导读:本文包含了大片形吸虫论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:吸虫,大片,产物,受体,层析,蛋白,肽酶。
大片形吸虫论文文献综述
陆珂静,侯林静,朱彬,施维,梁艺颖[1]（2019）在《大片形吸虫感染及其分泌排泄产物对小鼠Toll样受体mRNA表达量的影响》一文中研究指出目的研究大片形吸虫感染及其分泌排泄产物对小鼠Toll样受体(TLRs) m RNA表达量的影响。方法 40只雌性BALB/c小鼠随机分为感染组和未感染组,每组20只。感染组每鼠经口灌喂大片形吸虫嚢蚴20个,未感染组经口灌喂等体积PBS,分别于感染后1、 4、 7、 14和28 d,每组各取4只小鼠进行剖杀。取小鼠肝脏组织,提取总RNA,逆转录为cDNA, qRT-PCR检测TLR1～9 mRNA的相对表达量。于感染的水牛肝脏中收集大片形吸虫虫体, PBS培养6 h,收集自然活性的大片形吸虫分泌排泄产物(n Fg ESP)。18只雌性BALB/c小鼠随机分为n Fg ESP组和PBS组,每组9只。n Fg ESP组每鼠经腹腔注射1 mg/ml n Fg ESP,对照组注射等量PBS,分别于注射后1、 4、 7 d,每组各取3只小鼠进行剖杀。取小鼠肝脏组织,提取总RNA,逆转录为cDNA, qRT-PCR检测TLR1～9 m RNA的相对表达量。将n Fg ESP溶液95℃热处理15 min,制备热灭活的大片形吸虫分泌排泄产物(hi Fg ESP);分别用含25、50、 100和200μg/ml n Fg ESP或hi Fg ESP的PBS体外刺激小鼠RAW264.7细胞24 h (细胞浓度为2×106个细胞/孔),设2个重复孔, 3次重复实验,以等体积PBS为空白对照;收集各组细胞,提取细胞总RNA,逆转录为cDNA, q RTPCR检测TLR1～9 mRNA的相对表达量。结果大片形吸虫感染小鼠实验结果显示,感染组小鼠7 d后肝脏组织中TLR6和TLR7的mRNA相对表达量分别为2.9±0.3和2.5±0.5,均高于未感染组(1.0±0.2和1.3±0.5)(P <0.01); 14 d后TLR1和TLR9的mRNA相对表达量分别为3.4±0.8和2.8±0.9,均高于未感染组(1.1±0.2和1.1±0.3)(P <0.05或P <0.01); 28 d后TLR1、 TLR8和TLR9的mRNA相对表达量分别为3.8±1.3、 4.2±1.5和3.1±0.9,均高于未感染组(1.0±0.2、 1.2±0.4和1.1±0.3)(P <0.01或P <0.05)。Fg ESP体内免疫小鼠实验结果显示, n Fg ESP注射1 d后,小鼠肝脏组织中TLR1和TLR2的mRNA相对表达量分别为2.5±0.4和1.9±0.4,均高于PBS组(1.0±0.1)(P <0.05或P <0.01)。Fg ESP体外刺激RAW264.7细胞实验结果显示, 100μg/ml n Fg ESP刺激下的TLR1、 TLR3、 TLR7和TLR8的mRNA相对表达量分别为1.6±0.0、 1.4±0.0、 1.6±0.0和1.9±0.0,均高于PBS组(1.0±0.0)(P <0.05或P <0.01); 200μg/ml n Fg ESP和hi Fg ESP刺激下的TLR8 mRNA相对表达量分别为3.4±0.0和4.0±0.5,均高于PBS组(1.0±0.0)(P <0.01); 100μg/ml hi Fg ESP刺激下的TLR2和TLR8的mRNA相对表达量分别为1.5±0.1和2.0±0.0,均高于PBS组(1.0±0.0)(P <0.01); 25μg/ml hi Fg ESP刺激下的TLR3m RNA相对表达量为0.6±0.0,低于PBS组(1.0±0.0)(P <0.01)。结论大片形吸虫可能通过其分泌排泄产物影响小鼠TLR1、 TLR7和TLR8的转录,对宿主免疫应答进行调控。(本文来源于《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》期刊2019年03期）
侯林静[2]（2019）在《大片形吸虫诊断抗原的制备及诊断方法的建立与优化》一文中研究指出本研究目的是从大片形吸虫分泌排泄产物(Fasciola gigantila Excretory-Secretory Products,FgESP)凝胶过滤层析组分及其鉴定蛋白成分中筛选出大片形吸虫病早期诊断抗原并建立诊断方法,为大片形吸虫病的诊治及开发早期诊断试剂盒奠定基础。本研究通过制备成虫FgESP,进行凝胶过滤层析,从中收集第一个波峰及其附近层析组分,依次命名为F1、F2、F3、……Fn等。以不同层析组分作为抗原,筛选出检测效果较优层析组分。同时将效果较好层析组分进行质谱分析,选取有潜在诊断价值的3个候选抗原进行原核表达。以较优层析组分作为诊断抗原与标准阳性和标准阴性水牛血清反应,建立并优化间接ELISA方法;分别将3个重组蛋白及其混合蛋白作为诊断抗原与标准阳性和标准阴性水牛血清及感染大片形吸虫4周小鼠血清反应,进行间接ELISA方法优化。应用优化好的ELISA方法检测0～14周水牛血清以及广西部分地区700份奶牛血清Ig G抗体水平,比较Fg ESP与较优层析组分作为诊断抗原的结果。本研究筛选检测效果较好层析组分为F21、F22与F23。将效果较好的层析组分进行质谱分析,结果含有硫氧还蛋白过氧化物酶1(Thioredoxin Peroxidase-1,TPx-1)、组织蛋白酶 B3(Cathepsin B3,Cat B3)和组织蛋白酶L1(Cathepsin L1,Cat L1)、热休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)和微管蛋白(Tubulin proteins)等潜在诊断价值的候选抗原。筛选出TPx-1、Cat B3和Cat L1作为诊断候选抗原,进行原核表达。FgTPx-1表达形式为可溶性蛋白和包涵体两种,FgCat B3和FgCat IL1表达形式均为包涵体。FgTPx-1、FgCat B3和FgCat L1重组蛋白分子量分别为46 kDa、40 kDa和39 kDa。效果较优的层析组分F22作诊断抗原的最优条件是包被浓度为0.157 μg/mL,水牛血清稀释倍数为1:400,二抗稀释倍数为1:40000,阴阳临界值为0.391。F22层析组分最优浓度为常用FgESP抗原用量(2.5 μg/mL)的1/16。通过间接ELISA优化结果显示FgTPx-1和FgCat B3单个蛋白对水牛阴阳性血清反应P/N值较小。FgTPx-1和FgCat B3浓度为1.25 μg/mL,小鼠血清稀释倍数为1:100时P/N值较大。FgCat L1用水牛血清和小鼠血清优化时,均在抗原浓度为0.157 μg/mL,血清比例为1:100时P/N值较大。混合蛋白浓度为0.313μg/mL,水牛血清比例为1:100时P/N值较大,混合蛋白浓度为1.25 μg/mL,小鼠血清比例为1:100时P/N值较大。混合蛋白与FgCat L1在0～14周实验感染水牛血清检测时,实验组OD450nm值整体呈上升趋势,混合蛋白阴阳性差值在1～8周检测时略低于FgCat L1。将FgESP、F22、FgCat IL1与混合蛋白进行间接ELISA诊断比较,用实验感染水牛第4周血清优化,F22层析组分在血清稀释比为1:400,P/N值最大,其次为FgESP。用水牛标准血清优化,4个诊断抗原P/N值均较大。用实验感染小鼠4周血清优化,F22层析组分在血清稀释比为1:400时,P/N值最大,4个诊断抗原阴阳性差异均较大。FgESP与小鼠血清灵敏性略低于其他蛋白,其中FgCat L1与混合蛋白作为诊断抗原时,阴阳性差异大,但两者P/N值较接近。F22检测水牛0～14周血清抗体水平结果为从第2周抗体水平明显开始升高,快速升至4周后呈平缓上升趋势,FgESP检测结果为从第2周抗体水平明显升高,抗体水平呈平缓上升趋势。抗F22-IgG水平均明显高于抗FgESP-IgG水平。FgESP和F22层析组分检测0～14周水牛血清的准确率为100%。普查广西部分地区700份奶牛血清,F22的阳性检出率为50.43%,FgESP的阳性检出率为45.29%。F22建立的间接ELISA方法效果较好。本研究发现有效层析组分主要集中于第一个峰、获得检测效果较优层析组分F22并建立了以层析组分F22为诊断抗原的间接ELISA方法。本研究原核表达的FgTPx-]、FgCat L1和FgCat B3叁种重组蛋白,可为进行进一步功能研究奠定基础。FgESP、F22和FgCat L1与混合蛋白对大片形吸虫病的诊断结果表明,F22、FgCat L1诊断效果较好,混合蛋白无明显优势,其中F22可进行水牛大片形吸虫病较早期诊断,为开发大片形吸虫病早期诊断试剂盒奠定基础。(本文来源于《广西大学》期刊2019-06-01）
袁晓丹[3]（2019）在《大片形吸虫两种ES产物的重组蛋白对山羊PBMCs功能的影响》一文中研究指出片形吸虫病(fascioliasis)是由片形科、片形属(Fasciola)吸虫,如大片形吸虫(Fasciola gigantica)、肝片形吸虫(Fasciola hepatica)及其中间型(intermediate form)的感染引起的一种人兽共患寄生虫病。大片形吸虫病分布于热带和亚热带地区,肝片形吸虫病主要分布于温带地区,给畜牧业生产带来巨大的经济损失,同时严重威胁公共卫生安全。钙结合蛋白(Calcium-binding protein,CaBp)属于蠕虫钙结合蛋白家族,具有钙结合位点,可通过与不同信号分子的结合在多种生物学过程中发挥作用,参与调节细胞存活、增殖、黏附、迁移、血管新生等多种肿瘤特征性生物学过程。亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidases,LAPs)是一种广泛存在于原核和真核细胞的金属蛋白酶,是从蛋白质和肽段切割N端残基而发挥作用的胞浆酶,具有消化、与宿主互作、蛋白质周转、肿瘤生长、组织侵袭和新陈代谢等多种功能。本实验通过采取形态学与分子生物学相结合的方法来进行大片形吸虫的鉴定。鉴定正确后,以肝片形吸虫CaBp2(Fh CaBp2)的序列为参考,对大片形吸虫CaBp2(FgCaBp2)基因进行克隆、生物信息学分析,重组FgCaBp2(rFgCaBp2)和重组FgLAP(r FgLAP)蛋白表达、纯化,实现两种蛋白的大量可溶性表达。两种重组蛋白经Western-blot分析,可识别人工感染大片形吸虫的山羊阳性血清和两种重组蛋白免疫家兔制备的多克隆抗体,分别在约23 ku和63 ku处出现特异性条带,证明它们具有作为大片形吸虫病诊断抗原的潜力。本实验进行了r FgCaBp2和rFgLAP对山羊外周血单个核细胞(PBMCs)功能的影响研究,包括与山羊PBMCs的特异性结合能力、细胞因子的分泌情况、总NO的产生、细胞增殖、细胞迁移和凋亡情况,以及对山羊单核细胞吞噬作用的影响。结果显示,间接免疫荧光实验(IFA)证明两种蛋白与山羊PBMCs有良好的结合作用;rFgCaBp2在低浓度时能显着抑制IFN-γ、IL-4和IL-10的分泌,但高浓度时显示促进作用,该蛋白极显着地促进TGF-β的分泌;rFgLAP在低浓度时显着促进TGF-β的分泌,但显着抑制IL-4、IL-10和IFN-γ的分泌;rFgCaBp2蛋白在低浓度时显着促进NO的产生,高浓度抑制NO的产生;r FgLAP低浓度时对其促进作用较弱,高浓度时显着促进NO的产生;两种蛋白都能显着促进山羊PBMCs的增殖;两种蛋白均显着促进迁移小室中山羊PBMCs的迁移;rFgCaBp2可抑制山羊PBMCs的凋亡,rFgLAP对其凋亡的抑制作用较弱;两种蛋白均可与山羊单核细胞作用,促进其吞噬功能。本实验获得了FgCaBp2与FgLAP重组蛋白,两种蛋白可被阳性血清所识别,表明其具有很强的免疫反应性;两种蛋白对山羊PBMCs的功能影响结果说明其具有免疫调节作用,推测这两种蛋白可能在大片形吸虫抗宿主免疫中起到重要的作用。本研究结果为进一步筛选大片形吸虫免疫诊断抗原、探索大片形吸虫ES蛋白与宿主的互作机制及大片形吸虫免疫逃避机制提供了重要参考。(本文来源于《黑龙江八一农垦大学》期刊2019-06-01）
方文,李天美,李婷,张剑萍,郝明明[4]（2019）在《大理地区大片形吸虫的最适中间宿主研究》一文中研究指出明确大理地区大片形吸虫的最适中间宿主,为制定防治措施提供依据。收集大片形吸虫虫卵,28℃孵育。每日定时吸取虫卵,观察其发育情况,直至孵出毛蚴。将3种实验用螺随机分为感染组和未感染组。感染组螺数量依次为:尖膀胱螺141只、椭圆萝卜螺240只和小土蜗251只;未感染组螺数量依次为:尖膀胱螺124只、椭圆萝卜螺136只和小土蜗87只。感染实验于24孔细胞培养板上进行,每孔加入数量比为1∶3的螺与毛蚴。感染4 h后将螺放入养螺盆,每盆放置48～60只螺,室温下饲养。未感染组螺直接放入养螺盆,与感染组螺同法饲养。每日挑拣死螺,显微镜下观察大片形吸虫幼虫发育情况,同时记录室温和水温。待螺体内的幼虫发育为子雷蚴(含尾蚴雏形),收集囊蚴。结果显示,毛蚴于第11天孵出。感染组螺中,尖膀胱螺、椭圆萝卜螺的最长存活时间为72 d,小土蜗的最长存活时间为53 d。期间测定的饲养室温为21℃～27℃(平均24℃),水温为21℃～25℃(平均23℃)。141只尖膀胱螺均为阴性,至感染后第72天,仍有12只存活;仅1只椭圆萝卜螺为阳性,于感染后第28天死亡,其余239只均为阴性,至感染后第72天,仍有36只存活。共检出112只阳性小土蜗,感染率为44.6%(112/251),至感染后第53天,全部死亡。未感染组螺中,尖膀胱螺、椭圆萝卜螺的最长存活时间为77 d,小土蜗的最长存活时间为57 d。124只尖膀胱螺均为阴性,至饲养第77天,有8只存活; 136只椭圆萝卜螺均为阴性,至饲养第77天,有30只存活; 87只小土蜗均为阴性,至饲养第57天全部死亡。所有阳性螺均未观察到胞蚴;仅有的1只阳性椭圆萝卜螺体内可观察到母雷蚴; 112只阳性小土蜗体内可观察到雷蚴、母雷蚴、子雷蚴和尾蚴。阳性小土蜗于感染后第11天可见雷蚴,第23天可见母雷蚴,第26天可见含不成熟尾蚴的子雷蚴,第30天可见含成熟尾蚴的子雷蚴,感染40天后死亡的阳性小土蜗软体中发现尾蚴。感染后第40天开始捡获囊蚴,持续11 d,共收获511个囊蚴,其中499个囊蚴(占97.7%)均于次日清晨8:00检获,剩余12个囊蚴(占2.3%)于其中4天下午(14:30～16:30)捡获,期间存活的小土蜗有29只,其中24只为阳性,占阳性螺总数的21.4%(24/112),每只阳性螺逸出尾蚴且形成囊蚴的平均数为21个(511/24)。大理地区大片形吸虫的最适中间宿主为小土蜗。(本文来源于《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》期刊2019年03期）
赵文苹,梅雪芳,施维,朱彬,侯林静[5]（2018）在《大片形吸虫排泄分泌产物对体外培养LO2人肝细胞的影响》一文中研究指出目的初步探讨大片形吸虫排泄分泌产物(FgESP)对体外培养LO2人肝细胞的增殖及对肝细胞损伤相关的生化指标的影响。方法将LO2人肝细胞分为5个密度组(1 000、 3 000、 5 000、 7 000、 10 000个/孔),铺于96孔板中,空白对照组只加入培养基,根据LO2细胞生长曲线选择最适细胞铺板密度。在96孔板中,以最适细胞密度铺板,分为0.02、 0.10、 0.20、 0.40、 1.00 mg/ml FgESP等5组,每组设4个重复,以PBS作为阴性对照组,在培养箱中孵育4、 8、 12、 24、 48和72 h后进行MTT细胞活性检测,测吸光度(A_(490)值)。在24孔板中,分为0.02、 0.10、 0.20、 0.40、 1.00 mg/ml FgESP等5组,每组设3个重复,以PBS作为阴性对照组,分别在培养4、 8、 12、 24、 48和72 h后,收集LO2细胞上清,测定碱性磷酸酶(ALP)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)的含量。采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析。结果根据LO2人肝细胞生长曲线,筛选出5 000个/孔为96孔板最佳铺板密度。FgESP作用72 h后, MTT细胞活性检测结果显示, 0.02、 0.10、 0.20、 0.40、 1.00 mg/ml FgESP等5组的A_(490)值分别为1.29±0.01、 1.28±0.06、1.13±0.08、 0.97±0.06、 0.25±0.01,均低于对照组(1.45±0.05)(P <0.01)。生化指标检测结果显示, 0.40、1.00 mg/ml FgESP作用细胞LO2人肝72 h后, ALT含量分别为2.00±0.00、 3.67±0.58, AST含量分别为5.33±0.58、7.67±0.58,均高于对照组的(P <0.01);作用48 h后, 1.00 mg/ml FgESP组ALT、 AST含量分别为2.00±0.00、7.00±0.00,高于对照组的0.33±0.58、 3.67±0.58 (P <0.01);在12～72 h内, 0.10、 0.20、 0.40、 1.00 mg/ml FgESP作用后ALP含量升高(P <0.01),而0.02 mg/ml FgESP仅在作用72 h后ALP含量升高(P <0.01);各实验组ALB含量与阴性对照组差异无统计学意义(P> 0.05)。结论 FgESP体外作用可抑制LO2人肝细胞增殖能力,且细胞增殖的抑制及损伤程度与FgESP的浓度相关。(本文来源于《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》期刊2018年06期）
陆珂静[6]（2018）在《大片形吸虫感染及其分泌排泄产物对小鼠Toll样受体表达影响的研究》一文中研究指出Toll样受体(TLRs)参与病原相关分子模式(PAMPs)和损伤相关分子模式(DAMPs),是固有免疫防御机制的第一道防线。寄生虫通过影响TLRs的表达和功能实现对宿主免疫应答的逃避或调控,研究大片形吸虫(Fasciolagigantica)及其分泌排泄产物(FgESP)对宿主或宿主免疫细胞TLR信号通路的作用,有助于揭示大片形吸虫早期感染固有免疫机制。本试验用大片形吸虫囊蚴人工感染BALB/c和C57BL/6两个品系实验小鼠不同天数后,ELISA检测小鼠血清抗体水平的动态变化,RT-qPCR检测肝组织TLR1～9和炎症因子的转录水平变化。结果表明大片形吸虫感染两种品系小鼠能引起不同类型的肝脏局部免疫应答,BALB/c以Th1/Th2混合应答为主,C57BL/6以Th1免疫应答为主。大片形吸虫感染两种品系小鼠后均能引起肝脏TLR1～9转录水平的动态变化,TLR1、TLR6、TLR7、TLR8均显着上调表达(P<0.05),其中TLR6最早发生上调,可能与脂肽类分子的特异性识别相关。两种小鼠处于Th1/Th2混合免疫应答时TLR1均显着上调,表明其可能起重要作用。用自然活性的FgESP(nFgESP)腹腔注射BALB/c和C57BL/6小鼠不同天数后,RT-qPCR检测小鼠肝脏TLR1～9和炎症因子的转录水平变化。结果表明nFgESP腹腔注射两种品系小鼠所致肝脏局部免疫类型倾向存在差异(BALB/c小鼠倾向于Th2,C57BL/6小鼠倾向于Th1型);FgESP能诱导TLR1、TLR2、TLR8的上调表达。用自然活性FgESP和热灭活的FgESP(hiFgESP)体外刺激小鼠RAW264.7传代巨噬细胞,RT-qPCR测定细胞TLR1～9和炎症因子的转录水平变化。结果表明nFgESP和hiFgESP刺激RAW264.7细胞均能引起 TLR1、TLR7、TLR8 的显着上调(P<0.05)和 TLR2、TLR3、TLR9的显着下调(P<0.05),可能与FgESP中非活性酶类物质相关;TLR4、TLR6在FgESP热灭活后无明显变化,可能与FgESP中活性酶类物质相关。综合比较FgESP体内、外刺激和大片形吸虫囊蚴人工感染小鼠后TLR1～9转录水平的变化,发现TLR1、TLR8基因水平均显着上调,推测TLR1、TLR8在大片形吸虫可能通过分泌FgESP调控宿主免疫应答的过程中可能发挥重要作用。本研究结果及讨论基于TLRs和细胞因子转录水平的变化,还需从蛋白水平进一步验证。对推测可能存在重要作用的TLR及其特异性蠕虫来源的配体进行筛查,深入研究宿主抗片形吸虫固有免疫机制,将为探索疫苗候选物和药物靶点提供理论依据,有助于更好的预防和控制片形吸虫病。(本文来源于《广西大学》期刊2018-06-01）
岳东梅[7]（2017）在《大片形吸虫ES与宿主互作抗原的筛选、鉴定及分析》一文中研究指出片形吸虫不仅感染牛羊等反刍动物,而且也可感染人体,严重威胁着人和动物的健康。因此,建立高效准确的诊断方法是防控该病的研究重点。片形吸虫包括肝片形吸虫、大片形吸虫及其中间型,目前对于大片形吸虫及其中间型的相关研究相对较少。因此,本研究选择大片形吸虫为研究对象,通过对大片形吸虫排泄分泌(ES)抗原与宿主的互作,旨在筛选、鉴定及分析出具有诊断潜力的蛋白,为建立大片形吸虫的诊断方法奠定基础。本研究分为叁部分。第一部分,对大片形吸虫的鉴定。首先,将采自广西南宁的144条片形吸虫虫体进行形态学鉴定和分子生物学鉴定。形态学鉴定这144条虫体均为片形吸虫。对这144条虫体的核糖体第二内转录间隔区(ITS-2)序列进行了扩增、测序,结果表明144个PCR样品的测序结果区别于肝片形吸虫及中间型,而均与大片形吸虫ITS-2序列(GenBank accession AJ557569)匹配率达99.7%,从而判定分离得到的144条片形吸虫均为大片形吸虫,不含中间型。第二部分,大片形吸虫ES抗原的制备及互作抗原的筛选。首先,利用体外培养方法收集大片形吸虫虫卵,对虫卵进行体外培养孵出毛蚴感染淡水螺,使其在淡水螺体内生长发育,直至尾蚴逸出螺体脱尾形成囊蚴,收集形成的囊蚴(感染虫卵后35 d),并进一步用囊蚴经口感染水牛(约500个囊蚴/头),在水牛感染后的14 d、42 d、70 d、98 d,分别采血制备血清。其次,利用体外培养方法分别收集大片形吸虫ES抗原,将收集的ES抗原免疫家兔制备阳性血清,用间接ELISA方法检测其抗体效价,结果表明ES抗原制备的阳性血清效价可达到1:1 000,说明大片形吸虫ES抗原的免疫原性较好,可用于后续的试验。然后,将大片形吸虫ES抗原分别与水牛各时间段的血清互作,通过免疫共沉淀和LC-MS/MS(质谱)试验,共获得了465个非冗余蛋白。进一步用BlastP同源性比对、UniProt鉴定,找到57个已知蛋白,分别在42 d、70 d和98 d的蛋白有13(22.8%)个、5(8.8%)个和7(12.3%)个,同时存在于42 d和70 d、70 d和98 d、42 d和98 d的可被鉴定的蛋白分别有8(14%)个、5(8.8%)、1(1.8%)个,同时存在于42 d、70 d和98 d可被鉴定的蛋白有18(31.6%)个。进一步用生物信息学分析,预测α-微管蛋白和亮氨酸氨肽酶等蛋白具有诊断价值。第叁部分,对筛选出的具有代表性的α-微管蛋白和亮氨酸氨肽酶进行克隆、原核表达,并探索其作为片形吸虫病诊断抗原的可行性。结果表明,成功克隆了片段长为1 356 bp、能编码452个氨基酸、理论分子量为48.99 kDa的α-微管蛋白基因和片段长为1 572 bp、能编码523个氨基酸、理论分子量为56.38 kDa的亮氨酸氨肽酶基因。这两个蛋白的二级结构预测都以无规卷曲为主,抗原表位在整个序列均有分布。叁级结构的主要功能区域都在N端。将α-微管蛋白基因插入载体pGEX-6P-1(+),亮氨酸氨肽酶基因插入载体pET-30a分别进行原核表达。发现经IPTG诱导表达的重组蛋白pGEX-6P-1(+)-FgAT分子量约为76 kDa(含载体携带的26 kDa的GST标签),且以融合蛋白形式表达,经Glutathione-Sepharose beads纯化后,获得了较高纯度的重组蛋白pGEX-6P-1(+)-FgAT;经IPTG诱导表达的重组蛋白pET-30a-FgLAP分子量约为56 kDa,以包涵体形式表达,经Ni-NTA His bind Resin纯化后获得较高纯度的重组蛋白pET-30a-FgLAP。这两个重组蛋白分别与大片吸虫ES抗原免疫家兔后制备的阳性血清、水牛感染大片吸虫不同期的阳性血清反应,经Western Blot分析证实均具有免疫反应性。本研究通过以上叁个部分的试验,成功鉴定出大片形吸虫ES抗原中与宿主互作的蛋白,包括465个非冗余蛋白。利用生物信息学分析,筛选出57个已知蛋白,并进一步鉴定出具有代表性的α-微管蛋白基因和亮氨酸氨肽酶基因。通过对这两个基因的克隆、表达及免疫反应性分析,推断出它们在大片形吸虫病诊断中具有很大的潜力。(本文来源于《黑龙江八一农垦大学》期刊2017-06-01）
张晓轩[8]（2017）在《甘肃省牦牛肝片形吸虫病血清学流行病学调查及不同发育期大片形吸虫转录组和MicroRNA组研究》一文中研究指出片形吸虫病是由片形吸虫(肝片形吸虫、大片形吸虫)感染引起的危害十分严重的人畜共患寄生虫病,给畜牧业带来重大经济损失。肝片吸虫病主要发生在温带地区,而大片形吸虫病主要发生在热带和亚热带地区。据统计,全世界240多万人感染,一亿八千万人存在感染风险。在我国,有大量关于肝片吸虫感染的病例报道,但是关于牦牛肝片吸虫感染的信息非常有限。此外,大片形吸虫是片形吸虫病的重要病原之一,但对大片形吸虫转录组、基因组及小RNA组等数据比较缺乏,影响了对该病致病机制的深入研究。因此,有必要对我国牦牛肝片形吸虫的感染情况进行流行病学调查并对不同发育期大片形吸虫转录组和小RNA组进行系统的研究。本研究应用ELISA方法对我国甘肃省玛曲县、碌曲县和天祝县牦牛肝片形吸虫的感染情况进行了调查。通过RNA-Seq高通量测序和生物信息学分析等不同的研究手段,对不同发育期大片形吸虫转录组及小RNA组进行了系统研究,鉴定出大片形吸虫不同发育期的转录组和小RNA组特异表达和差异表达的基因,并预测了其功能。结果显示:(1)本研究中的牦牛肝片形吸虫血清学总阳性率为28.7%(454/1,584),其中白牦牛阳性率为29.2%(284/974),黑牦牛阳性率为27.9%(170/610)。牦牛的年龄及季节与片形吸虫感染相关,是重要的风险因素。(2)通过RNA-Seq高通量测序和生物信息学分析等不同手段,对不同发育期大片形吸虫转录组进行了系统的研究,鉴定出不同发育期大片形吸虫unigenes共319261个,平均长度1038个核苷酸,N50值为1552。总共153573个unigenes注释到Nr(122405,38.34%),Nt(35756,11.91%),KOG(48889,15.31%),KO(32384,10.14%),Swiss-Prot(66543,20.84%),GO(86793,27.18%)和Pfam(86211,27%)数据库。鉴定出若干大片形吸虫不同发育期差异表达基因,其中毛蚴vs虫卵组29183个,雷蚴vs毛蚴组27341个,尾蚴vs雷蚴组323075个,囊蚴vs尾蚴组16388个,42天童虫vs囊蚴组30601个,70天童虫vs42天童虫组42个,成虫vs70天童虫组3847个。通过GO和KEGG富集分析发现两条排卵相关的信号通路(cGMP-PKG信号通路and TGF-β信号通路)。(3)通过RNA-Seq高通量测序和生物信息学分析等不同手段,对不同发育期大片形吸虫小RNA组进行了系统的研究,鉴定出160个大片形吸虫不同发育期差异表达miRNAs,毛蚴vs虫卵组69个,雷蚴vs毛蚴组59个,尾蚴vs雷蚴组95个,囊蚴vs尾蚴组44个,42天童虫vs囊蚴组95个,70天童虫vs42天童虫组35个,成虫vs70天童虫组39个。其中,24个已知miRNAs和126个新miRNAs。通过GO和KEGG富集分析鉴别出两个(sja-miR-1和sja-miR-7-5p)在成虫性成熟过程中起到至关重要的miRNAs。(4)通过对转录组和miRNA组数据进行关联分析发现,差异表达miRNA靶向的差异表达基因总共有毛蚴vs虫卵组8868个,雷蚴vs毛蚴组7792个,尾蚴vs雷蚴组11646个,囊蚴vs尾蚴组3025个,42天童虫vs囊蚴组11760个,70天童虫vs42天童虫组14个,成虫vs70天童虫组1097个。本研究首次对我国甘肃地区牦牛肝片形吸虫感染情况进行了血清学调查。同时,应用RNA-Seq技术、生物信息学技术等首次研究了大片形吸虫不同发育期转录组和小RNA组的变化,同时对mRNA和miRNA组数据进行了关联分析。研究结果为深入了解我国牦牛片形吸虫感染情况、阐明大片形吸虫感染性变化的分子基础及致病机制提供了重要基础数据。(本文来源于《吉林农业大学》期刊2017-05-01）
梅雪芳,全琛宇,盛兆安,施维,王冬英[9]（2017）在《大片形吸虫感染致小鼠肝损伤的动态变化》一文中研究指出为探讨非适宜宿主中大片形吸虫感染引起的肝脏病理改变和血清学变化的相互关系,本研究将72只4~5周龄SPF级雌性昆明小鼠随机分为2组:对照组24只,感染组48只,感染组每只小鼠感染大片形吸虫囊蚴15个。于感染后1、3、7、14、21、35、49和56天取小鼠肝脏及血清,观察肝脏表观病理变化,并测定血清中与肝功能密切相关的ALP、AST、ALT、TP、ALB、GLB等生化指标。结果显示感染后7天,肝脏肉眼可见轻微损伤,HE染色可见肝(本文来源于《第五届全国人畜共患病学术研讨会论文摘要集》期刊2017-04-21）
王华俊,刘宇,蒋薇,赵雪丽,曹伟伟[10]（2016）在《大片形吸虫免疫胶体金检测试纸条的研制及初步应用》一文中研究指出为建立一种快速、简便、适应现场应用的水牛大片形吸虫检测方法,本试验利用抗大片形吸虫ES抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株7D1和7D4分别制备和纯化得到单克隆抗体7D1和7D4;采用柠檬酸叁钠还原法制备颗粒大小为30 nm胶体金,再用胶体金标记纯化单克隆抗体7D1,在硝酸纤维素膜的质控带和检测带处分别包被羊抗鼠IgG二抗和单克隆抗体7D4,经反应条件优化,组装成了大片形吸虫免疫检测试纸条。经测试该检测试纸条对ES抗原的检测下限为0.94μg/mL,与胰扩盘吸虫、前后盘吸虫、支原体、弓形虫、伊氏锥虫VSG抗原均无交叉反应,特异性较好。采集广西地区334份水牛新鲜粪样并用试纸条检测,阳性率为38.62%。结果表明,试纸条方法操作简单、快速、易于判定,特异性好,敏感性高,适合基层大面积普查和现场检测检测大片形吸虫。(本文来源于《中国畜牧兽医学会生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十二次学术研讨会论文集》期刊2016-10-19）
大片形吸虫论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本研究目的是从大片形吸虫分泌排泄产物(Fasciola gigantila Excretory-Secretory Products,FgESP)凝胶过滤层析组分及其鉴定蛋白成分中筛选出大片形吸虫病早期诊断抗原并建立诊断方法,为大片形吸虫病的诊治及开发早期诊断试剂盒奠定基础。本研究通过制备成虫FgESP,进行凝胶过滤层析,从中收集第一个波峰及其附近层析组分,依次命名为F1、F2、F3、……Fn等。以不同层析组分作为抗原,筛选出检测效果较优层析组分。同时将效果较好层析组分进行质谱分析,选取有潜在诊断价值的3个候选抗原进行原核表达。以较优层析组分作为诊断抗原与标准阳性和标准阴性水牛血清反应,建立并优化间接ELISA方法;分别将3个重组蛋白及其混合蛋白作为诊断抗原与标准阳性和标准阴性水牛血清及感染大片形吸虫4周小鼠血清反应,进行间接ELISA方法优化。应用优化好的ELISA方法检测0～14周水牛血清以及广西部分地区700份奶牛血清Ig G抗体水平,比较Fg ESP与较优层析组分作为诊断抗原的结果。本研究筛选检测效果较好层析组分为F21、F22与F23。将效果较好的层析组分进行质谱分析,结果含有硫氧还蛋白过氧化物酶1(Thioredoxin Peroxidase-1,TPx-1)、组织蛋白酶 B3(Cathepsin B3,Cat B3)和组织蛋白酶L1(Cathepsin L1,Cat L1)、热休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)和微管蛋白(Tubulin proteins)等潜在诊断价值的候选抗原。筛选出TPx-1、Cat B3和Cat L1作为诊断候选抗原,进行原核表达。FgTPx-1表达形式为可溶性蛋白和包涵体两种,FgCat B3和FgCat IL1表达形式均为包涵体。FgTPx-1、FgCat B3和FgCat L1重组蛋白分子量分别为46 kDa、40 kDa和39 kDa。效果较优的层析组分F22作诊断抗原的最优条件是包被浓度为0.157 μg/mL,水牛血清稀释倍数为1:400,二抗稀释倍数为1:40000,阴阳临界值为0.391。F22层析组分最优浓度为常用FgESP抗原用量(2.5 μg/mL)的1/16。通过间接ELISA优化结果显示FgTPx-1和FgCat B3单个蛋白对水牛阴阳性血清反应P/N值较小。FgTPx-1和FgCat B3浓度为1.25 μg/mL,小鼠血清稀释倍数为1:100时P/N值较大。FgCat L1用水牛血清和小鼠血清优化时,均在抗原浓度为0.157 μg/mL,血清比例为1:100时P/N值较大。混合蛋白浓度为0.313μg/mL,水牛血清比例为1:100时P/N值较大,混合蛋白浓度为1.25 μg/mL,小鼠血清比例为1:100时P/N值较大。混合蛋白与FgCat L1在0～14周实验感染水牛血清检测时,实验组OD450nm值整体呈上升趋势,混合蛋白阴阳性差值在1～8周检测时略低于FgCat L1。将FgESP、F22、FgCat IL1与混合蛋白进行间接ELISA诊断比较,用实验感染水牛第4周血清优化,F22层析组分在血清稀释比为1:400,P/N值最大,其次为FgESP。用水牛标准血清优化,4个诊断抗原P/N值均较大。用实验感染小鼠4周血清优化,F22层析组分在血清稀释比为1:400时,P/N值最大,4个诊断抗原阴阳性差异均较大。FgESP与小鼠血清灵敏性略低于其他蛋白,其中FgCat L1与混合蛋白作为诊断抗原时,阴阳性差异大,但两者P/N值较接近。F22检测水牛0～14周血清抗体水平结果为从第2周抗体水平明显开始升高,快速升至4周后呈平缓上升趋势,FgESP检测结果为从第2周抗体水平明显升高,抗体水平呈平缓上升趋势。抗F22-IgG水平均明显高于抗FgESP-IgG水平。FgESP和F22层析组分检测0～14周水牛血清的准确率为100%。普查广西部分地区700份奶牛血清,F22的阳性检出率为50.43%,FgESP的阳性检出率为45.29%。F22建立的间接ELISA方法效果较好。本研究发现有效层析组分主要集中于第一个峰、获得检测效果较优层析组分F22并建立了以层析组分F22为诊断抗原的间接ELISA方法。本研究原核表达的FgTPx-]、FgCat L1和FgCat B3叁种重组蛋白,可为进行进一步功能研究奠定基础。FgESP、F22和FgCat L1与混合蛋白对大片形吸虫病的诊断结果表明,F22、FgCat L1诊断效果较好,混合蛋白无明显优势,其中F22可进行水牛大片形吸虫病较早期诊断,为开发大片形吸虫病早期诊断试剂盒奠定基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
大片形吸虫论文参考文献
[1].陆珂静,侯林静,朱彬,施维,梁艺颖.大片形吸虫感染及其分泌排泄产物对小鼠Toll样受体mRNA表达量的影响[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志.2019
[2].侯林静.大片形吸虫诊断抗原的制备及诊断方法的建立与优化[D].广西大学.2019
[3].袁晓丹.大片形吸虫两种ES产物的重组蛋白对山羊PBMCs功能的影响[D].黑龙江八一农垦大学.2019
[4].方文,李天美,李婷,张剑萍,郝明明.大理地区大片形吸虫的最适中间宿主研究[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志.2019
[5].赵文苹,梅雪芳,施维,朱彬,侯林静.大片形吸虫排泄分泌产物对体外培养LO2人肝细胞的影响[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志.2018
[6].陆珂静.大片形吸虫感染及其分泌排泄产物对小鼠Toll样受体表达影响的研究[D].广西大学.2018
[7].岳东梅.大片形吸虫ES与宿主互作抗原的筛选、鉴定及分析[D].黑龙江八一农垦大学.2017
[8].张晓轩.甘肃省牦牛肝片形吸虫病血清学流行病学调查及不同发育期大片形吸虫转录组和MicroRNA组研究[D].吉林农业大学.2017
[9].梅雪芳,全琛宇,盛兆安,施维,王冬英.大片形吸虫感染致小鼠肝损伤的动态变化[C].第五届全国人畜共患病学术研讨会论文摘要集.2017
[10].王华俊,刘宇,蒋薇,赵雪丽,曹伟伟.大片形吸虫免疫胶体金检测试纸条的研制及初步应用[C].中国畜牧兽医学会生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十二次学术研讨会论文集.2016
论文知识图
