一种评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒论文和设计

全文摘要

本实用新型公开了一种评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒，属于试剂盒技术领域。所述试剂盒包括盒体和盒盖,盒体由两个均呈半圆柱形对称设计的第一盒体和第二盒体组成；第一盒体和所述第二盒体均包括一个平面侧面和一个半圆弧形侧面，内部均为空腔且均设有用于放置试剂瓶的泡沫垫，顶部均敞口；第一盒体的平面侧面和第二盒体的平面侧面通过卡带可拆卸连接组成一个呈圆柱形的盒体；盒盖由分别与第一盒体和第二盒体匹配盖合连接的第一盒盖和第二盒盖组成。本实用新型的试剂盒，结构简单、设计合理，能满足铅暴露人群心血管疾病检测的要求。

主设计要求

1.一种评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒，其特征在于，包括盒体(1)和盒盖(2),所述盒体(1)由两个均呈半圆柱形对称设计的第一盒体(3)和第二盒体(4)组成；所述第一盒体(3)和所述第二盒体(4)均包括一个平面侧面(5)和一个半圆弧形侧面(6)，内部均为空腔且均设有用于放置试剂瓶的泡沫垫(7)，顶部均敞口；所述第一盒体(3)的平面侧面(5)和所述第二盒体(4)的平面侧面(5)通过卡带(8)可拆卸连接组成一个呈圆柱形的所述盒体(1)；所述盒盖(2)由分别与所述第一盒体(3)和所述第二盒体(4)匹配盖合连接的第一盒盖(9)和第二盒盖(10)组成。

设计方案

2.根据权利要求1所述的评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒，其特征在于，位于所述第一盒体(3)内部的所述泡沫垫(7)上开设有5个用于分别放置20×红细胞裂解液试剂瓶(11)、10×白细胞裂解液试剂瓶(12)和SDS溶液试剂瓶(13)且与上述物品的高度相适配的第一腔体；位于所述第二盒体(4)内部的所述泡沫垫(7)上开设有13个分别放置TE试剂瓶(14)、蛋白酶K试剂瓶(15)、内参基因上游引物的试剂瓶(16)、mtDNA上游引物试剂瓶(17)、内参基因下游引物的试剂瓶(18)、mtDNA下游引物试剂瓶(19)和Subgreen试剂瓶(20)且与上述物品的高度相适配的第二腔体。

3.根据权利要求2所述的评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒，其特征在于，所述20×红细胞裂解液试剂瓶(11)为2支，每支各50mL；所述10×白细胞裂解液试剂瓶(12)为1支，10mL；所述SDS溶液试剂瓶(13)为2支，每支各2mL；所述TE试剂瓶(14)为1支，1mL；所述蛋白酶K试剂瓶(15)为2支，每支各1mL；所述内参基因上游引物的试剂瓶(16)为1支，100mg；所述mtDNA上游引物试剂瓶(17)为1支，100mg；所述内参基因下游引物的试剂瓶(18)为1支，100mg；所述mtDNA下游引物试剂瓶(19)为1支，100mg；所述Subgreen试剂瓶(20)为6支，每支各1mL。

4.根据权利要求1所述的评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒，其特征在于，所述卡带(8)的数量至少为2个，分别相对卡接住所述第一盒体(3)和所述第二盒体(4)的半圆弧形侧面(6)的两端边缘处。

5.根据权利要求4所述的评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒，其特征在于，每个所述卡带(8)的两端分别固设有卡扣(21)，在所述第一盒体(3)和所述第二盒体(4)的半圆弧形侧面(6)的两端边缘处分别设有与所述卡扣(21)相配合的卡槽(22)。

6.根据权利要求1所述的评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒，其特征在于，所述第一盒盖(9)的一端通过第一转轴(23)与所述第一盒体(3)的一端可转动地连接，所述第一盒盖(9)的另一端设有第一凸起(24)，所述第一盒体(3)的另一端设有与所述第一凸起(24)相配合的第一通孔(25)。

7.根据权利要求1所述的评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒，其特征在于，所述第二盒盖(10)的一端通过第二转轴(26)与所述第二盒体(4)的一端可转动地连接，所述第二盒盖(10)的另一端设有第二凸起(27)，所述第二盒体(4)的另一端设有与所述第二凸起(27)相配合的第二通孔(28)。

设计说明书

技术领域

本实用新型涉及一种评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒，属于试剂盒技术领域。

背景技术

铅是传统的环境污染物，可以通过多途径引起广谱毒性反应，在世界范围内受其影响的个体数量巨大，使得该广泛存在的毒物成为全球性社会健康问题。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)已经把铅确定为引起重大公共卫生关注的十种化学品之一。大量证据表明，长期低水平的铅暴露是造成一系列不良健康状况的重要风险因素，可以扰乱血脂，升高血压，影响凝血功能等。并且儿童对铅中毒易感，经消化道摄入的铅，婴幼儿和儿童吸收率可达50％，而正常成人仅10％。2013年10月WHO公共卫生和环境司司长玛丽亚·内拉在声明中说，“对全球儿童而言，铅中毒仍是最重要的环境卫生担忧之一”。铅暴露会增加心血管疾病的发病率，是独立的心血管疾病风险因素。对30项涉及60,000名参与者的独立研究进行的Meta分析表明，血铅和血压升高或高血压具有明显相关性，收缩压和血铅升高成2倍关系。此外铅暴露还与其他临床心血管疾病终点相关，如冠状动脉心脏病、中风和外周动脉疾病等。大量动物实验和机制研究也支持该流行病学结果，并提出几个可能的原因包括氧化应激，一氧化氮系统，免疫系统、血管激素异常以及细胞内Ca ^{2+<\/sup>平衡紊乱等。}

目前已经有多疾病将mtDNA作为心血管疾病的生物标志进行了研究，mtDNA的变化作为生物标志物具有独特的优势。线粒体对外界变化反应灵敏，在心血管疾病发病早期就会出现变化。同时线粒体与心血管系统密切相关，无论是高能耗富含线粒体的心肌细胞还是调节血管功能的内皮细胞线粒体，其自身功能紊乱或疾病的发生会引发线粒体的快速变化。mtDNA的检测方法所需样本量少，仅需50ng外周血全基因组DNA，检测速度快，实时定量PCR方法仅需1.5个小时左右。mtDNA的检测方法已经逐步成熟并标准化，目前已经研发了高通量的检测技术。因而外周血mtDNA可能成为未来铅暴露造成的心血管疾病的可靠的生物标志物之一。

目前，市面上并没有专门评估评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒。鉴于此，有必要提供一种评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒，以解决现有技术的不足。

实用新型内容

本实用新型的目的之一，提供一种评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒。本实用新型的试剂盒，盒体为分离式，由两个分别独立的第一盒体和第二盒体可拆卸地连接，第一盒体和第二盒体内部分别存放不同环境要求的试剂瓶，结构简单、设计合理，能满足铅暴露人群心血管疾病检测的要求。

本实用新型解决上述技术问题的技术方案如下：一种评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒，包括盒体和盒盖,所述盒体由两个均呈半圆柱形对称设计的第一盒体和第二盒体组成；所述第一盒体和所述第二盒体均包括一个平面侧面和一个半圆弧形侧面，内部均为空腔且均设有用于放置试剂瓶的泡沫垫，顶部均敞口；所述第一盒体的平面侧面和所述第二盒体的平面侧面通过卡带可拆卸连接组成一个呈圆柱形的所述盒体；所述盒盖由分别与所述第一盒体和所述第二盒体匹配盖合连接的第一盒盖和第二盒盖组成。

本实用新型的原理：

第一点，盒体为分离式，由两个均呈半圆柱形、独立的第一盒体和第二盒体可拆卸地组成。其中，第一盒体内部放置4℃保存的试剂瓶，具有常温保存试剂的功能；第二盒体内部放置-20℃保存的试剂瓶，具有低温保存试剂的功能。第一盒体和第二盒体既可分别独立存放不同环境要求的试剂，还能连为一体，非常地便捷。

第二点，盒体为两个半圆柱形组成的圆柱形，美观大方，区别于传统的方形盒体，能给操作者良好的视觉体验。

在上述技术方案的基础上，本实用新型还可以做如下改进。

进一步，位于所述第一盒体内部的所述泡沫垫上开设有5个用于分别放置20×红细胞裂解液试剂瓶、10×白细胞裂解液试剂瓶和SDS溶液试剂瓶且与上述物品的高度相适配的第一腔体；位于所述第二盒体内部的所述泡沫垫上开设有13个分别放置TE试剂瓶、蛋白酶K试剂瓶、内参基因上游引物的试剂瓶、mtDNA上游引物试剂瓶、内参基因下游引物的试剂瓶、mtDNA下游引物试剂瓶和Subgreen试剂瓶且与上述物品的高度相适配的第二腔体。

采用上述进一步的有益效果是：本实用新型的试剂盒，包含了从血样DAN提取到mtDNA定量测定的整套试剂，方便操作者使用，无须再从别处拿取试剂，便捷灵敏。此外，在泡沫垫上上设置腔体，既可容纳试剂瓶，又可固定住试剂瓶，能避免在运输环节对试剂瓶可能造成的破损，安全性更高。

更进一步，所述20×红细胞裂解液试剂瓶为2支，每支各50mL；所述10×白细胞裂解液试剂瓶为1支，10mL；所述SDS溶液试剂瓶为2支，每支各2mL；所述TE试剂瓶为1支，1mL；所述蛋白酶K试剂瓶为2支，每支各1mL；所述内参基因上游引物的试剂瓶为1支，100mg；所述mtDNA上游引物试剂瓶为1支，100mg；所述内参基因下游引物的试剂瓶为1支，100mg；所述mtDNA下游引物试剂瓶为1支，100mg；所述Subgreen试剂瓶为6支，每支各1mL。

采用上述更进一步的有益效果是：各试剂瓶分别采用上述容量数值，可以满足至少300次的检测需求。

进一步，所述卡带的数量至少为2个，分别相对卡接住所述第一盒体和所述第二盒体的半圆弧形侧面的两端边缘处。

采用上述更进一步的有益效果是：采用卡带，可以实现第一盒体和第二盒体的可拆卸连接，在实际操作中更加便捷灵活。

更进一步，每个所述卡带的两端分别固设有卡扣，在所述第一盒体和所述第二盒体的半圆弧形侧面的两端边缘处分别设有与所述卡扣相配合的卡槽。

采用上述更进一步的有益效果是：卡带的两端分别通过卡扣与卡槽可拆卸地连接，从而实现第一盒体和第二盒体可拆卸地连接，在实际操作中更加便捷灵活。

进一步，所述第一盒盖的一端通过第一转轴与所述第一盒体的一端可转动地连接，所述第一盒盖的另一端设有第一凸起，所述第一盒体的另一端设有与所述第一凸起相配合的第一通孔。

采用上述进一步的有益效果是：第一转轴的上端连接第一盒盖，第一转轴的下端连接第一盒体。将第一凸起从第一通孔里拔出，将第一盒盖向远离平面侧面的方向旋转，可以打开第一盒体，从中取出试剂瓶。将第一盒盖向靠近平面侧面的方向旋转，将第一凸起嵌入到第一通孔里，通过第一凸起和第一通孔的卡接，可以关闭第一盒体，密封效果好，不会造成试剂瓶的散落。

进一步，所述第二盒盖的一端通过第二转轴与所述第二盒体的一端可转动地连接，所述第二盒盖的另一端设有第二凸起，所述第二盒体的另一端设有与所述第二凸起相配合的第二通孔。

采用上述进一步的有益效果是：第二转轴的上端连接第二盒盖，第二转轴的下端连接第二盒体。将第二凸起从第二通孔里拔出，将第二盒盖向远离平面侧面的方向旋转，可以打开第二盒体，从中取出试剂瓶。将第二盒盖向靠近平面侧面的方向旋转，将第二凸起嵌入到第二通孔里，通过第二凸起和第二通孔的卡接，可以关闭第二盒体，密封效果好，不会造成试剂瓶的散落。

本实用新型的目的之二，是提供上述评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒的使用方法。本实用新型的试剂盒，仅需要抽取200μl-300μl的微量外周血，即可提取全基因组DNA，能简便快速检测针对铅暴露引起的心血管功能变化的特异性指标mtDNA的变化，具有操作简单、灵敏性高、特异性强等特点，且检测结果准确、客观、快捷。

本实用新型解决上述技术问题的技术方案如下：一种上述评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

步骤1：将20×红细胞裂解液按体积比1:19的比例，加入无菌双蒸水进行稀释，得到1×红细胞裂解液；将10×白细胞裂解液按体积比1:9的比例，加入无菌双蒸水进行稀释，得到1×白细胞裂解液；

步骤2：将mtDNA上游引物、mtDNA下游引物、内参基因上游引物、内参基因下游引物分别用无菌双蒸水溶解至终浓度均为10ng\/μl，分别得到mtDNA上游引物工作液、mtDNA下游引物工作液、内参基因上游引物工作液、内参基因下游引物工作液；

步骤3：取200-300μl待测人员的EDTA抗凝的外周血，置于离心管中，加入3ml步骤1得到的1×红细胞裂解液,盖上盖子上下颠倒至少20次，混匀至透亮，于3600rpm离心2min；

步骤4：弃上清，加入3ml步骤1得到的1×红细胞裂解液,盖上盖子上下颠倒至少20次，混匀至透亮，于3600rpm离心2min；

步骤5：重复2-4次步骤4，直至离心后离心管中的上清液无色且管底部团块呈白色；

步骤6：向离心管中加入1ml步骤1得到的1×白细胞裂解液，吹悬团块，将所有液体转移至1.5ml EP管中，3600rpm离心2min，弃上清，将EP管倒置于吸水纸上至无液体；

步骤7：向EP管中加入500μl步骤1得到的1×白细胞裂解液，涡旋，起团块；

步骤8：加入20μl质量百分数为10％的SDS，37℃孵育1h，期间每隔10min颠倒，仍可见团块；

步骤9：加入30μl的10mg\/ml蛋白酶K,吹打混匀，55℃，孵育过夜；

步骤10：每个EP管中加入700μl异丙醇，颠倒混匀20次，至出现明显的白色絮状沉淀，12000rpm离心8min，弃上清；

步骤11：加入1.5ml质量百分数为70％的乙醇，将EP管底的团块弹起后上下颠倒20次，10000rpm离心3min，弃上清；

步骤12：重复1次步骤11；

步骤13：将EP管倒置于吸水纸上至无液体，室温干燥2-3min，加40μl TE溶解,提取得到DNA；

步骤14：将步骤13提取得到的DNA，配制成QRT-PCR体系反应液，进行实时荧光定量PCR扩增反应，分析结果。

在上述技术方案的基础上，本实用新型还可以做如下改进。

进一步，步骤14中，所述QRT-PCR体系的具体组成为：

2×SYBR Green Mixture，5μl；ddH _{2<\/sub>O，12μl；10ng\/μl的mtDNA上游引物工作液或者10ng\/μl的内参基因上游引物工作液，1μl；10ng\/μl的mtDNA下游引物工作液或者10ng\/μl的内参基因下游引物工作液，1μl；50ng\/μl的待测人员的EDTA抗凝的外周血提取的DNA，1μl。}

更进一步，所述mtDNA上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述mtDNA下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示；所述内参基因上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述内参基因下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

所述mtDNA上游引物F:5’-TGGCCATGGGTATGTTGTTA-3’(SEQ ID NO.1)；

所述mtDNA下游引物R:5’-CACCCAAGAACAGGGTTTGT-3’(SEQ ID NO.2)。

所述内参基因上游引物F:5’-CACCAACTTCATCCACGTTCACC-3’(SEQ ID NO.3)；

所述内参基因下游引物R:5’-GCTTCTGACACAACTGTGTTCAC-3’(SEQ ID NO.4)。

进一步，步骤14中，所述实时荧光定量PCR扩增反应的程序为：55℃，10min；95℃变性30s，然后按95℃×30s，55℃×30s，72℃×60s，40个循环。

本实用新型的有益效果：

(1)本实用新型的试剂盒，盒体为分离式，由两个分别独立的第一盒体和第二盒体可拆卸地连接，第一盒体和第二盒体内部分别存放不同环境要求的试剂瓶，结构简单、设计合理，能满足铅暴露人群心血管疾病检测的要求。

(2)本实用新型的试剂盒，包含了从血样DAN提取到mtDNA定量测定的整套试剂，且目前市面上没有针对mtDNA定量测定的试剂，方便操作者使用，无须再从别处拿取试剂，便捷灵敏。

(3)本实用新型的试剂盒，结构简单、设计合理、容易制造，市场前景广阔，适合规模化推广应用。

(4)本实用新型提供了一种可以快速、准确评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒，填补了市场空白，满足了医疗系统的迫切需求。

(5)采用本实用新型的试剂盒，仅需要抽取200μl-300μl的微量外周血，即可提取全基因组DNA，能简便快速检测针对铅暴露引起的心血管功能变化的特异性指标mtDNA的变化，具有操作简单、灵敏性高、特异性强等特点，且检测结果准确、客观、快捷。

附图说明

图1为本实用新型的评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒的整体结构图。

图2为图1拆分打开后的俯视图。

图3为图1闭合后的俯视图。

附图中，各标号所代表的部件列表如下：

1、盒体；2、盒盖；3、第一盒体；4、第二盒体；5、平面侧面；6、半圆弧形侧面；7、泡沫垫；8、卡带；9、第一盒盖；10、第二盒盖；11、20×红细胞裂解液试剂瓶；12、10×白细胞裂解液试剂瓶；13、SDS溶液试剂瓶；14、TE试剂瓶；15、蛋白酶K试剂瓶；16、内参基因上游引物的试剂瓶；17、mtDNA上游引物试剂瓶；18、内参基因下游引物的试剂瓶；19、mtDNA下游引物试剂瓶；20、Subgreen试剂瓶；21、卡扣；22、卡槽；23、第一转轴；24、第一凸起；25、第一通孔；26、第二转轴；27、第二凸起；28、第二通孔。

图4为采用本实用新型的评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒检测得到的铅职业暴露人群外周血mtDNA图。

具体实施方式

以下结合具体附图对本实用新型的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本实用新型，并非用于限定本实用新型的范围。

实施例

本实施例的评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒，包括盒体1和盒盖2,所述盒体1由两个均呈半圆柱形对称设计的第一盒体3和第二盒体4组成；所述第一盒体3和所述第二盒体4均包括一个平面侧面5和一个半圆弧形侧面6，内部均为空腔且均设有用于放置试剂瓶的泡沫垫7，顶部均敞口；所述第一盒体3的平面侧面5和所述第二盒体4的平面侧面5通过卡带8可拆卸连接组成一个呈圆柱形的所述盒体1；所述盒盖2由分别与所述第一盒体3和所述第二盒体4匹配盖合连接的第一盒盖9和第二盒盖10组成。

第二点，盒体为两个半圆柱形组成的圆柱形，美观大方，区别于传统的方形盒体，能给操作者良好的视觉体验。

其中，位于所述第一盒体3内部的所述泡沫垫7上开设有5个用于分别放置20×红细胞裂解液试剂瓶11、10×白细胞裂解液试剂瓶12、和SDS溶液试剂瓶13且与上述物品的高度相适配的第一腔体；位于所述第二盒体4内部的所述泡沫垫7上开设有13个分别放置TE试剂瓶14、蛋白酶K试剂瓶15、内参基因上游引物的试剂瓶16、mtDNA上游引物试剂瓶17、内参基因下游引物的试剂瓶18、mtDNA下游引物试剂瓶19和Subgreen试剂瓶20且与上述物品的高度相适配的第二腔体。本实用新型的试剂盒，包含了从血样DAN提取到mtDNA定量测定的整套试剂，方便操作者使用，无须再从别处拿取试剂，便捷灵敏。此外，在泡沫垫上上设置腔体，既可容纳试剂瓶，又可固定住试剂瓶，能避免在运输环节对试剂瓶可能造成的破损，安全性更高。

所述20×红细胞裂解液试剂瓶11为2支，每支各50mL；所述10×白细胞裂解液试剂瓶12为1支，10mL；所述SDS溶液试剂瓶13为2支，每支各2mL；所述TE试剂瓶14为1支，1mL；所述蛋白酶K试剂瓶15为2支，每支各1mL；所述内参基因上游引物的试剂瓶16为1支，100mg；所述mtDNA上游引物试剂瓶17为1支，100mg；所述内参基因下游引物的试剂瓶18为1支，100mg；所述mtDNA下游引物试剂瓶19为1支，100mg；所述Subgreen试剂瓶20为6支，每支各1mL。各试剂瓶分别采用上述容量数值，可以满足至少300次的检测需求。

所述卡带8的数量至少为2个，分别相对卡接住所述第一盒体3和所述第二盒体4的半圆弧形侧面6的两端边缘处。采用卡带，可以实现第一盒体和第二盒体的可拆卸连接，在实际操作中更加便捷灵活。

每个所述卡带8的两端分别固设有卡扣21，在所述第一盒体3和所述第二盒体4的半圆弧形侧面6的两端边缘处分别设有与所述卡扣21相配合的卡槽22。卡带的两端分别通过卡扣与卡槽可拆卸地连接，从而实现第一盒体和第二盒体可拆卸地连接，在实际操作中更加便捷灵活。

所述第一盒盖9的一端通过第一转轴23与所述第一盒体3的一端可转动地连接，所述第一盒盖9的另一端设有第一凸起24，所述第一盒体3的另一端设有与所述第一凸起24相配合的第一通孔25。第一转轴的上端连接第一盒盖，第一转轴的下端连接第一盒体。将第一凸起从第一通孔里拔出，将第一盒盖向远离平面侧面的方向旋转，可以打开第一盒体，从中取出试剂瓶。将第一盒盖向靠近平面侧面的方向旋转，将第一凸起嵌入到第一通孔里，通过第一凸起和第一通孔的卡接，可以关闭第一盒体，密封效果好，不会造成试剂瓶的散落。

所述第二盒盖10的一端通过第二转轴26与所述第二盒体4的一端可转动地连接，所述第二盒盖10的另一端设有第二凸起27，所述第二盒体4的另一端设有与所述第二凸起27相配合的第二通孔28。第二转轴的上端连接第二盒盖，第二转轴的下端连接第二盒体。将第二凸起从第二通孔里拔出，将第二盒盖向远离平面侧面的方向旋转，可以打开第二盒体，从中取出试剂瓶。将第二盒盖向靠近平面侧面的方向旋转，将第二凸起嵌入到第二通孔里，通过第二凸起和第二通孔的卡接，可以关闭第二盒体，密封效果好，不会造成试剂瓶的散落。

上述评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

步骤4：弃上清，加入3ml步骤1得到的1×红细胞裂解液,盖上盖子上下颠倒至少20次，混匀至透亮，于3600rpm离心2min；

步骤5：重复2-4次步骤4，直至离心后离心管中的上清液无色且管底部团块呈白色；

步骤7：向EP管中加入500μl步骤1得到的1×白细胞裂解液，涡旋，起团块；

步骤8：加入20μl质量百分数为10％的SDS，37℃孵育1h，期间每隔10min颠倒，仍可见团块；

步骤9：加入30μl的10mg\/ml蛋白酶K,吹打混匀，55℃，孵育过夜；

步骤10：每个EP管中加入700μl异丙醇，颠倒混匀20次，至出现明显的白色絮状沉淀，12000rpm离心8min，弃上清；

步骤11：加入1.5ml质量百分数为70％的乙醇，将EP管底的团块弹起后上下颠倒20次，10000rpm离心3min，弃上清；

步骤12：重复1次步骤11；

步骤13：将EP管倒置于吸水纸上至无液体，室温干燥2-3min，加40μl TE溶解,提取得到DNA；

步骤14：将步骤13提取得到的DNA，配制成QRT-PCR体系反应液，进行实时荧光定量PCR扩增反应，保存熔解曲线和数据，分析结果。其中，所述QRT-PCR体系的具体组成为：

所述mtDNA上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述mtDNA下游引物的序列如SEQID NO.2所示；所述内参基因上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述内参基因下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

所述mtDNA上游引物F:5’-TGGCCATGGGTATGTTGTTA-3’(SEQ ID NO.1)；

所述mtDNA下游引物R:5’-CACCCAAGAACAGGGTTTGT-3’(SEQ ID NO.2)。

所述内参基因上游引物F:5’-CACCAACTTCATCCACGTTCACC-3’(SEQ ID NO.3)；

所述内参基因下游引物R:5’-GCTTCTGACACAACTGTGTTCAC-3’(SEQ ID NO.4)。

所述实时荧光定量PCR扩增反应的程序为：55℃，10min；95℃变性30s，然后按95℃×30s，55℃×30s，72℃×60s，40个循环。

实验例

采用本实用新型的评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒，进行铅暴露人群心血管疾病的诊断。使用横断面研究设计，包括总计395名受试者，229名铅暴露人群来源于某铅酸蓄电池厂。根据血铅浓度将铅暴露人群划分为低铅和高铅暴露组。对照组包括166名同一公司非接铅岗位的健康受试者。在进行研究前，每个参与者都签订了知情同意书。全部实验都遵从机构指导说明，实验方案由中山大学伦理委员会批准。

得到的实验结论如表1和图4所示。

表1实验人群一般特征

注：a为ANOVA方差分析，b为x检验。

由表1中对照组和铅职业暴露人群的全血中线粒体DNA拷贝数，进行分析。方法如下：每个标本重复三个复孔，CT值差值在0.3内，取平均值；外周血线粒体DNA拷贝数2^{-ΔΔCt<\/sup>(ΔCt＝Ct_{ND<\/sub>-1-Ct_{HGB<\/sub>)根据结果，取线粒体DNA拷贝数中位数作为高低之分。}}}

实验结果表明，应用本实用新型的试剂盒，通过实时定量PCR方法检测在外周血中线粒体DNA表达情况发现，在临床样本中，发生铅暴露人群的外周血线粒体DNA拷贝数明显低于非铅暴露人群。并且铅暴露人群具有心血管相关指标变化，表明外周血中线粒体DNA拷贝数与职业铅暴露人群明显相关。

由此可见，本实用新型提供了一种可以快速、准确评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒，填补了市场空白，满足了医疗系统的迫切需求。而且，本实用新型的试剂盒，仅需要抽取200μl-300μl的微量外周血，即可提取全基因组DNA，能简便快速检测针对铅暴露引起的心血管功能变化的特异性指标mtDNA的变化，具有操作简单、灵敏性高、特异性强等特点，且检测结果准确、客观、快捷。

以上所述仅为本实用新型的较佳实施例，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。

设计图

一种评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒论文和设计

一种评估铅暴露人群心血管疾病的试剂盒论文和设计

全文摘要

主设计要求

设计方案

设计说明书

设计图

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