酿酒酵母产麦角固醇的调控及固醇类衍生物的活性研究

论文摘要

麦角固醇是真菌中的主要甾醇,作为重要的医药化工原料,可用于转化维生素D2和生产甾醇类药物。酿酒酵母中麦角固醇生物合成是一个复杂的过程,其转录调节机制仍不清楚。因此阐明转录调节对麦角固醇合成的影响具有重要意义。本课题以酿酒酵母为研究对象,通过构建转录因子Ecm22工程菌,探究了 Ecm22过表达与截短的Ecm22对酿酒酵母生长以及麦角固醇合成的影响,研究了麦角固醇衍生物的抑菌活性。1、通过Ecm22过表达基因工程菌的转录组分析,初步确定了转录因子Ecm22对麦角固醇合成基因ERG表达的影响。结果显示,过表达Ecm22导致麦角固醇合成途径中绝大多数ERG基因表达水平上调,除ERG4、ERG9、ERG28 之外。2、探究了 Ecm22过表达与截短Ecm22对酿酒酵母的生长以及麦角固醇产量的影响。琼脂侵入性试验结果表明,Ecm22过表达工程菌侵入性生长较对照组效果显著。氟康唑耐受性试验结果表明,过表达Ecm22的菌株可以在16 μg/mL(氟康唑)下生长,而对照组则不能生长。摇瓶发酵结果表明,Ecm22过表达工程菌的麦角甾醇产量最高达到17.35 mg/g,比对照组增加了 32%。在截短的Ecm22中,只有1440 bp的DNA片段对酿酒酵母生长及麦角甾醇含量的影响与全长基因相同,其它片段对酿酒酵母生长及麦角甾醇含量的作用均弱于全长基因。3、优化了酿酒酵母产麦角固醇的培养条件。通过正交试验确定了最优培养条件为:蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L、葡萄糖80 g/L、(NH4)2S046 g/L、MgS04 1.0 g/L、KH2P04 1.5 g/L、FeSO40.1 g/L。在 5 L 发酵罐中,基因工程菌的麦角甾醇产量最高达到32mg/g(DCW),与对照相比增加了约20%。4、研究确定了麦角固醇衍生物的抑菌活性。通过麦角固醇与醇反应生成固醇衍生物(ED),TLC结果表明,4种衍生物ED1、ED2、ED3、ED4均是成分复杂的混合物。它们对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌均有较强的抑制效果,尤其ED1对铜绿假单胞菌抑制效果最显著,最低抑制浓度达到8 μg/mL。但ED对大肠杆菌、酵母、根霉、黑曲霉等均无抑制作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 酿酒酵母的研究概况
•   1.2 酵母麦角固醇的合成
•     1.2.1 麦角固醇的性质
•     1.2.2 麦角固醇的生理功能
•     1.2.3 麦角固醇的用途
•     1.2.4 麦角固醇的合成机理
•   1.3 酵母麦角固醇合成代谢的调控
•     1.3.1 转录因子概述
•     1.3.2 酵母麦角固醇转录因子的调控
•     1.3.3 其他因素的调控
•   1.4 小结
•     1.4.1 本课题的研究思路
•     1.4.2 本课题研究的内容及意义
• 第二章 转录因子过表达基因工程菌的构建
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 实验菌种
•     2.2.2 培养基
•   2.3 实验方法
• PGK-ECM22-T_CYC表达载体构建'>    2.3.1 YEplac112-P_PGK-ECM22-T_CYC表达载体构建
•       2.3.1.1 提取酵母基因组
•       2.3.1.2 Ecm22基因的克隆
•       2.3.1.3 Ecm22基因的连接
•       2.3.1.4 重组质粒的转化
•       2.3.1.5 阳性重组子的筛选
•     2.3.2 截短的Ecm22过表达载体的构建
•     2.3.3 酵母基因工程菌的构建
•       2.3.3.1 制备酵母感受态细胞
•       2.3.3.2 化转与筛选
•     2.3.4 转录组分析样品制备
•   2.4 结果及分析
• PGK-ECM22-T_CYC表达载体构建'>    2.4.1 YEplac112-P_PGK-ECM22-T_CYC表达载体构建
•     2.4.2 截短的Ecm22过表达载体的构建
•     2.4.3 转录因子Ecm22对酿酒酵母麦角固醇合成中ERG基因表达的影响
•   2.5 小结
• 第三章 Ecm22在麦角固醇合成中的调控作用
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 实验菌种
•     3.2.2 培养基
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 菌株的活化
•     3.3.2 琼脂侵袭试验
•     3.3.3 真菌剂耐受性试验
•     3.3.4 基因工程菌的发酵
•     3.3.5 菌体的收集
•     3.3.6 麦角固醇的测定
•   3.4 结论及分析
•     3.4.1 基因工程菌的琼脂侵袭性生长
•     3.4.2 基因工程菌对抗真菌剂的耐受性
•     3.4.3 基因工程菌的摇瓶发酵
•     3.4.4 无机盐对酵母产麦角固醇产量的影响
•       3.4.4.1 无机磷对麦角固醇产量的影响
•       3.4.4.2 铁离子对麦角固醇产量的影响
•       3.4.4.3 镁离子对麦角固醇产量的影响
•       3.4.4.4 铜离子对麦角固醇产量的影响
•     3.4.5 正交试验
•       3.4.5.1 正交试验的设计
•       3.4.5.2 正交试验结果及分析
•       3.4.5.3 正交试验最优条件验证
•     3.4.6 优化后的摇瓶发酵
•     3.4.7 5 L发酵罐放大培养
•   3.5 小结
• 第四章 麦角固醇衍生物的抑菌活性
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料
•     4.2.1 实验菌种
•     4.2.2 培养基
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 麦角固醇衍生物的制备
•     4.3.2 薄层色谱分析
•       4.3.2.1 活化硅胶板
•       4.3.2.2 选择展开剂
•       4.3.2.3 薄层色谱分析
•     4.3.3 麦角固醇衍生物抑菌性研究
•       4.3.3.1 受试菌株的活化
•       4.3.3.2 菌悬液的制备
•       4.3.3.3 麦角固醇衍生物抑菌效果测定
•       4.3.3.4 麦角固醇衍生物最低抑菌浓度MIC的测定
•   4.4 实验结果及分析
•     4.4.1 麦角固醇衍生物的TLC分析
•     4.4.2 麦角固醇衍生物ED1的抑制效果
•     4.4.3 麦角固醇衍生物ED2的抑制效果
•     4.4.4 麦角固醇衍生物ED3的抑制效果
•     4.4.5 麦角固醇衍生物ED4的抑制效果
•     4.4.6 麦角固醇衍生物最低抑菌浓度的测定
•   4.5 小结
• 第五章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 问题与展望
• 参考文献
• 附录一 本实验所使用实验材料
• 附录二 本实验所使用实验仪器
• 致谢
• 研究成果及发表的学术论文
• 作者及导师简介
• 附件

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王圣谦

导师: 刘军锋,余军阳

关键词: 酿酒酵母,麦角固醇,转录因子,发酵,抑菌活性

来源: 北京化工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 北京化工大学

分类号: Q935

DOI: 10.26939/d.cnki.gbhgu.2019.000101

总页数: 83

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