分子动力学模拟研究腺苷酸激酶催化循环及PLA1脂肪酶底物识别机制

论文摘要

蛋白质的结构与功能之间有着密不可分的联系,其结构的变化直接影响其功能的改变。对酶与底物结合过程中的构象变化的研究可以解释酶的底物选择性、酶学性质变化,本论文通过生物信息学方法对腺苷酸激酶（AdK）催化循环过程及分子机制进行研究,同时用生物信息学方法结合19F NMR实验技术对Lecitase（?）Ultra脂肪酶（PLA1脂肪酶）与其相应底物结合过程中的构象变化及分子机制进行研究,从分子水平上揭示这两种酶的催化机理及其底物选择性,以期为酶蛋白的进一步改造提供理论数据。本论文工作主要包括以下两个部分:1.腺苷酸激酶的催化循环过程的研究:腺苷酸激酶是一种单体的磷酸转移酶,它通过催化生物体细胞内ATP末端磷酸根基团转移给AMP,生成两分子ADP的生物过程,以实现能量传递的重要生物学功能。大量研究表明,AdK在催化过程中会发生明显的构象变化,与其底物形成不同的复合物状态,但其在催化过程中的分子机理尚不明确。本论文中,我们利用传统分子动力学模拟、增强采样模拟以及并联级联选择分子动力学模拟,对来源于大肠杆菌的AdK蛋白在催化过程中可能存在的不同构象状态进行模拟研究,并根据模拟结果提出了一种AdK蛋白催化循环路径,分析了底物进入和释放的先后顺序,发现不结合底物的AdK蛋白倾向于保持打开构象,ATP-Mg先进入其结合口袋,随后AMP进入,AdK转变为闭合构象,催化反应结束后,ADP·Mg先释放,随后ADP释放,完成催化反应过程。本文工作通过对此过程中底物与蛋白之间的接触和距离分析揭示了静电相互作用是控制底物进入和释放的先后顺序中的重要作用。2.PLAi脂肪酶C末端对其酶学性质及底物选择性的作用研究:PLA1脂肪酶是将来源于尖孢镰刀霉（Fusarium oxysporum）的磷脂酶（FOL）基因和来源于棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）的脂肪酶（TLL）基因进行基因重组而成,它同时具有磷脂酶和脂肪酶两种酶活性,研究表明C末端的引入对PLA1脂肪酶的磷脂酶活性有重要影响,但其潜在分子机理尚不明确。本论文从同源建模得到的PLA1三维结构出发,利用分子对接和传统分子动力学模拟的方法对其与不同底物结合的相互作用模式进行分析,并与TLL脂肪酶进行对比,揭示了 PLA1保持脂肪酶高酶活的同时增加了对磷脂底物的选择性的分子机制,并分析了 C末端在结合底物过程中发生的构象变化,进一步用19FNMR实验验证了 C末端在结合磷脂底物过程中的构象变化,在一定程度上揭示C末端对磷脂底物选择性作用的分子机理,为后续实验提供依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 腺苷酸激酶催化循环过程研究
•   1.1 绪论
•     1.1.1 腺苷酸激酶简介
•     1.1.2 分子动力学模拟
•     1.1.3 本课题研究内容及意义
•   1.2 材料与方法
•     1.2.1 模拟体系选择
•     1.2.2 体系初始结构的建立
•     1.2.3 传统分子动力学模拟
•     1.2.4 ACM增强采样模拟
•     1.2.5 PaCS-MD
•     1.2.6 模拟轨迹分析
•   1.3 结果与讨论
•     1.3.1 不结合底物的AKeco优势构象
•     1.3.2 AMP与ATP·Mg进入结合位点的先后顺序
•     1.3.3 ADP与ADP·Mg离开结合位点的先后顺序
•     1.3.4 底物进入和释放先后顺序的机制
•     1.3.5 MD模拟结果的重复性
•     1.3.6 PaCS-MD结果分析
•     1.3.7 AdK催化循环路径
•   1.4 本章小结与展望
• 1脂肪酶C末端对其酶学性质和底物选择性研究'>第2章 PLA₁脂肪酶C末端对其酶学性质和底物选择性研究
•   2.1 绪论
•     2.1.1 脂肪酶简介
• 1脂肪酶简介'>    2.1.2 PLA₁脂肪酶简介
•     2.1.3 分子对接简介
• 19F NMR方法介绍'>    2.1.4¹⁹F NMR方法介绍
•     2.1.5 本课题研究内容与意义
•   2.2 材料与方法
• 1脂肪酶与TLL结合PC磷脂底物'>    2.2.1 PIA₁脂肪酶与TLL结合PC磷脂底物
• 1脂肪酶与TLL结合TAG、DAG'>    2.2.2 PLA₁脂肪酶与TLL结合TAG、DAG
• 1脂肪酶结合不同底物分子动力学模拟'>    2.2.3 PLA₁脂肪酶结合不同底物分子动力学模拟
• 1脂肪酶结合PC磷脂的分子动力学模拟'>    2.2.4 PLA₁脂肪酶结合PC磷脂的分子动力学模拟
• 1突变体构建'>    2.2.5 PLA₁突变体构建
• 1突变体表达和纯化'>    2.2.6 PLA₁突变体表达和纯化
•     2.2.7 酶活检测
• 1突变体¹⁹F标记'>    2.2.8 PLA₁突变体¹⁹F标记
• 19F NMR光谱采集'>    2.2.9¹⁹F NMR光谱采集
•   2.3 结果与讨论
• 1脂肪酶与TLL结合磷脂底物的分子对接分析'>    2.3.1 PLA₁脂肪酶与TLL结合磷脂底物的分子对接分析
• 1脂肪酶的脂肪酶活性分析'>    2.3.2 PLA₁脂肪酶的脂肪酶活性分析
• 1脂肪酶C末端对底物选择性的影响'>    2.3.3 PLA₁脂肪酶C末端对底物选择性的影响
• 1脂肪酶C末端在与磷脂结合过程中构象变化'>    2.3.4 PLA₁脂肪酶C末端在与磷脂结合过程中构象变化
• 19F NMR实验研究PLA₁的构象变化'>    2.3.5¹⁹F NMR实验研究PLA₁的构象变化
•   2.4 本章小结与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 叶纯

导师: 王俊峰,张志勇

关键词: 腺苷酸激酶,脂肪酶,分子对接,分子动力学模拟,核磁共振

来源: 中国科学技术大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 中国科学技术大学

分类号: Q55

总页数: 121

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