段佳琪
(国药集团新疆制药有限公司830000)
【摘要】目的本试验研究对头孢丙烯原料药的微生物限度检查方法进行了验证分析，结果提示，对头孢丙烯原料的微生物限度检查法而言，应采用低速离心-薄膜过滤-酶中和联用法进行其细菌计数及控制菌检查，而霉菌与酵母菌计数则应采用平皿法。
【关键词】头孢丙烯原料药微生物限度方法验证
【中图分类号】R446.5【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）18-0260-02
头孢丙烯为第二代头孢类抗生素，具广谱抗菌作用，其对多种革兰阳性需氧菌均具有明显作用，同时对包括大肠埃希菌、单核细胞增多性李斯特菌、坚忍肠球菌以及链球菌等多个菌种都有很好的抑制作用。与此同时，最新中国药店规定，在对具抗菌活性药物进行微生物限度检查的过程中，应首先将其抗菌或定消除，最后还需对所采用的方法进行验证，以此确定该方法是否适用于该药品的微生物限度检查。
1材料
1.1仪器主要包括空电子天平、气净化间、净化台、生物安全柜、热压力蒸汽灭菌器恒、电热恒温鼓风干燥箱、温振荡仪、恒温培养箱、霉菌培养箱以及离心沉淀器等。
1.2培养基与试剂培养基主要包括琼脂培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂斜面培养基、营养肉汤培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基以及4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基等。试剂主要包括无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH7.0)、无菌氯化钠溶液(浓度0.9%)与头孢菌素酶(200万U/支)。
1.3菌种及样品菌种主要包括大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌以及黑曲霉等。头孢丙烯原料药包括3个批次，其批号分别为130412、130513、130617。
2方法与结果
2.1菌液制备接种大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌以及金黄色葡萄球菌的新鲜培养物到琼脂培养基中，并于30～35℃温度条件下培养18～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物到改良马丁培养基中，并在23～28℃下培养24～48h；接种黑曲霉菌的新鲜培养物到改良马丁琼脂斜面培养基中，并在培养5～7d后向其中加入含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液3～5mL，将孢子洗脱后吸出孢子悬液至无菌试管内，在用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成含孢子数为50～100cfu/1mL的孢子悬液。
2.2供试液制备取10g样品，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，在45℃下恒温振荡混匀制成1∶10的供试液。
2.3细菌、霉菌与酵母菌的计数方法验证由于本样品水溶性不高，同时对细菌尤其是金黄色葡萄球菌具强抑制作用，故试验组分别采用培养基稀释法、低速离心沉淀-薄膜过滤法、低速离心沉淀-薄膜过滤-酶中和联用法等方法进行细菌的计数处理，在对各法的回收率进行统计分析，将未低于70%者作为有效方法；另外，霉菌与酵母菌计数采用平皿法验证。菌液组则直接进行培养基培养后计数即可。供试品对照组同试验组处理，仅加入相应培养基，但不加菌液，在此条件下培养计数即可。稀释对照组则直接采用无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH7.0)替代供试品，加试验菌至最终菌浓度为50～100cfu/1mL，再按同试验组方法进行菌数计数即可。完成计数后再进行回收率计算，其中，试验组菌回收率=(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数×100%；稀释剂对照组菌回收率=稀释剂对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数×100%。最后再进行菌落计数法验证结果，上法分别进行3次平行试验，最终取每次回收率均不低于70%的最简方法作为头孢丙烯原料药的菌落计数方法，结果显示，细菌计数宜采用低速离心-薄膜过滤-酶中和联用法，霉菌与酵母菌宜采用平皿法。
2.4控制菌检查法的验证分别取3批样品并制成1∶10供试液各10mL与10～100cfu试验菌。①培养基稀释法：取制得的样品加入到灭菌锥形瓶中，并分别在尝试加入300或500mL胆盐乳糖培养基；②低速离心沉淀-薄膜过滤法：同2.3项中进行细菌计数并制备薄膜，并放哪购入含100mL胆盐乳糖的灭菌瓶中；③低速离心沉淀-薄膜过滤-酶中和联用法：同样照上法进行细菌计数；④制备薄膜，放入含100mL(含50万单位头孢菌素酶)胆盐乳糖灭菌瓶中。照上述方法所制得的薄膜均置于35℃条件下培养18～24h，最后再进行MUG试验与靛基质试验。试验结果显示，三个批次样品均在采用低速离心沉淀-薄膜过滤-酶中和联用法时的效果最优，试验组有检出大肠埃希菌，故认为可按此法进行头孢丙烯原料的控制菌检查。
3结论
本试验通过对5种试验菌，3批次样品分别进行3次平行实验的回收率方法学验证与控制菌方法验证，结果提示，对头孢丙烯原料的微生物限度检查法而言，应采用低速离心-薄膜过滤-酶中和联用法进行其细菌计数及控制菌检查，而霉菌与酵母菌计数则应采用平皿法。
参考文献
[2]姚华，潘庭峰.2种原料药微生物限度检查方法验证[J].淮海医药，2012，30(6)：541-542.
[3]潘强，白旭东.罗红霉素缓释颗粒微生物限度检验方法的探讨[J].中国药事，2009，23(8)：804-806.