嗜热菌属Caldicellulosiruptor sp.F32半纤维素水解酶的生化表征及木质素降解细菌筛选

论文摘要

我国拥有丰富的生物质资源,其中在陆地木质纤维素生物质资源中,其主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素三种多聚物。纤维素主要是由葡萄糖以β-1,4葡萄糖醛酸键连接组成,结构较为简单,进行生物降解较为容易。而半纤维素和木质素则由多种化学结构单体通过不同的化学键组成,因此降解过程较为复杂,研究进展较为缓慢。在本论文中将重点关注半纤维素中的β-1,3-1,4葡聚糖的水解以及木质素降解细菌筛选的研究。β-1,3-1,4葡聚糖广泛分布于禾本植物中,主要以β-1,3和β-1,4两种葡萄糖醛酸键随机组成。为将其完全水解,就需要将β-1,3-1,4葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶配合使用。本文将来自极端嗜热菌Caldicellulosiruptor sp.F32中两个不同的β-1,3-1,4葡聚糖酶（F32EG5和Lam16A-GH）,和一个β-葡萄糖苷酶BlgA进行大肠杆菌异源重组表达,得到这三种酶的重组蛋白。对其之间的协同效果及水解终产物耐受性进行了表征,探究其在小麦麸皮水解过程中的实际作用。同时,表征了含有不同底物结合模块数量的Lam16A蛋白,以获得更好底物结合能力的Lam16A蛋白。此外,从天牛消化道中筛选分离出了一株可能存在芬顿反应机制的木质素降解菌Pantoea。F32EG5与Lam16A-GH均为双功能糖苷水解酶,与典型的β-1,3或β-1,4葡聚糖酶相比,他们具有新颖的酶切位点,将二者组合水解β-1,3-1,4葡聚糖,可增加组分中低聚寡糖的比例。将BlgA分别与二者复配水解β-1,3-1,4葡聚糖,与单独使用时相比,β-葡萄糖苷酶的加入显著增加可发酵单糖的含量。此外,F32EG5与Lam16A-GH对于常见的β-葡聚糖酶活性抑制剂葡萄糖与纤维二糖表现出一定的耐受性,表现为在添加终浓度10 g/L的葡萄糖与纤维二糖时,并未明显影响其水解作用。BlgA对生物转化过程中常见的终产物如阿拉伯糖、木糖在500 mmol/L浓度下残余酶活均超过60%。揭示了其作为复合酶系一份子水解纤维素、半纤维素过程中的潜在应用价值。含有6个底物结合区域的全长Lam16A蛋白,催化效率为Lam16A-GH的近七倍,提供了β-1,3-1,4葡聚糖酶应用化的额外选择。从亚洲长角天牛（Anoplophora glabripennis）的消化道中分离得到的木质素降解菌Pantoea sp.Anop（暂命名）是一类革兰氏阴性肠杆菌,可利用碱性木质素为单一碳源生长,并可能存在芬顿化学反应协助的木质素降解机制,为发掘木质素降解酶提供新的种质资源。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 引言
•   1.2 生物质的加工与利用
•   1.3 木质纤维素
•     1.3.1 物理化学方法预处理生物质
•     1.3.2 生物方法预处理生物质
•   1.4 木质纤维素降解酶
•     1.4.1 降解纤维素和半纤维素的糖苷水解酶
•     1.4.2 嗜热糖苷水解酶
•   1.5 Caldicellulosiruptor菌属木质纤维素降解酶
•   1.6 木质素降解酶
•     1.6.1 木质纤维素降解细菌Pantoea
•   1.7 立题意义
•   1.8 研究内容
• 第二章 Caldicellulosiruptor sp.F32 菌属半纤维素酶的表征
•   2.1 引言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 菌种与培养基
•     2.2.2 仪器与试剂
•     2.2.3 缓冲液
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 重组蛋白的表达纯化
•     2.3.2 酶活测定
•     2.3.3 酶解产物测定
•     2.3.4 测定从小麦麸皮释放的还原糖含量
•   2.4 实验结果
•     2.4.1 蛋白表达纯化
•     2.4.2 水解产物分析
•     2.4.3 复配后酶活变化分析
•     2.4.4 F32EG5 对小麦麸皮的水解作用
•     2.4.5 葡萄糖与纤维二糖对F32EG5及Lam16A水解大麦β-葡聚糖的影响
•   2.5 小结
• 第三章 Caldicellulosiruptor菌属来源糖苷水解酶相互间协同性分析
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 菌种与培养基
•     3.2.2 仪器与试剂
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 重组蛋白的表达纯化
•     3.3.2 BlgA酶活测定
•     3.3.3 BlgA与 F32EG5与Lam16A水解产物分析
•     3.3.4 BlgA对底物耐受性分析
•     3.3.5 F32EG5、XynA、XynF复配水解小麦麸皮还原糖释放量测定
•   3.4 实验结果
•     3.4.1 蛋白表达纯化
•     3.4.2 BlgA与 F32EG5及Lam16A-GH水解产物分析
•     3.4.3 葡萄糖、阿拉伯糖、木糖对BlgA活性影响
•     3.4.4 F32EG5与XynF、XynA复配组合降解小麦麸皮的分析
•   3.5 讨论
• 第四章 Lam16A中 CBM模块对底物结合的作用初探
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 菌种与培养基
•     4.2.2 仪器与试剂
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 目标基因的生物信息学分析
•     4.3.2 质粒构建与蛋白表达纯化
•     4.3.3 酶活力及动力学参数
•     4.3.4 酶解产物分析
•   4.4 实验结果
•     4.4.1 PCR产物
•     4.4.2 重组蛋白的表达纯化
•     4.4.3 重组蛋白的酶学性质
•     4.4.4 重组蛋白的水解产物
•   4.5 讨论
• 第五章 木质素降解菌株的筛选
•   5.1 引言
•   5.2 材料与方法
•     5.2.1 仪器与试剂
•     5.2.2 培养基
•     5.2.3 天牛来源与解剖
•     5.2.4 木质素降解菌筛选
•     5.2.5 木质素降解菌的鉴定与传代
•     5.2.6 Pantoea菌生长曲线测定
•     5.2.7 Pantoea sp.Anop菌降解木质素产物测定
•   5.3 实验结果
•     5.3.1 木质素降解菌的鉴定
•     5.3.2 生长曲线
•     5.3.3 木质素降解产物分析
•   5.4 讨论
• 第六章 结论与展望
•   6.1 结论
•   6.2 展望
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 冯杰

导师: 张培玉

关键词: 葡聚糖,水解作用,糖苷水解酶,木质素降解细菌

来源: 青岛大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 青岛大学

分类号: Q93

DOI: 10.27262/d.cnki.gqdau.2019.001339

总页数: 62

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