mL头孢噻肟的MHA平板对110株多重耐药猪源沙门菌进行筛选,发现有16株对头孢噻肟表现耐药。通过微量肉汤稀释法检测16株沙门菌对头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、美罗培南、黏菌素的最小抑菌浓度（MIC）,结果显示头孢噻肟MIC值均大于128μg/mL。16株菌对美罗培南均敏感,11株菌对头孢吡肟耐药,10株菌对氨曲南耐药,10株菌对黏菌素耐药,只有2株菌对头孢他啶耐药。当头孢噻肟、头孢吡肟、头孢他啶分别与克拉维酸联合使用时,16株菌均表现为敏感,提示这些沙门菌均为产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的菌株。2.沙门菌质粒的提取和分型对16株沙门菌进行质粒提取,发现12株沙门菌可检测到质粒条带,其中10株为黏菌素耐药菌株。质粒条带数为2-6条,条带大小介于1.39-19.56 kb之间,且10株黏菌素耐药菌株均存在一条大小为19.56 kb的条带。对质粒复制子类型的检测发现,15株菌检测到Inc N型复制子,13株菌检测到Inc HI2型复制子,1株菌检测到Inc I1型复制子。3.质粒介导的广谱头孢菌素耐药机制研究采用PCR对16株沙门菌进行6种ESBLs耐药基因检测,结果表明所有菌株均能检出CTX-M基因,但SHV、CMY-2、PER、IMP、KPC基因均未检出。进一步对CTX-M基因进行分型,14株菌为CTX-M-9组的CTX-M-14型,2株为CTX-M-1组的CTX-M-15型。以16株沙门菌为供体菌、大肠杆菌NK5449为受体菌,通过肉汤法进行接合转移试验,采用头孢噻肟-利福平双药平板进行接合子的筛选,结果表明只有10株具有黏菌素抗性的菌株能够通过接合转移将CTX-M基因转移到受体菌。4.质粒介导的黏菌素耐药机制研究PCR检测结果表明,10株黏菌素耐药沙门菌均携带mcr-1基因,而6株黏菌素敏感菌株均不携带mcr-1基因。以16株猪源沙门菌为供体菌,以具有利福平抗性的大肠杆菌NK5449为受体菌,通过肉汤法进行接合转移试验,采用黏菌素-利福平双药平板进行接合子的筛选,结果表明只有10株黏菌素耐药菌株可发生接合转移,转移频率介于2.00×10-6至7.21×10-5之间。从黏菌素耐药菌FA56株中扩增全长mcr-1基因,通过双酶切连接至载体pHSG396上,将重组载体转化至DH5α感受态细胞,结果重组菌具有黏菌素抗性,表明在本研究中mcr-1基因是沙门菌黏菌素耐药的主要因素。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表（Abbreviation）
• 1.前言
•   1.1 沙门菌的公共卫生学意义
•     1.1.1 食源性疾病的负担
•     1.1.2 沙门菌在食源性疾病中的地位
•   1.2 沙门菌及其多重耐药性
•     1.2.1 细菌的耐药性负担及耐药机制
•     1.2.2 沙门菌多重耐药情况
•   1.3 质粒介导的耐药性及其分型
•     1.3.1 质粒介导的耐药性及其电泳图谱
•     1.3.2 质粒的复制子类型
•   1.4 广谱头孢菌素和超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）
•     1.4.1 头孢菌素的研究进展及其耐药性
•     1.4.2 超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的分类
•   1.5 多黏菌素和mcr-1 基因
•     1.5.1 多黏菌素的分类和应用
•     1.5.2 mcr-1 基因的发现和流行
•   1.6 研究目的与意义
• 2.材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 菌株和载体
•     2.1.2 所用培养基及试剂
•     2.1.3 主要仪器和设备
•     2.1.4 培养基、抗生素及相关溶液的配制
•   2.2 方法
•     2.2.1 沙门菌的复苏与鉴定
•     2.2.2 头孢噻肟耐药沙门菌的筛选
•     2.2.3 沙门菌药物敏感性的测定
•     2.2.4 质粒的提取和分型
•     2.2.5 沙门菌ESBLs基因的检测
•     2.2.6 ESBLs基因的接合转移试验
•     2.2.7 沙门菌mcr-1 基因的检测
•     2.2.8 mcr-1 基因的接合转移试验
•     2.2.9 接合转移频率的计算
•     2.2.10 接合子的药物敏感性试验
•     2.2.11 接合子质粒的琼脂糖凝胶电泳
•     2.2.12 重组载体的构建和鉴定
•     2.2.13 重组菌黏菌素的药物敏感性试验
• 3.结果与分析
•   3.1 多重耐药沙门菌的鉴定与耐药情况
•   3.2 头孢噻肟耐药沙门菌的筛选
•   3.3 耐药菌最小抑菌浓度（MIC）的测定
•   3.4 质粒的电泳图谱和复制子类型
•     3.4.1 质粒的电泳图谱
•     3.4.2 质粒的复制子类型
•   3.5 沙门菌ESBLs基因的检测
•   3.6 CTX-M耐药基因的分型和测序
•     3.6.1 CTX-M基因分组的PCR检测
•     3.6.2 CTX-M基因亚型的测序比对
•   3.7 ESBLs基因的接合转移
•     3.7.1 ESBLs接合子的筛选
•     3.7.2 ESBLs接合子的PCR验证
•   3.8 mcr-1 基因的检测
•   3.9 mcr-1 基因的接合转移
•     3.9.1 mcr-1 接合子的筛选
•     3.9.2 mcr-1 接合子的PCR验证
•   3.10 mcr-1 接合子的药物敏感性试验
•   3.11 mcr-1 接合子转移频率的计算
•   3.12 mcr-1 接合子质粒的提取
•   3.13 重组质粒的构建和鉴定
•     3.13.1 目的基因的扩增
•     3.13.2 重组质粒的鉴定
•     3.13.3 重组质粒的双酶切
•     3.13.4 重组菌的药物敏感性试验
• 4.讨论
•   4.1 多重耐药猪源沙门菌的公共卫生学意义
•   4.2 沙门菌的耐药表型和耐药基因型
•   4.3 耐药基因的转移性分析
•   4.4 质粒的电泳图谱和不相容群类型
•   4.5 后期研究展望
• 5.结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 鲁杨超

导师: 毕丁仁

关键词: 沙门菌,质粒,耐药性,广谱头孢菌素,黏菌素

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 华中农业大学

分类号: S852.61

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000358

总页数: 79

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