慢病毒介导的人p53基因过表达及稳定感染细胞系的建立

论文摘要

p53基因作为肿瘤抑制的关键基因,主要功能是修复与细胞周期G、S期有关的DNA损伤,并且在DNA损伤严重时诱导受损细胞的凋亡。因此,p53基因在维持基因组的稳定与预防癌症发生方面具有重要的作用。在等摩尔比例下,具有正确DNA结合结构域的野生型p53蛋白比突变型p53蛋白活性更强,野生型p53蛋白不仅可以抑制突变型p53蛋白的获得性功能,而且可以诱导由突变型p53蛋白引起的肿瘤细胞的凋亡。由于在所有恶性肿瘤中,该基因的突变率在50%以上。因此,p53基因及其表达产物可以起到预防肿瘤细胞发生和发展的重要作用。本研究设计并构建了两种慢病毒表达载体pWPI-p53WT-Neo和pWPI-PTEN-Neo,并将上述两种慢病毒载体和包装质粒（packaging plasmids）组成的包装系统共转染293T细胞,收集慢病毒颗粒并测定pWPI-p53慢病毒和pWPI-PTEN慢病毒的滴度。按实验设计流程将两种病毒感染靶细胞CF-1,利用G418筛选出稳定细胞系后收集细胞内蛋白质样品。然后,通过Western Blot实验对收集到的CF-1-p53细胞和CF-1-p53-PTEN细胞内的蛋白质样品进行检测。实验结果表明慢病毒介导的人p53基因在CF-1细胞系中能够过表达p53蛋白,并且慢病毒介导的人p53基因和PTEN基因共同导入CF-1细胞系中也能过量表达p53蛋白,但是与慢病毒介导人p53基因的单独导入CF-1细胞相比产生的p53蛋白较少。上述实验结果证明本研究成功建立了人p53基因稳定表达细胞系。本研究还通过细胞计数法检测p53基因和PTEN基因表达后对细胞生长的影响。实验结果发现慢病毒介导的人p53基因的导入会对CF-1细胞的生长产生抑制作用,而慢病毒介导的人p53基因和慢病毒介导的PTEN基因的同时导入同样会对CF-1细胞的生长产生抑制作用,并且抑制细胞生长的程度比慢病毒介导的人p53基因单独导入的细胞更加强烈。上述实验结果表明,CF-1-p53-PTEN细胞系较CF-1-p53细胞系中p53蛋白的过表达量少,可能是因为PTEN基因与p53基因的同时过表达对细胞生长的抑制作用引起的。综上所述,本论文成功构建了慢病毒表达载体pWPI-p53WT-Neo和pWPI-PTEN-Neo,并利用G418筛选出pWPI-p53慢病毒和pWPI-PTEN慢病毒感染的稳定细胞系CF-1-p53和CF-1-p53-PTEN。通过Western Blot实验成功检测到两种细胞内p53蛋白的过量表达,并且利用细胞生长曲线的测定证明p53和PTEN基因的过量表达对CF-1细胞生长的影响。本论文为利用p53基因治疗癌症提供了重要的实验基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 第一章 综述
•   1 p53基因的发现
•   2 p53基因的分子结构及功能
•     2.1 p53基因的结构
•     2.2 p53基因的功能
•   3 p53基因抑制肿瘤发生和发展的作用机制
•     3.1 p53基因调节细胞新陈代谢的途径
•     3.2 p53调节细胞自噬
•   4 人p53基因临床治疗癌症的研究进展
•     4.1 利用人p53基因进行治疗的癌症类型
•     4.2 人p53基因相关药物的研发进展
•   5 选题依据与研究意义
• 第二章 人p53和PTEN基因的慢病毒表达载体的构建及病毒包装
•   前言
•   1 实验材料与试剂
•     1.1 实验材料
•     1.2 实验试剂
•   2 实验方法
•     2.1 目的基因的获得
•     2.2 重组慢病毒载体的构建
•     2.3 慢病毒重组质粒DNA的制备
•     2.4 重组慢病毒的包装及收集
•     2.5 病毒滴度的检测
•   3 实验结果
•     3.1 重组质粒PCR鉴定结果
•     3.2 台盼蓝染色结果
•     3.3 病毒滴度计算及差异性分析
• 第三章 慢病毒感染稳定CF-1细胞系的构建及p53蛋白的表达分析
•   前言
•   1 实验材料与试剂
•     1.1 实验材料
•     1.2 实验试剂
•   2 实验方法
•     2.1 细胞培养
•     2.2 病毒感染
•     2.3 稳定感染细胞系的筛选
•     2.4 Western Blot实验检测蛋白质样品的含量
•   3 实验结果
• 第四章 人p53和PTEN基因过表达对CF-1细胞生长的影响
•   前言
•   1 实验材料和试剂
•   2 实验方法
•   3 实验结果
•     3.1 细胞生长曲线的绘制
•     3.2 细胞生长差异性比较
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈醒

导师: 杨桂文,张刚

关键词: 基因,慢病毒载体,滴度,细胞

来源: 山东师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 山东师范大学

分类号: Q78

总页数: 58

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