谷氨酸棒状杆菌CRISPR-Cpf1和Cre/loxP基因敲除技术的比较

论文摘要

【背景】谷氨酸棒状杆菌的基因敲除系统较为匮乏且效率不高,难以对其进行代谢工程改造,不利于高性能工业菌株的构建及规模生产。【目的】分别采用CRISPR-Cpf1和Cre/loxP基因敲除系统对谷氨酸棒状杆菌ATCC13032（CorynebacteriumglutamicumATCC13032）基因组上的argR和argF基因进行敲除,比较两种敲除方法的优缺点,为合理选择敲除系统提供依据。【方法】特异性重组的Cre/loxP敲除系统是首先利用同源重组将基因组上的靶基因替换为两端带有重组位点loxP的kanR片段,然后由重组酶Cre识别loxP位点并发生重组反应,从而去除替换到基因组上的kanR片段,进一步利用质粒的温敏特性将其消除,从而实现靶基因的敲除。CRISPR-Cpf1敲除系统是利用Cpf1对pre-crRNA进行加工,形成的成熟crRNA引导Cpf1识别和结合到靶DNA的特定序列上并切割双链DNA分子,通过同源重组作用去除靶基因,基于质粒自身的温敏特性将其消除,从而完成基因敲除的整个过程。【结果】Cre/lox P系统可在8N+2 d内完成N轮迭代基因敲除,而CRISPR-Cpf1系统可在5N+2d内完成N轮迭代基因无痕敲除,理论上还可以一次对多个靶位点进行编辑,效率更高,但存在同源重组效率较低、假阳性率高等缺点。【结论】与Cre/loxP系统相比,CRISPR-Cpf1辅助的同源重组基因敲除方法可省时、省力地实现基因的无痕敲除,理论上还可实现多个基因的同时敲除、总体效率更高,然而编辑效率还有提高的空间。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 菌株和质粒
•   1.2 培养条件
•   1.3 主要试剂和仪器
•   1.4 方法
•     1.4.1 Cre/loxP系统敲除质粒的构建
•     1.4.2 CRISPR-Cpf1系统敲除质粒的构建
•     1.4.3 Cre/loxP系统敲除方法
•     1.4.4 CRISPR-Cpf1系统敲除方法
•     1.4.5 构建重组菌
• 2 结果与分析
•   2.1 Cre/loxP系统敲除质粒的构建
•   2.2 Cre/loxP系统敲除菌株的构建
•   2.3 CRISPR-Cpf1系统敲除质粒的构建
•   2.4 CRISPR-Cpf1系统敲除菌体的构建
• 3 结论与讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 占米林,阚宝军,张辉,董晋军,许国超,韩瑞枝,倪晔

关键词: 谷氨酸棒状杆菌,同源重组,基因敲除

来源: 微生物学通报 2019年02期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室

基金: 国家自然科学基金(31601463),国家轻工技术与工程一流学科自主课题资助(LITE2018-07),江苏省六大人才高峰(2015-SWYY-008)~~

分类号: Q78

DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180225

页码: 278-291

总页数: 14

文件大小: 2188K

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