一、基因枪法介导的魔芋遗传转化研究（论文文献综述）
李庆华[1]（2021）在《裸燕麦转基因体系的建立与优化》文中认为本试验以8个裸燕麦品种的成熟胚为外植体,通过对愈伤组织培养中不同品种、培养基、激素种类及浓度配比之间的研究,探究裸燕麦成熟胚脱分化、再分化过程中的影响因素,并从中筛选出再生频率高的品种;采用农杆菌介导的创伤胚转化,通过对培养基中抗生素浓度、农杆菌侵染浓度以及移栽时间进行研究,获得创伤胚培养的最佳条件,并建立创伤胚快速遗传转化体系。结果如下:1.品种与培养基存在互作关系,不同品种的裸燕麦成熟胚在同种培养基上出愈率不同,在不同的培养基上相同品种的出愈率也存在较大差异。“坝莜1号”在MS培养基上进行愈伤组织诱导最为适宜,出愈率为87.33%,植株再生率为32.99%,可用于裸燕麦再生体系的建立和进一步的遗传转化。2.适合裸燕麦“坝莜1号”愈伤组织培养的最佳培养基为:愈伤组织诱导培养基MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IAA+500 mg/L水解酪蛋白（CH）+25 g/L蔗糖;愈伤组织继代培养基:MS+1.5 m g/L 2,4-D+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖;愈伤组织绿芽分化培养基:MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IAA;愈伤组织生根培养基:1/2 MS+0.5 mg/L NAA+0.1%生根粉。3.以“坝莜1号”为材料,农杆菌转化创伤胚过程中抑菌剂氨苄青霉素在培养基中添加的最适浓度为200 mg/L,选择剂卡那霉素的最适浓度为40 mg/L。4.使用不同浓度的农杆菌侵染“坝莜1号”创伤胚,最适浓度的OD600为0.8。5.创伤胚在培养基中培养不同的时间影响成活率。转化后在培养基内培养10天移栽为最佳。6.将质粒pBI121-GFP转化“坝莜1号”创伤胚,经筛选培养后获得126株再生转化植株,对再生转化植株进行PCR检测,获得4株阳性植株,裸燕麦创伤胚的转化率为3.17%。
胡懋[2]（2021）在《根癌农杆菌介导黑曲霉外源基因表达系统的建立及优化》文中研究指明黑曲霉（Aspergillus niger）作为一类重要的发酵工业菌种,内含多种性能优良的酶系,可用于生产糖化酶、纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶等数十种酶制剂。此外,由于黑曲霉拥有大肠杆菌表达系统所不具备的优越性,是真核活性蛋白的优良载体。因此,黑曲霉在饲料工业、食品工业、医药等领域有极大的应用价值。但是,传统遗传转化方法对黑曲霉的转化效率和遗传稳定性不高,极大限制了丝状真菌表达系统的开发。本研究借助根癌农杆菌介导转化法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT）建立了黑曲霉的遗传转化体系。以黑曲霉CICC2629为宿主菌,优化转化条件提升了转化效率,成功赋予宿主菌潮霉素抗性。此外,以增强型绿色荧光蛋白基因（Enhanced green fluorescent protein gene,e GFP）为标记基因,在黑曲霉中研究了不同启动子对目的基因表达水平的影响,进而筛选出最适用于本宿主菌表达外源基因的启动子。我们利用葡聚糖酶基因在黑曲霉中进行验证,并进行酶学性质测定。初步探究了真核序列Kozak sequence（GCCACC）对黑曲霉蛋白翻译水平的影响。最后,对黑曲霉发酵条件进行了优化。研究结果如下:1.通过对8株黑曲霉的生长特性及其潮霉素敏感度分析,最终选定CICC2629做为本研究宿主菌,并用ATMT技术成功将潮霉素磷酸转移酶基因（Hygromycin B phosphotransferase gene,hph）整合到宿主菌基因组中。优化后ATMT转化条件为:选用农杆菌AGL-1,AS浓度为200μmol/L,黑曲霉孢子浓度5.0×106个/m L-1.0×107个/m L,以玻璃纸为共培养基质,22℃避光正置共培养48 h后转膜,最高可以获得75±5个转化子,最高阳性率达到93.9%,平均保持在89.92%以上,较优化前转化效率提升了2.03倍,连续传代5次仍然能检测到hph基因,遗传稳定性良好。2.选择三个启动子gpd A、gla A和Tox A分别驱动e GFP基因在黑曲霉中的表达。通过对荧光强度和像素值分析,检测出三种启动子启动外源基因表达能力为:gpd A>gla A>Tox A。同时通过q PCR检测e GFP基因的相对表达量,启动子gpd A启动基因表达能力分别是gla A和Tox A的3.26倍和4.82倍。3.以启动子gpd A和gla A介导了葡聚糖酶基因（An-pi Glu）基因在黑曲霉中的表达,最终测定该酶的酶活为74.43 U/m L,最适温度为60℃,最适p H值为6.5,在37℃和50℃耐受60 min分别能保持63.1%和49.4%以上的相对酶活,60℃和65℃的半衰期分别为15 min和7 min;在p H值3.0–11.0的缓冲液中处理60 min仍能保持66.1%以上的相对酶活。β-巯基乙醇、DTT、丙三醇对此酶的激活作用最强,依次是未处理的1.94倍、1.91倍和1.79倍,Li+、Tween80、Triton X100、乙酸、乙醇、甲醇、PEG4000、乙酸乙酯、尿素同样对此酶有激活作用。Ag+和Hg2+对此酶有强烈抑制作用。An-pi Glu基因表达量结果:gla A+Kozak-An-pi Glu基因表达量较未添加Kozak序列组上调了1.71倍,gpd A+Kozak组上调了1.50倍,表明Kozak序列能增强黑曲霉基因表达水平。4.优化了黑曲霉发酵条件,蛋白表达水平较初始发酵提升了5.05倍。优化发酵条件:发酵温度为30℃,时间为168 h,按3%接种浓度为1.0×107/m L的新鲜孢子悬浮液。最佳发酵培养基基于原始配方,碳源可选择微晶纤维素、维生素C、木聚糖,选择黄豆饼粉作为氮源,蛋白表达水平均明显提高。综上所述,以上研究结果有助于建立稳定高效的丝状真菌表达体系,为丝状真菌遗传转化、蛋白表达、发酵工艺方面的研究提供参考。
梁璧[3]（2020）在《山核桃赤霉素相关基因CcKO的克隆及功能分析》文中提出内根-贝壳杉烯氧化酶（ent-kaurene oxidase,KO）是赤霉素（GAs）生物合成途径关键酶,也是植物GAs抑制剂多效唑的靶酶,若GAs生物合成途径在KO基因位点发生阻断,则会影响植株的正常生长。本研究以山核桃（Carya cathayensis）体细胞胚为实验材料,采用同源重组及PCR扩增技术,克隆获得山核桃KO基因及启动子序列,并进一步构建了35S::CcKO::GFP过表达载体和CcKOpro::GUS启动子表达载体;之后利用BLAST在线工具对该基因的氨基酸序列进行同源性分析及生物信息学分析;然后利用农杆菌介导法将过表达载体及启动子表达载体转入核桃体细胞胚并进行植株再生,从而获得阳性再生植株,并深入解析山核桃KO的生物学功能,旨在利用生物技术手段从基因水平调控山核桃的生长发育,为山核桃矮化/半矮化新种质的分子辅助育种提供理论依据。本研究主要结果如下:1.山核桃CcKO基因的克隆:通过克隆获得一条山核桃CcKO开放阅读框,其全长为1563 bp,共编码520个氨基酸,相对分子量为59.076 kD。氨基酸同源性分析表明,山核桃CcKO含有细胞色素P450核心功能域FXXGXRXCXG和氨基端的跨膜结构域。BLAST结果表明,山核桃CcKO氨基酸序列与核桃JrKO氨基酸序列同源性为96%,与银白杨、梨、苹果、板栗的氨基酸同源性分别为74%、71%、72%、77%。2.山核桃KO基因及启动子遗传转化体系的构建:（1）对核桃成熟体胚进行不同脱水时间处理,发现随着脱水时间延长,萌发率呈现先升后降的趋势,并在脱水8 d后,体胚的萌发率最高,达到78.33%;qPCR检测结果表明,随着脱水时间的延长,核桃脱水素基因Jr DHN的表达量逐渐升高,复水后该基因的表达量迅速下降。不同抗生素种类和浓度对农杆菌介导的遗传转化结果表明:300 mg/L的羧卞青霉素能够有效抑制农杆菌的生长,并促进体胚增殖。（2）山核桃KO基因及启动子的遗传转化:启动子表达经GUS染色和PCR验证表明,CcKOpro::GUS启动子表达载体成功转入核桃体细胞胚中,且E1代体胚GUS阳性率为30%,E2代体胚GUS阳性率为50%,E3代体胚GUS阳性率为70%,将获得的阳性体胚培养成植株,鉴定再生植株的阳性率为75%;过量表达经荧光检测显示及PCR验证表明,35S::CcKO::GFP过表达载体被成功转入核桃体细胞胚中,体视荧光显微镜下可以观察到体胚的发育经历了球形胚、心形胚、鱼雷胚以及子叶胚阶段,且E1代GFP阳性率为46%;E2代GFP阳性率为65%;E3代GFP阳性率为83%,将获得的阳性体胚培养成植株,鉴定再生植株的阳性率为62.5%。3.山核桃CcKO基因的表达及生物学功能分析:qPCR结果表明,山核桃CcKO基因表达具有组织特异性,其中茎中表达量显着高于其它组织部位;表型及相关分析结果显示,山核桃CcKO基因过表达再生植株株高显着高于对照,说明该基因表达量与植株株高呈正相关;过量表达可使核桃阳性再生植株GAs合成通路下游GA20ox表达量升高而GA2ox表达量下降。启动子GUS定位及相关分析显示该基因主要定位于维管束中,通过结合MYB转录因子调控组织代谢和细胞生长,进而调控植物的生长发育。本研究结果为进一步分析KO基因在胡桃科植物生长发育过程中的作用提供了理论基础,也为胡桃科植物中研究GAs合成的其他关键酶提供技术参考。
钟琳[4]（2017）在《魔芋转基因体系的研究以及中性神经酰胺酶基因的克隆》文中进行了进一步梳理魔芋系天南星科（Araceae）,魔芋属（Amorphophallus）植物的总称,它是一种多年生草本植物。在中国,魔芋资源丰富,具有悠久的栽培历史,在21个魔芋种中有11个种可以食用,其中6个种已有栽培。因其块茎中含有大量的葡苷聚糖（glucomanna）和生物碱等物质而在食品、医药、化工中具有广泛应用,具有较高开发利用价值。有关魔芋组织培养的研究在上个世纪80年代就早有报道,但因魔芋为单叶柄支撑的单复叶植物通常用地下根状茎无性繁殖,其繁殖系数非常低再加上种芋根茎细嫩不能长距离运输,使得魔芋繁殖一直阻碍着其的大面积发展,优良品种推广速度慢。目前,关于魔芋的生物学特性研究以及其块茎中富含的葡甘聚糖的提取加工研究较多,但对魔芋块茎中他有效成分（如神经酰胺）及其代谢途径研究甚少。本研究不仅对魔芋组织培养中不同类型的愈伤组织进行了研究,还利用高通量测序（RNA-seq）技术对魔芋进行转录组测序,并将其数据进行分析,获得蛋白质功能注释、GO功能分析、KEGG代谢途径等数据。在此基础上筛选到了神经酰胺代谢途径上的关键基因-中性神经酰胺酶基因（NCase）,对其进行了克隆以及初步功能验证。研究结果如下:利用白魔芋（A.albus）的雌蕊花序以及雄蕊为外植体,得到了5种不同类型的愈伤组织,对比了胚性愈伤非胚性愈伤组织之间的差别,并对魔芋胚性愈伤组织的发育过程进行了组织切片观察,从中找到了胚性愈伤组织具有发育各个时期典型特点的组织结构。此外本研究还探讨了最佳的外植体愈伤组织诱导培养基,分化培养基的激素种类及配比以及其pH值;培养的光照、温度等。优化组合得到白魔芋愈伤组织最佳诱导培养基:MS+1 mg/L NAA+2 mg/L 2,4-D+3 mg/L 6-BA,30g/L蔗糖,2g/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP）,白愈伤组织最适合的分化培养基为:MS+1 mg/L NAA+1 mg/L GA3+2 mg/L 6-BA,30g/L 蔗糖,2g/L PVP。白魔芋愈伤组织的诱导率最高可达到98.9%,分化率达到83.7%。农杆菌介导的白魔芋转基因。在前面建立的胚性愈伤组织的快繁体系的基础上,通过预培养、共培养筛选得到阳性愈伤组织,以Plasmid pCAMBIA1300为表达载体,将抗虫基因Cry2A基因转入到魔芋胚性愈伤组织中。提取再生植株叶片基因组并对其进行PCR检测,初步证明外源基因已转入到再生植株中,在实验得到的6株再生植株中有两株再生植株基因组中能检测到Cry2A外源基因的成功转入。利用Illumina HiSeq 2500高通量测序对弥勒魔芋（Amorphophallus muelleri）转录组进行了分析,获得弥勒魔芋15,867,314原始读序,数据量4.76G。除去含有带接头的、低质量的原始读序,对原始数据过滤,得到15132167个读序,数据量为4.54G。通过高级分析,给出所有all-unigene在样品中的表达量信息和功能注释信息,功能注释信息包括KOG功能注释和GO功能注释、Pathway注释,揭示了弥勒魔芋叶片中基因的表达状况。从转录组数据中我们分析得到弥勒魔芋经酰胺的代谢途径及代谢途径中相关的13个酶。我们选择了起到中枢调节作用的中性神经酰胺酶（neutral ceramidase）作为研究对象。首先我们通过RACE的方法,克隆得到了弥勒魔芋中性神经酰胺酶（NCase）的基因序列,为了进一步验证NCase的功能,我们将其转入到人工进行基因敲除的酵母,人工敲除酿酒酵母中神经酰胺酶基因YPC1p和YDC1p,排除酵母本身的干扰后,将得到的魔芋中性神经酰胺酶基因转入双缺型酵母中,通过Western blot检测到不同时期神经酰胺酶表达量的不同。以C12-NBD神经酰胺将作为底物,在体外一定条件下反应,通过高效液相色谱仪（HPLC）的检测,我们发现魔芋NCase能够分解Cl 2-NBD神经酰胺。本研究首次探索了弥勒魔芋神经酰胺酶与各种干扰素通路中相关基因的相互作用,发现魔芋中性神经酰胺酶能促进IFNα IFNβ,ISRE以及IL29的表达,NCase能够直接引起相关干扰素的基因的上调,而干扰素刺激会引起下游干扰素诱导基因（IFN stimulated genes,ISGs）表达变化,从而起到抗病毒的作用,研究还发现魔芋中性神经酰胺酶能对EV71病毒产生抑制作用,揭示了弥勒魔芋其在抗病毒方面的巨大潜力。
白立伟,牛义,刘海利,张盛林[5]（2016）在《魔芋种质资源及育种研究进展》文中研究表明综述了国内外魔芋种质资源的研究现状,以及利用自然选择、诱变育种和生物技术育种等开展魔芋种质创新与新品种选育取得的进展,并对今后魔芋新品种选育及良种保存提出了建议。
陈磊,郭政宏,程海丽,乐超银[6]（2015）在《农杆菌介导的花魔芋遗传转化体系的优化》文中指出[目的]探讨魔芋愈伤组织培养基、不同转化条件（菌液浓度、侵染时间、预培养时间及共培养时间）及转化植株的筛选条件（抗生素浓度和乙酰丁香酮（AS）浓度）等因素对转化效率的影响。[方法]采用卡那霉素抗性基因为选择标记,对农杆菌介导的花魔芋遗传转化体系进行优化。[结果]在预培养2 d,用OD600为0.6的菌液侵染30 min、共培养3 d,卡那霉素100 mg/L,羧苄青霉素250 mg/L,AS浓度100μmol/L的条件下能有效提高转化效率。再生花魔芋植株经GUS染色及PCR检测,结果表明外源目的基因已经整合到花魔芋基因组中。[结论]为魔芋抗病品种的转基因培育,丰富其种质资源,寻找抗病新途径提供理论依据和试验基础。
陈磊,廖甜甜,郭政宏,程海丽,乐超银[7]（2014）在《抗软腐病基因在花魔芋块茎组织中特异表达的研究》文中研究说明本研究利用PCR技术从马铃薯块茎基因组DNA中克隆块茎特异性启动子patatin,并从苏云金芽孢杆菌218中克隆aii A（高丝氨酸环内酯酶）基因,构建含aii A基因的抗软腐病植物表达载体p BI121-patatinaii A。并利用农杆菌介导法将aii A基因导入花魔芋,以研究aii A基因在魔芋块茎组织中的特异表达。结果表明,转化植株经GUS染色,仅在球茎部位出现蓝色斑点,经PCR检测,RT-PCR及Southern杂交检测证实aii A基因已整合到花魔芋基因组,初步表明aii A基因可在魔芋球茎内特异性表达。本研究对今后魔芋通过分子遗传工程改良软腐病抗性具有一定的应用价值。
蔡艺钦[8]（2014）在《海洋球石藻（Emiliania huxleyi）遗传转化系统的建立及初步功能分析》文中认为海洋球石藻（Coccolithophores）是一类单细胞海洋微型浮游植物,广泛分布于世界范围的近海和大洋水域中,在地质学、生物地理学、古气候学、生态生理学、材料科学和医学等领域中具有重要的研究价值。作为大洋环境中重要的初级生产者,海洋球石藻能够产生丰富的次级代谢生物活性物质,在生物技术研究领域具有广阔的应用前景。球石藻细胞能够合成大量聚酮类化合物,具有良好的抗菌、抗虫、抗肿瘤等生物学活性。引人注目的是,球石藻中最重要的种类Emiliania huxleyi能被特异性病毒感染并随着宿主细胞的裂解释放出大量神经酰胺类（Ceramide）物质,这可能是由于病毒在某种程度上控制着宿主神经酰胺的代谢过程,并通过大量合成神经酰胺类物质诱导宿主细胞凋亡。神经酰胺是细胞中的一种信号传导物质,对细胞分化、增殖、免疫、凋亡及衰老等生命活动具有重要调节作用。作为一种新型的生物活性物质,神经酰胺特有的生理功能及药物功效使其成为一种附加值极高并具有巨大市场潜力的活性物质,在化工、医药、食品、特别是高档护肤品等领域中具有广阔的应用前景。神经酰胺在细胞中的含量甚微,一般在0.01?0.2%（干重）左右。海洋球石藻E.huxleyi在病毒感染条件下,其细胞中神经酰胺的含量可达到细胞干重的0.091%。尽管与其他生物相比,其细胞中神经酰胺相对含量并不是很高,但球石藻神经酰胺独特的结构特点使其生物学活性远远高于任何陆地生物来源的神经酰胺。微藻基因工程是一种复杂而快速发展的生物技术,可作为操纵微藻代谢通路的强有力工具。通过微藻基因工程技术可以改造海洋球石藻鞘脂类合成代谢途径的关键环节,使其有利于高效合成并积累神经酰胺,从而有效提高细胞中神经酰胺的产量。目前有关海洋球石藻遗传转化系统及其应用研究国内外尚未见报道。本论文以海洋球石藻E.huxleyi（EhBOF92）及其特异性裂解病毒EhV-99B1为研究对象,构建海洋球石藻真核表达载体、建立其遗传转化方法,在此基础上将病毒基因组中神经酰胺合成第一限速酶丝氨酸棕榈酰转移酶（SPT）催化亚基LCB2基因亚克隆入表达载体并转化宿主藻细胞,检测LCB2基因表达水平及其对宿主细胞神经酰胺合成的影响。主要研究结果如下:（1）抗生素抗性基因的筛选及其克隆:选择氨苄青霉素、卡那霉素、G418、氯霉素、链霉素、新生霉素及嘌呤霉素等7种常用抗生素和除草剂草铵膦,以球石藻生长率为指标,从上述化学物质中筛选适宜的抗生素。结果表明,海洋球石藻对氨苄青霉素、卡那霉素和链霉素等不敏感,对氯霉素和新生霉素较敏感,而对G418、嘌呤霉素和草铵膦则高度敏感。综合分析最终选择G418作为球石藻基因工程藻株的选择性抗生素,其对应的抗性基因neo作为构建海洋球石藻真核表达载体的选择标记基因。从pSELECT载体中PCR扩增获得neo基因并通过测序验证。（2）启动子及报告基因的选择:从pGFP载体中PCR扩增获得绿色荧光蛋白基因gfp作为报告基因并通过测序验证;采用生物信息学方法筛选启动子,并对启动子序列进行综合分析。本文选择球石藻内源性fcp（岩藻黄素叶绿素a/c结合蛋白启动子）启动子,从基因组中PCR扩增该基因并利用PLACE（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）和Plant CARE（http://bioniformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）数据库对其序列中的顺式作用元件、增强子和阻遏因子等进行预测和分析。结果表明,fcp启动子序列包含大量的顺式作用元件,具有潜在的强启动子活性。（3）表达载体的构建及其转化方法的建立:以pUC18为基础载体,成功构建了双元重组表达载体pUC18-gfp-fcp和pUC18-fcp-neo,利用电击法共转化海洋球石藻。转化条件的优化结果为:选择对数中期细胞,质粒DNA浓度为10μg/mL（高纯度）,电击缓冲液为0.080 mol/L KCl、0.005 mol/L CaCl2、0.2 mol/L甘露醇、0.2 mol/L山梨醇、0.01 mol/L Hepes、pH 7.2,电场强度为2000 V/cm,电击时间为2 ms/次、电击2次。荧光显微镜及实时荧光定量PCR验证结果表明:成功获得转化的藻细胞,转化效率为0.07%。fcp启动子能够在球石藻细胞中启动gfp基因和neo基因的相对高效的表达。（4）球石藻病毒SPT对宿主神经酰胺合成的影响:从病毒基因组中克隆SPT（EC2.3.1.50）的催化亚基LCB2基因片段,构建了含有EhV99B1-LCB2基因的重组表达质粒pUC18-fcp-neo-LCB2,采用电击转化法将其与重组质粒pUC18-gfp-fcp进行共转化导入球石藻细胞中,经PCR验证获得含有病毒LCB2基因的球石藻基因工程藻株。通过高效液相色谱（HPLC）法对藻细胞中神经酰胺含量进行检测。结果表明:球石藻转化组细胞中神经酰胺含量达到45.25 fg/cell,是对照组的1.2倍,说明EhV99B1-LCB2一定程度上能够促进宿主细胞神经酰胺的合成。本研究初步建立的海洋球石藻稳定的遗传转化系统将为进一步开发功能获得型突变藻株（如病毒基因组中能够促进宿主细胞神经酰胺合成的基因）或基因敲除突变体藻株（如敲除神经酰胺水解酶基因）提供技术工具,为实现新型神经酰胺类物质产业化奠定基础。
徐茜[9]（2014）在《甘蓝型油菜抗草甘膦基因遗传转化及其抗性鉴定》文中认为草甘膦是一种高效的除草剂,对人畜危害较小,在土壤中容易分解,对环境的影响相对较小。抗草甘膦是油菜基因改良中的一个重点,本文以甘蓝型油菜新品种浙大619为研究材料,探究了影响油菜高效再生和油菜下胚轴高效转化的诸多因素,并对经筛选得到的转基因油菜苗进行了PCR鉴定分析,获得的主要结果如下：1.在本实验室研究的基础上,进一步明确了油菜苗龄、草甘膦对油菜外植体再生频率及不同激素配比对再生芽生根的影响。试验结果表明：在不同苗龄对油菜不同外植体分化的影响研究中发现它们的最佳苗龄不同,6-7d苗龄的油菜子叶柄均有较高的愈伤率和分化率,8d苗龄的油菜下胚轴愈伤率和分化率最高。研究发现当草甘膦浓度为13.0mg/L时,芽苗再生困难,可作为筛选浓度。生根阶段发现在添加有草甘膦的生根培养基上,无论1/2MS培养基还是MS培养基幼苗生根均受到了抑制,但是MS比1/2MS具有更高的生根率。2.农杆菌介导法中在愈伤组织分化阶段需用抑菌剂控制农杆菌的生长,本实验选用250mg/L特美汀（Tim）作为抑菌剂浓度,实验发现250mg/L Tim能抑制农杆菌的生长,促进再生芽的分化。在预培养阶段发现随着预培养时间的延长,外植体的褐化率明显降低,但是其出愈率和分化率并不与预培养天数成正比,3d是最佳预培养时间,能有效减少褐化现象,促进抗性芽苗分化。3.子叶柄和下胚轴的抗性芽苗再生方式不同,通过农杆菌介导法,子叶柄相对于下胚轴来说更难被转化,故本试验选用下胚轴作为转基因受体。在侵染阶段为了既降低农杆菌的伤害,又提高抗性芽苗分化,本实验侵染时间采用5min。筛选培养基中13mg/L草甘膦是较合适的筛选浓度。农杆菌侵染的油菜下胚轴外植体通过草甘膦筛选获得的抗性植株,经过PCR检测,鉴定为阳性转基因植株。
孟灵真[10]（2013）在《棉花Bt抗虫基因与bar抗除草剂基因的双价植物表达载体的构建及转化的研究》文中认为棉花是重要的经济作物，但是由于棉花的生长长期受到虫害和杂草的侵害，就这两项所造成的直接经济损失就占作物总产值的10%20%左右，因此棉花基因工程的发展就大大促进了抗虫、抗除草剂以及抗逆等棉花品种的培育。本研究利用PCR扩增出来的抗除草剂bar基因和实验室保存的抗虫Bt基因，成功构建抗除草剂与抗虫双价植物表达载体pBI121-bar/Bt。将植物表达载体pBI121-bar/Bt和pBI121-Bt分别转化至农杆菌工程菌菌株LBA4404中，并用转化后的农杆菌菌液，分别侵染棉花新海14、新海16、新海24和新海30的胚性愈伤组织。对pBI121-bar/Bt转化后的抗性愈伤组织进行了PPT浓度筛选，其浓度在3.0mg/L时，胚性愈伤的生长良好，同时筛选效果也明显；四种不同基因型胚性愈伤的生长情况中新海24的生长状态最差，说明不同基因型对PPT的敏感性有差异。对转化后的头孢霉素浓度也进行了筛选，结果表明：转化pBI121-bar/Bt基因的胚性愈伤在头孢霉素浓度为800mg/L时，既能很好地防止了农杆菌造成的污染，又能不抑制胚性愈伤的生长；转化pBI121-Bt基因的胚性愈伤的有效头孢霉素浓度为600mg/L。说明转化不同基因后，胚性愈伤对抗生素的敏感度有所不同。转化pBI121-bar/Bt基因的不同棉花品种的胚性愈伤在PPT浓度为3mg/L，头孢霉素浓度在800mg/L时，新海14的胚性愈伤较其他品种出愈率最高，侵染后变黑程度较轻；新海24的出愈率最低，侵染后变黑程度相对较严重。转化Bt-4AB基因的不同棉花品种的胚性愈伤在Kna浓度为50mg/L，头孢霉素浓度在600mg/L时，新海16的胚性愈伤较其他品种出愈率最高，在农杆菌侵染后变黑程度较为最轻；新海24的生长情况最差，变黑程度相对最严重；但胚性愈伤出愈率最低的是新海30。
二、基因枪法介导的魔芋遗传转化研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基因枪法介导的魔芋遗传转化研究（论文提纲范文）
（1）裸燕麦转基因体系的建立与优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 燕麦概述 |
| 1.2 植物组织培养研究进展 |
| 1.2.1 开放组培技术 |
| 1.2.2 无糖组培技术(光独立培养法) |
| 1.2.3 新型光源的应用 |
| 1.3 燕麦组织培养研究进展 |
| 1.3.1 品种 |
| 1.3.2 外植体 |
| 1.3.3 培养基 |
| 1.3.4 外源激素 |
| 1.4 燕麦遗传转化 |
| 1.4.1 基因枪法 |
| 1.4.2 花粉管通道转化法 |
| 1.4.3 农杆菌介导转化法 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 裸燕麦成熟胚组织培养 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 培养基的配制 |
| 2.2.2 种子预处理 |
| 2.2.3 诱导培养 |
| 2.2.4 继代培养 |
| 2.2.5 分化培养 |
| 2.2.6 生根培养 |
| 2.2.7 炼苗移栽 |
| 2.3 数据统计与分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 供试裸燕麦品种的筛选 |
| 2.4.2 成熟胚愈伤组织诱导培养基的筛选 |
| 2.4.3 愈伤组织绿芽分化培养基的筛选 |
| 2.4.4 不定根的诱导 |
| 2.5 小结 |
| 3 裸燕麦创伤胚遗传转化 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 质粒和菌种 |
| 3.1.3 引物设计 |
| 3.1.4 仪器及试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 裸燕麦创伤胚处理 |
| 3.2.2 侵染液的制备 |
| 3.2.3 培养基中抗生素浓度的筛选 |
| 3.2.4 菌液浓度对转化率的影响 |
| 3.2.5 移栽时间对胚出芽率、成活率的影响 |
| 3.2.6 转化植株验证 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 筛选培养基中抗生素浓度的确定 |
| 3.3.2 菌液浓度对转化率的影响 |
| 3.3.3 移栽时间对胚出芽率、成活率的影响 |
| 3.3.4 转化植株的检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 品种对裸燕麦成熟胚愈伤组织诱导的影响 |
| 4.2 培养基成分对裸燕麦成熟胚愈伤组织诱导与分化的影响 |
| 4.3 影响农杆菌转化的因素 |
| 4.4 创伤胚移栽时间的影响 |
| 4.5 再生植株的检测 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 作者简介 |
（2）根癌农杆菌介导黑曲霉外源基因表达系统的建立及优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 立题依据 |
| 1.2 黑曲霉表达系统的概述 |
| 1.2.1 黑曲霉内外源基因的表达 |
| 1.2.2 黑曲霉优化表达量的方法 |
| 1.2.2.1 启动子的选择 |
| 1.2.2.2 信号肽的选择 |
| 1.2.2.3 密码子偏好性优化 |
| 1.2.2.4 Kozak序列的应用 |
| 1.2.3 黑曲霉遗传转化方法 |
| 1.2.4 农杆菌介导转化真菌的研究 |
| 1.2.4.1 农杆菌介导转化真菌的研究进程 |
| 1.2.4.2 ATMT技术的转化机制及实验步骤 |
| 1.2.4.3 ATMT 转化效率的影响因素 |
| 1.3 绿色荧光蛋白基因 GFP 在真菌中的应用 |
| 1.4 β-葡聚糖酶的研究概况 |
| 1.4.1 微生物来源的 β-葡聚糖酶 |
| 1.4.2 动物和植物来源的 β-葡聚糖酶 |
| 1.4.3 β-葡聚糖酶的研究进展 |
| 1.4.4 β-葡聚糖酶的应用 |
| 1.4.4.1 β-葡聚糖酶在饲料工业中的应用 |
| 1.4.4.2 β-葡聚糖酶在啤酒酿造业中的应用 |
| 1.4.4.3 β-葡聚糖酶在食品工业中的应用 |
| 1.4.4.4 β-葡聚糖酶在生物防治中的应用 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 1.6 研究内容及技术路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第2章 黑曲霉CICC2629遗传转化体系的建立及优化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 工具酶与主要试剂 |
| 2.1.4 常用溶液 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 黑曲霉宿主菌的选择 |
| 2.2.1.1 不同黑曲霉菌株生长速度及产孢能力的监控 |
| 2.2.1.2 黑曲霉菌株对潮霉素敏感度测试 |
| 2.2.2 中间双元载体的构建 |
| 2.2.2.1 基础质粒的提取 |
| 2.2.2.2 潮霉素表达盒的制备. |
| 2.2.2.3 大肠杆菌感受态E.coli DH5α 的制备 |
| 2.2.2.4 基础双元质粒双酶切 |
| 2.2.2.5 潮霉素表达盒与线性化基础质粒pCAMBIA3301的连接转化 |
| 2.2.2.6 重组质粒转化子阳性鉴定. |
| 2.2.3 农杆菌感受态的制备 |
| 2.2.4 重组质粒转化农杆菌 |
| 2.2.4.1 农杆菌p CA-Hyg转化子阳性鉴定. |
| 2.2.5 根癌农杆菌介导黑曲霉的遗传转化 |
| 2.2.5.1 黑曲霉孢子悬浮液的制备 |
| 2.2.5.2 农杆菌避光诱导培养 |
| 2.2.5.3 黑曲霉孢子与农杆菌菌液诱导共培养 |
| 2.2.6 黑曲霉转化株鉴定 |
| 2.2.6.1 转化株基因组提取及PCR鉴定 |
| 2.2.6.2 转化株黑曲霉潮霉素稳定性检测 |
| 2.2.7 ATMT转化条件的优化 |
| 2.2.7.1 农杆菌种类的优化 |
| 2.2.7.2 共培养乙酰丁香酮浓度的优化 |
| 2.2.7.3 共培养膜基质的优化 |
| 2.2.7.4 共培养温度和时间的优化 |
| 2.2.7.5 黑曲霉孢子浓度的优化 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 黑曲霉生长速度及产孢能力分析 |
| 2.3.2 潮霉素对黑曲霉抑制情况分析 |
| 2.3.3 中间双元载体的构建结果分析 |
| 2.3.3.1 潮霉素表达盒的制备结果 |
| 2.3.3.2 基础质粒 pCAMBIA3301 线性化结果 |
| 2.3.3.3 线性化质粒 pCAMBIA3301 与 gpd-hgy 片段连接转化及转化子鉴定 |
| 2.3.4 根癌农杆菌转化子阳性鉴定分析 |
| 2.3.5 农杆菌与黑曲霉诱导共培养分析 |
| 2.3.6 转化子基因组为模板PCR阳性鉴定及测序分析 |
| 2.3.7 转化子遗传稳定性分析 |
| 2.3.8 ATMT转化法最适条件分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 2.4.1 讨论 |
| 2.4.2 小结 |
| 第3章 eGFP基因在黑曲霉中的表达及启动子的选择 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 工具酶与主要试剂 |
| 3.1.4 常用溶液 |
| 3.1.5 培养基 |
| 3.1.6 DNA测序与引物合成 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 三种eGFP双元表达载体的构建 |
| 3.2.1.1 eGFP 表达盒 gpdA-eGFP-trp C、glaA-eGFP-trp C、ToxA-eGFP-NOS 各组分基因的制备 |
| 3.2.1.2 中间双元质粒pCAMBIA-gpdA-hyg的双酶切 |
| 3.2.1.3 表达盒 gpdA-eGFP-trpC、gla A-eGFP-trp C、ToxA-eGFP-NOS 各片段的连接及转化 |
| 3.2.1.4 重组质粒转化子阳性鉴定 |
| 3.2.2 重组eGFP表达质粒转化农杆菌 |
| 3.2.2.1 农杆菌eGFP转化子鉴定 |
| 3.2.3 根癌农杆菌介导黑曲霉的遗传转化 |
| 3.2.4 黑曲霉转化子鉴定 |
| 3.2.4.1 荧光显微镜检查转化子 |
| 3.2.4.2 eGFP转化子剖面荧光强度分析 |
| 3.2.4.3 eGFP转化子基因组 PCR 鉴定 |
| 3.2.5 qPCR测定eGFP基因相对表达量 |
| 3.2.5.1 eGFP转化子RNA提取 |
| 3.2.5.2 RNA反转录cDNA |
| 3.2.5.3 实时荧光定量 PCR |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 eGFP表 达质粒p CAMBIA-gpd A-eGFP-trp C、p CAMBIA-gla A-eGFP-trp C和p CAMBIA-Tox A-eGFP-NOS的构建结果分析 |
| 3.3.2 重组质粒转化子阳性验证及测序分析 |
| 3.3.3 三种eGFP表达质粒转化农杆菌及转化子阳性验证 |
| 3.3.4 黑曲霉转化株鉴定 |
| 3.3.4.1 荧光显微镜检查转化子 |
| 3.3.4.2 转化子基因组模板PCR鉴定 |
| 3.3.4.3 转化子剖面荧光强度分析 |
| 3.3.5 实时荧光定量PCR测定eGFP基因相对表达量 |
| 3.3.5.1 eGFP转化子RNA提取 |
| 3.3.5.2 eGFP基因转录水平检测. |
| 3.4 讨论与小结 |
| 3.4.1 讨论 |
| 3.4.2 小结 |
| 第4章 葡聚糖酶在黑曲霉中的表达及酶学性质的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株与质粒 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 工具酶与主要试剂 |
| 4.1.4 所用溶液 |
| 4.1.5 培养基 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 葡聚糖酶表达载体pCA-gpdA-An-Glu 和 pCA-glaA-An-piGlu的构建 |
| 4.2.1.1 葡聚糖酶基因的制备 |
| 4.2.1.2 质粒pGH-glaA-box 和 pGH-gpdA-box 的线性化 |
| 4.2.1.3 gpdA-An-Glu和 glaA-An-Glu 基因与线性化载体的连接转化 |
| 4.2.1.4 重组质粒转化子阳性鉴定 |
| 4.2.1.5 gpdA-An-Glu-box 和 glaA-An-Glu-box 的制备 |
| 4.2.1.6 葡聚糖酶表达盒与线性化中间双元载体pCAMBIA3301-gpdA-hyg的连接及转化 |
| 4.2.1.7 葡聚糖酶双元表达质粒的阳性鉴定 |
| 4.2.2 提高表达量质粒的改造及验证 |
| 4.2.3 葡聚糖酶表达载体转化农杆菌及转化子鉴定 |
| 4.2.4 含有葡聚糖酶表达载体的根癌农杆菌介导转化黑曲霉及转化子鉴定 |
| 4.2.5 黑曲霉的发酵及SDS-PAGE凝胶电泳检测 |
| 4.2.5.1 黑曲霉的发酵 |
| 4.2.5.2 葡聚糖酶的SDS-PAGE凝胶电泳检测 |
| 4.2.6 葡聚糖酶An-Glu的酶学性质测定 |
| 4.2.6.1 DNS法原理及实验方法 |
| 4.2.6.2 1%(W/V)葡聚糖底物的准备 |
| 4.2.6.3 DNS法标准曲线的绘制 |
| 4.2.6.4 最适反应pH及pH稳定性测定 |
| 4.2.6.5 最适反应温度及温度稳定性测试 |
| 4.2.6.6 化学试剂及金属离子对葡聚糖酶An-Glu酶活力影响的测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 An-Glu表达载体p CA-gpd A-An-Glu和p CA-gla A-An-Glu的构建结果 |
| 4.3.2 An-Glu黑曲霉转化子的鉴定 |
| 4.3.3 黑曲霉表达An-Glu及SDS-PAGE凝胶电泳检测 |
| 4.3.4 Kozak序列优化后表达量情况及An-Glu基因表达水平分析 |
| 4.3.5 DNS法标准曲线的绘制及An-Glu酶学性质的分析 |
| 4.3.5.1 DNS标准曲线的绘制 |
| 4.3.5.2 葡聚糖酶An-Glu pH活性和pH稳定性的测定 |
| 4.3.5.3 葡聚糖酶 An-Glu 的热活性和热稳定性测定 |
| 4.3.5.4 金属离子与有机试剂对 An-Glu 酶活力的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 黑曲霉发酵条件的优化 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要培养基 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 氮源的优化 |
| 5.2.2 碳源的优化 |
| 5.2.3 发酵温度的优化 |
| 5.2.4 发酵时间的优化 |
| 5.2.5 孢子悬浮液接种量的优化 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 最优氮源的测定 |
| 5.3.2 最优碳源的测定 |
| 5.3.3 发酵温度的优化 |
| 5.3.4 发酵时间的优化 |
| 5.3.5 孢子悬浮液接种量的优化 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.1.1 黑曲霉遗传转化体系的建立及优化 |
| 6.1.2 eGFP基因在黑曲霉中的表达 |
| 6.1.3 葡聚糖酶在黑曲霉中的表达 |
| 6.1.4 黑曲霉发酵条件的优化 |
| 6.2 创新 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录A 实验中所用到的缓冲液及配方 |
| A1 不同pH的柠-磷缓冲液配方 |
| A2 不同pH的甘氨酸-Na OH缓冲液 |
| 附录B 本研究涉及到的基因核苷酸序列 |
| B1 gpdA启动子及信号肽的核苷酸序列(5?-3?) |
| B2 glaA启动子及信号肽的核苷酸序列(5?-3?) |
| B3 trpC终止子核苷酸序列(5?-3?) |
| B4 ToxA-eGFP-NOS表达盒核苷酸序列(5?-3?) |
| B5 葡聚糖酶基因An-Glu核苷酸序列(5?-3?) |
| 攻读学位期间发表的学术论文和研究成果 |
| 致谢 |
（3）山核桃赤霉素相关基因CcKO的克隆及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 综述 |
| 1.1 赤霉素研究概况 |
| 1.1.1 赤霉素的生理功能及合成代谢途径 |
| 1.1.1.1 赤霉素的发现及生理功能 |
| 1.1.1.2 赤霉素的生物合成代谢途径 |
| 1.1.2 赤霉素合成关键酶的研究进展 |
| 1.1.2.1 古巴焦磷酸合酶 |
| 1.1.2.2 内根-贝壳杉烯合酶 |
| 1.1.2.3 内根-内壳杉烯氧化酶 |
| 1.1.2.4 GA-20氧化酶 |
| 1.1.2.5 GA-2氧化酶 |
| 1.1.2.6 GA-3氧化酶 |
| 1.2 胡桃科坚果类树种的研究概况 |
| 1.2.1 胡桃科坚果类树种体胚再生体系的研究进展 |
| 1.2.2 胡桃科坚果类树种遗传转化体系的研究进展 |
| 1.2.2.1 农杆菌介导的遗传转化影响因素 |
| 1.2.2.2 胡桃科坚果类树种遗传转化的研究进展 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 1.4 技术路线 |
| 2 山核桃KO基因和启动子的克隆及相关表达载体的构建 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.1.1 植物材料 |
| 2.1.1.2 实验试剂 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.2.1 山核桃KO基因及启动子的克隆 |
| 2.1.2.1.1 山核桃CcKO基因的克隆 |
| 2.1.2.1.2 山核桃PCcKO启动子的克隆 |
| 2.1.2.2 山核桃KO基因过表达载体和启动子表达载体的构建 |
| 2.1.2.2.1 山核桃CcKO基因过表达载体的构建 |
| 2.1.2.2.2 山核桃PCcKO启动子表达载体的构建 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 山核桃CcKO基因的克隆及过表达载体的构建 |
| 2.2.1.1 山核桃总RNA的提取 |
| 2.2.1.2 山核桃CcKO基因的克隆及过表达载体的构建 |
| 2.2.2 山核桃PCcKO启动子的扩增及表达载体的构建 |
| 2.2.3 测序结果与序列分析 |
| 2.2.3.1 山核桃CcKO基因序列及分析 |
| 2.2.3.2 山核桃PCcKO启动子序列及分析 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 3 山核桃KO基因及启动子遗传转化体系的构建 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.1.1 植物材料 |
| 3.1.1.2 实验试剂 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.2.1 核桃遗传转化体系的优化 |
| 3.1.2.1.1 核桃体胚萌发体系优化 |
| 3.1.2.1.2 抗生素种类和浓度优化 |
| 3.1.2.2 农杆菌介导的山核桃KO基因及启动子的遗传转化 |
| 3.1.3 数据处理 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 核桃遗传转化体系的优化 |
| 3.2.1.1 核桃体胚萌发体系优化 |
| 3.2.1.2 抗生素种类和浓度优化 |
| 3.2.2 农杆菌介导的山核桃KO基因及启动子的遗传转化 |
| 3.2.2.1 山核桃CcKO基因在核桃中的遗传转化及阳性检测 |
| 3.2.2.2 山核桃PCcKO启动子在核桃中的遗传转化及阳性检测 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 4 山核桃CcKO基因的表达分析和生物学功能验证 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.1.3.1 核桃转化植株的表型分析 |
| 4.1.3.2 核桃转化植株中KO及GA20ox、GA2ox基因的相对表达量检测 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 山核桃CcKO基因阳性植株的表型分析 |
| 4.2.2 山核桃CcKO基因过量表达对GAs合成下游关键酶基因的影响 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（4）魔芋转基因体系的研究以及中性神经酰胺酶基因的克隆（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 魔芋的生物学研究 |
| 1.2 魔芋的生产与应用 |
| 1.2.1 魔芋发展的现状及问题 |
| 1.2.2 魔芋产业发展前景 |
| 1.3 魔芋组织培养及转基因研究 |
| 1.3.1 魔芋组织培养研究进展 |
| 1.3.2 魔芋转基因研究进展 |
| 1.4 魔芋的分子遗传学生物学研究 |
| 1.5 中性神经酰胺酶基因的克隆研究进展 |
| 第二章 白魔芋组织培养及转基因体系的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 基本培养基以及激素的配制 |
| 2.1.3 愈伤组织的诱导 |
| 2.1.4 愈伤组织的分化培养 |
| 2.1.5 再生植株的染色体倍性检测 |
| 2.1.6 农杆菌介导的遗传转化方法 |
| 2.1.7 转基因植株PCR检测 |
| 2.2 数据统计与分析 |
| 2.2.1 试验数据统计内容 |
| 2.2.2 分析方法 |
| 2.3 实验结果及分析 |
| 2.3.1 愈伤组织诱导 |
| 2.3.2 不同类型愈伤组织切片观察 |
| 2.3.3 愈伤组织分化培养 |
| 2.3.4 染色体倍性分析 |
| 2.3.5 愈伤组织对抗生素的敏感性 |
| 2.3.6 预培养 |
| 2.3.7 侵染培养及共培养 |
| 2.3.8 筛选培养 |
| 2.3.9 阳性愈伤组织分化及阳性转化植株检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 弥勒魔芋转录组数据分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 转录组测序 |
| 3.1.3 生物信息学分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 原始测序数据产量 |
| 3.2.2 KOG功能注释 |
| 3.2.3 GO功能注释 |
| 3.2.4 弥勒魔芋叶片中高表达转录本 |
| 3.2.5 Pathway代谢通路分析 |
| 3.2.6 魔芋中神经酰胺的生物合成途径分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 弥勒魔芋中神经酰胺酶的克隆与功能验证 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 RACE克隆基因全长 |
| 4.1.3 弥勒魔芋中性神经酰胺酶基因全长序列分析 |
| 4.1.4 弥勒魔芋中性神经酰胺酶基因的真核表达 |
| 4.1.5 弥勒魔芋中性神经酰胺酶水解功能验证 |
| 4.1.6 弥勒魔芋中性神经酰胺酶对干扰素相关基因及EV71病毒的作用 |
| 4.2 实验结果与分析 |
| 4.2.1 弥勒魔芋中性神经酰胺酶基因的序列分析 |
| 4.2.2 酿酒酵母基因敲除 |
| 4.2.3 弥勒魔芋中性神经酰胺酶在酵母中的表达 |
| 4.2.4 弥勒魔芋中性神经酰胺酶对干扰素影响 |
| 4.2.5 弥勒魔芋中性神经酰胺酶对病毒的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的科研成果目录 |
| 致谢 |
（5）魔芋种质资源及育种研究进展（论文提纲范文）
| 1 魔芋种质资源研究 |
| 2 魔芋育种技术研究 |
| 2.1 自然选择 |
| 2.2 诱变育种 |
| 2.3 生物技术育种 |
| 2.3.1 脱毒或良种快繁 |
| 2.3.2 细胞融合技术 |
| 2.3.3 转基因育种 |
| 3 展望 |
| 3.1 加强魔芋种质资源收集、整理、创新和应用 |
| 3.2 加强生物技术在魔芋育种上的应用 |
| 3.3 健全魔芋良种繁育与技术推广应用体系 |
（6）农杆菌介导的花魔芋遗传转化体系的优化（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 2结果与分析 |
| 3 结论与讨论 |
（7）抗软腐病基因在花魔芋块茎组织中特异表达的研究（论文提纲范文）
| 1 结果与分析 |
| 1.1 GUS染色检测 |
| 1.2 PCR及RT-PCR检测 |
| 1.3 Southern检测 |
| 2 讨论 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 植物材料与农杆菌菌株 |
| 3.2 表达载体的构建 |
| 3.3 遗传转化 |
| 3.4 抗性植株的检测 |
| 3.4.1 GUS染色瞬间检测 |
| 3.4.2 PCR检测 |
| 3.4.3 RT-PCR检测 |
| 3.4.4 Southern检测 |
| 作者贡献 |
（8）海洋球石藻（Emiliania huxleyi）遗传转化系统的建立及初步功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 海洋球石藻 |
| 1.2 海洋球石藻病毒 |
| 1.3 神经酰胺在应用领域的研究概况 |
| 1.3.1 神经酰胺简介 |
| 1.3.2 神经酰胺的应用 |
| 1.3.3 神经酰胺的市场现状及发展前景 |
| 1.3.4 神经酰胺的主要来源 |
| 1.3.5 神经酰胺常用检测方法 |
| 1.4 球石藻病毒对宿主神经酰胺合成代谢的调控 |
| 1.4.1 球石藻病毒与宿主间的基因横向转移 |
| 1.4.2 球石藻病毒基因组特点及其与神经酰胺代谢相关的功能基因 |
| 1.4.3 球石藻中神经酰胺类物质的累积机理及其特点 |
| 1.5 真核微藻的遗传转化 |
| 1.5.1 选择标记 |
| 1.5.2 启动子 |
| 1.5.3 增强子 |
| 1.5.4 真核微藻的遗传转化方法 |
| 1.5.5 微藻基因工程应用现状及前景 |
| 1.6 本论文的研究目的与意义 |
| 第2章 海洋球石藻抗生素抗性分析及选择标记筛选 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验藻种 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 海洋球石藻的培养方法 |
| 2.1.5 液体培养中海洋球石藻对7种抗生素敏感性的测定 |
| 2.1.6 固体培养中海洋球石藻对抗生素敏感性的验证 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 氨苄青霉素对海洋球石藻生长的影响 |
| 2.2.2 卡那霉素对海洋球石藻生长的影响 |
| 2.2.3 G418对海洋球石藻生长的影响 |
| 2.2.4 氯霉素对海洋球石藻生长的影响 |
| 2.2.5 链霉素对海洋球石藻生长的影响 |
| 2.2.6 新生霉素对海洋球石藻生长的影响 |
| 2.2.7 嘌呤霉素对海洋球石藻生长的影响 |
| 2.2.8 草铵膦对海洋球石藻生长的影响 |
| 2.3 分析与讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 海洋球石藻真核表达载体的构建及电击转化方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验藻种 |
| 3.1.2 实验主要试剂、菌种和载体 |
| 3.1.3 实验主要仪器 |
| 3.1.4 绿色荧光蛋白gfp基因的扩增 |
| 3.1.5 海洋球石藻fcp基因的扩增 |
| 3.1.6 抗G418抗性基因neo的扩增 |
| 3.1.7 海洋球石藻真核表达载体的构建 |
| 3.1.8 海洋球石藻电转化方法的建立 |
| 3.1.9 转化细胞的检测 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 海洋球石藻真核表达载体相关元件基因的克隆 |
| 3.2.2 海洋球石藻双元真核表达载体的构建 |
| 3.2.3 电击法共转化球石藻的结果 |
| 3.3 分析与讨论 |
| 3.3.1 海洋球石藻真核表达载体的综合评价 |
| 3.3.2 海洋球石藻电击转化效率的影响因素 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 海洋球石藻病毒丝氨酸棕榈酰转移酶催化亚基LCB2对宿主细胞神经酰胺合成的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验藻种、病毒株 |
| 4.1.2 实验主要试剂、菌种和载体 |
| 4.1.3 实验主要仪器 |
| 4.1.4 Eh V99B1丝氨酸棕榈酰转移酶催化亚基LCB2基因的克隆 |
| 4.1.5 重组质粒p UC18-fcp-neo-LCB2的构建 |
| 4.1.6 含有Eh V99B1-LCB2基因的海洋球石藻基因工程藻株的构建 |
| 4.1.7 电转化细胞的PCR检测 |
| 4.1.8 高效液相色谱法（HPLC）检测海洋球石藻神经酰胺类物质的含量 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 Eh V99B1-LCB2基因的扩增及克隆 |
| 4.2.2 重组质粒p UC18-fcp-neo-LCB2的构建及鉴定 |
| 4.2.3 电转化结果 |
| 4.2.4 病毒LCB2对球石藻神经酰胺含量的影响 |
| 4.3 分析与讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 本论文的主要结论 |
| 5.2 本论文的创新点 |
| 5.3 本论文的研究展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 在学期间发表的学术论文 |
（9）甘蓝型油菜抗草甘膦基因遗传转化及其抗性鉴定（论文提纲范文）
| 目录 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 油菜研究进展 |
| 1.1.1 油菜转基因方法 |
| 1.1.2 转基因油菜外植体 |
| 1.1.3 转基因油菜的不同靶基因 |
| 1.1.4 转基因油菜存在的问题 |
| 1.2 油菜高效再生体系的研究进展 |
| 1.2.1 基因型对油菜再生体系的影响 |
| 1.2.2 苗龄对油菜再生体系的影响 |
| 1.2.3 培养基对油菜再生体系的影响 |
| 1.2.4 褐化以及玻璃化现象 |
| 1.3 农杆菌介导的油菜转化体系研究 |
| 1.3.1 油菜外植体类型的选择 |
| 1.3.2 外源物的添加 |
| 1.3.3 农杆菌的侵染浓度以及时间 |
| 1.3.4 预培养以及共培养 |
| 1.3.5 抗生素的使用 |
| 1.4 草甘膦抗性基因研究进展 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 2 甘蓝型油菜下胚轴外植体高效再生体系的建立 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 主要试剂及培养基的配制 |
| 2.2.3 无菌油菜苗外植体的准备及接种 |
| 2.2.4 不同苗龄对油菜外植体再生的影响 |
| 2.2.5 不同草甘膦浓度对油菜外植体再生的影响 |
| 2.2.6 优化生根条件 |
| 2.2.7 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不同苗龄对油菜外植体再生的影响 |
| 2.3.2 不同草甘膦浓度对油菜外植体再生的影响 |
| 2.3.3 优化生根条件 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 不同苗龄对油菜外植体再生的影响 |
| 2.4.2 不同草甘膦浓度对油菜外植体再生的影响 |
| 2.4.3 优化生根条件 |
| 3 甘蓝型油菜下胚轴农杆菌介导的高效转化体系建立 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 主要试剂及培养基 |
| 3.2.3 检测目的基因及转化植株 |
| 3.2.4 特美汀浓度的选择 |
| 3.2.5 预培养对转化的影响 |
| 3.2.6 农杆菌侵染时间对转化的影响 |
| 3.2.7 草甘膦对转化的影响 |
| 3.2.8 转化植株的生根、移栽以及春化 |
| 3.2.9 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 质粒以及阳性农杆菌菌液PCR检测 |
| 3.3.2 特美汀浓度的选择 |
| 3.3.3 预培养对转化的影响 |
| 3.3.4 农杆菌侵染时间对转化的影响 |
| 3.3.5 草甘膦对转化的影响 |
| 3.3.6 抗性植株的PCR鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 特美汀浓度的选择 |
| 3.4.2 预培养对转化的影响 |
| 3.4.3 农杆菌侵染时间对转化的影响 |
| 3.4.4 草甘膦对转化的影响 |
| 4 结论和展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 5 参考文献 |
（10）棉花Bt抗虫基因与bar抗除草剂基因的双价植物表达载体的构建及转化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 国内外植物转基因的发展现状 |
| 1.1.1 世界植物转基因的发展现状 |
| 1.1.2 我国转基因的研究现状 |
| 1.2 棉花转基因的方法 |
| 1.2.1 农杆菌介导法 |
| 1.2.2 花粉管通道法 |
| 1.2.3 基因枪法 |
| 1.2.4 基因枪法和农杆菌结合的转化方法 |
| 1.2.5 真空渗透转化法 |
| 1.3 农杆菌介导棉花遗传转化的影响因素 |
| 1.3.1 外植体对遗传转化的影响 |
| 1.3.2 基因型对转化率的影响 |
| 1.3.3 外植体的来源和大小对转化率的影响 |
| 1.3.4 受体材料预培养和共培养的天数对转化率的影响 |
| 1.3.5 农杆菌的菌株及活力对遗传转化的影响 |
| 1.3.6 药物选择与筛选压力的选择 |
| 1.3.7 抑菌抗生素对再生率的影响 |
| 1.3.8 基因活化的诱导物 |
| 1.4 转基因抗虫棉的研究进展 |
| 1.4.1 苏云金芽孢杆菌基因 |
| 1.4.2 蛋白酶抑制剂基因 |
| 1.4.3 外源凝集素基因 |
| 1.4.4 几丁质酶基因 |
| 1.4.5 抗虫棉的应用现状 |
| 1.5 抗除草剂基因工程在棉花遗传转化中的研究概况 |
| 1.5.1 抗除草剂 bar 基因及其应用 |
| 1.5.2 抗除草剂基因 als 及其应用 |
| 1.5.3 抗草甘膦基因 |
| 1.5.4 2，4-D 单氧化酶(tfdA)基因 |
| 1.5.5 溴苯腈水解酶基因 |
| 1.5.6 研究意义 |
| 第2章 抗除草剂 bar 基因与抗虫 Bt 基因双价植物表达载体的构建 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 质粒与菌株 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器设备（型号、产地） |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 培养基及溶液配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 bar 基因的 PCR 扩增，检测与回收纯化 |
| 2.2.2 中间克隆载体的构建 |
| 2.2.3 真核表达载体 pBI121-bar/Bt 的构建 |
| 2.2.4 真核表达载体 pBI121-bar/Bt 转化农杆菌 LBA4404 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 抗除草剂 bar 基因的 PCR 扩增、测序及 bar 基因的酶切鉴定 |
| 2.3.2 Bt-4AB 双酶切 |
| 2.3.3 pBI121-bar/Bt 重组质粒的酶切及 PCR 鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 农杆菌介导的植物表达载体的遗传转化 |
| 3.1 实验材料与培养基 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 农杆菌侵染液的制备 |
| 3.2.2 农杆菌对棉花胚性愈伤组织的侵染 |
| 3.2.3 影响海岛棉胚性愈伤组织遗传转化因子的研究 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PPT 浓度的筛选 |
| 3.3.2 不同基因型对 PPT 的敏感性的差异 |
| 3.3.3 头孢霉素（Cef）抑菌浓度的确定 |
| 3.3.4 头孢霉素（Cef）对胚性愈伤组织生长的影响 |
| 3.3.5 转化不同外源基因的外植体在不同 Cef 浓度下的差异 |
| 3.3.6 农杆菌侵染后愈伤生长状态的差异 |
| 3.3.7 遗传转化中不同外源基因对不同基因型愈伤出愈率的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、基因枪法介导的魔芋遗传转化研究（论文参考文献）
- [1]裸燕麦转基因体系的建立与优化[D]. 李庆华. 内蒙古农业大学, 2021(02)
- [2]根癌农杆菌介导黑曲霉外源基因表达系统的建立及优化[D]. 胡懋. 云南师范大学, 2021(08)
- [3]山核桃赤霉素相关基因CcKO的克隆及功能分析[D]. 梁璧. 浙江农林大学, 2020(02)
- [4]魔芋转基因体系的研究以及中性神经酰胺酶基因的克隆[D]. 钟琳. 武汉大学, 2017(12)
- [5]魔芋种质资源及育种研究进展[J]. 白立伟,牛义,刘海利,张盛林. 南方农业, 2016(04)
- [6]农杆菌介导的花魔芋遗传转化体系的优化[J]. 陈磊,郭政宏,程海丽,乐超银. 安徽农业科学, 2015(05)
- [7]抗软腐病基因在花魔芋块茎组织中特异表达的研究[J]. 陈磊,廖甜甜,郭政宏,程海丽,乐超银. 分子植物育种, 2014(06)
- [8]海洋球石藻（Emiliania huxleyi）遗传转化系统的建立及初步功能分析[D]. 蔡艺钦. 集美大学, 2014(08)
- [9]甘蓝型油菜抗草甘膦基因遗传转化及其抗性鉴定[D]. 徐茜. 浙江大学, 2014(03)
- [10]棉花Bt抗虫基因与bar抗除草剂基因的双价植物表达载体的构建及转化的研究[D]. 孟灵真. 新疆农业大学, 2013(01)