一、人类γδT细胞细胞毒活性的调控机制和作用途径（论文文献综述）
黄超[1]（2021）在《肺癌肿瘤微环境的系统解析及靶向中药发现》文中研究表明实体肿瘤并不是单独存在的一团癌细胞,而是嵌入于一个由浸润和驻留宿主细胞组成的肿瘤微环境中。肿瘤微环境并不是沉默的旁观者,而且是癌症进展的积极推动者,并且是肿瘤治疗的关键靶点。其中最引人注目的是免疫检查点阻断治疗,它通过恢复肿瘤浸润免疫细胞的抗肿瘤免疫力,在多种晚期癌症中产生了持久甚至治愈的治疗效果。然而,仅有少部分的患者能从中获益。因而需要新的技术和方法来阐明肿瘤与肿瘤微环境相互作用,以发现免疫检查点阻断治疗响应的标记物、新的微环境靶点和药物。在此,以中国发病率和死亡率第一癌症——肺癌为例,通过整合高精度的单细胞测序数据和大规模转录组数据,构建了一个高精度的肺腺癌和肺鳞癌的肿瘤微环境细胞图谱,涵盖了1141个样本的39个细胞类型的丰度。借此,阐明了各细胞类型与肿瘤临床特征、预后的相关性,分析了潜在的免疫治疗靶点和免疫治疗响应的生物标记物,构建了以肿瘤微环境细胞图谱为基础的肿瘤预后模型,最后通过整合系列药理学分析技术形成了一个新的系统药理学方法,明确了苦参靶向肿瘤微环境抑制肺腺癌的作用机制。具体内容包括:一、为了在高精度水平下解析肺癌肿瘤微环境与预后等临床特征以及免疫治疗的相关性,利用一个先进的贝叶斯模型以高精度的单细胞测序数据为先验信息,从1141个肺腺癌和肺鳞癌转录组数据中解析了39个细胞类型的丰度,形成了一个全面的肺癌肿瘤微环境细胞图谱。借此开展了系列分析,包括:1)关联了不同细胞类型与肺癌的临床特征;2)分析了MAGEA3疫苗治疗在非小细胞肺癌中失败的原因以及PD-1/PD-L1通路阻断治疗响应的生物标记细胞。结果表明,构建的肺癌肿瘤微环境图谱不仅能够解释已知的关于肺癌微环境的知识,还发现了系列新的细胞类型与肿瘤发展及治疗的关系。二、构建了一个以肿瘤微环境细胞图谱为基础的肿瘤预后模型（TMERS）,该模型能够准确预测肺腺癌和肺鳞癌的预后,并且证明TMERS独立于经典的肿瘤预后因素（肿瘤分期、年龄、性别、吸烟行为、常见的基因突变）。该项研究表明肿瘤微环境的细胞组成是影响肿瘤预后的重要因素,TMERS可作为一个肺癌预后预测的有效补充。三、最后,整合肺癌肿瘤微环境细胞图谱、系统生物学和药理学方法形成了一个新颖的系统药理学方法来发现增强PD-1/PD-L1阻断治疗的多靶点天然产物。以此明确了苦参中氧化苦参碱促进CD8+T细胞在肿瘤微环境浸润和协同PD-L1抑制剂抗癌的作用。主要内容包括:1)通过ADME参数评估,筛选了苦参潜在的活性成分的;2)预测潜在活性成分的靶点,明确了靶点在抗肿瘤和免疫调节方面的潜在作用;3)基于靶点与肺腺癌的临床特征以及免疫表型关联,明确了氧化苦参碱增加肺腺癌CD8+T细胞浸润的潜在作用;4)动物实验验证氧化苦参碱可以增强肿瘤微环境中CD8+T细胞的浸润协同PD-L1抑制剂抑制小鼠肺腺癌生长的作用。综上所述,本研究通过利用单细胞测序数据来研究肿瘤微环境及其与癌细胞的相互作用,构建了一个高精度的肺癌肿瘤微环境图谱,为指导癌症疫苗治疗和免疫检查点疗法的有效性提供参考,并为预测肺癌预后和治疗药物提供重要资源。
王明哲[2]（2021）在《固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究》文中指出背景:慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD）是一种以持续呼吸道症状和气流受限为特征的疾病,通常是由于明显暴露于有毒颗粒或气体引起的气道和/或肺泡异常所致,其发病机制目前尚未完全阐明,临床疗效欠佳。目前对于COPD的治疗主要以对症治疗为主,治疗效果不理想且需要终身控制疾病的发展。中医以整体观念、辨证施治为纲,可以通过“扶正”、“固卫”起到未病先防,已病防变的作用,从而更好的预防和控制COPD的发生与发展。“固本止咳中药”源于国医大师、中医内科呼吸病专家晁恩祥教授多年诊治COPD的临床经验。晁恩祥教授十分重视人体正气在疾病发病和病情进展中的地位和作用,强调“正气存内,邪不可干”,提出“扶正固卫”理论,因而以经典方剂“玉屏风散”为基础,加减化裁创制固本止咳中药。前期临床研究表明,固本止咳中药在改善患者肺功能等方面有较好效果,并可通过调控T细胞亚群发挥调节人体免疫功能的作用。大量的前期动物实验表明,固本止咳中药可改善COPD模型小鼠肺功能情况、呼吸道病理损伤及炎性因子的过度表达、并降低肺组织αβT细胞/γδT细胞比例、增加肺组织中KGF,KGFR蛋白和基因表达含量等。因此,进一步开展固本止咳中药治疗COPD模型小鼠的疗效及作用机制研究具有一定的意义。目的:损伤修复是在各类细胞生长因子共同作用下的协调有序过程,分为炎症反应、细胞增殖、基质沉积及组织重塑四个时期。呼吸道损伤修复是COPD的主要发病机制之一,贯穿了慢阻肺疾病的全程。本研究从呼吸道的黏膜炎症损伤修复、呼吸道结构损伤修复及异常的呼吸道损伤修复这三个方面入手,研究固本止咳中药对于COPD呼吸道损伤修复的调控作用,从而更好的阐释中医“扶正固卫”、“肺主皮毛”的理论。方法:本研究将100只健康ICR小鼠按体重随机分为空白组（n=30）、模型COPD组（n=35）和固本止咳中药组（n=35）。除正常对照组以外,其余各组均被制成COPD模型。本研究采用被动吸烟加鼻腔滴入LPS的方法进行COPD小鼠造模。治疗组于第61天开始予固本止咳中药灌胃,空白对照组和模型对照组使用蒸馏水以同样方法灌胃,共28天。第一部分:体重监测和肺功能检测明确COPD模型小鼠的模型制备情况和固本止咳中药的药效。在固本止咳中药对COPD模型小鼠的呼吸道黏膜炎性损伤修复的调控作用研究方面,本研究首先通过抗体芯片法对小鼠呼吸道40种炎性因子进行系统检测,并采用免疫组化法对抗体芯片结果中COPD组明显变化和固本止咳中药组发挥明显调控作用的炎性因子进行验证。在固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道结构损伤修复的调控以及对异常的损伤修复的作用研究方面,本研究通过病理学评判、免疫组化法和透射电镜进行检测,以判断香烟烟雾暴露+LPS滴鼻对小鼠呼吸道结构、肺泡结构、细胞外基质和Ⅱ型上皮细胞的结构损伤情况以及固本止咳中药对COPD模型对相应结构损伤修复及异常的损伤修复的调控情况。第二部分:基于质谱技术,对固本止咳中药的成分分析研究,从固本止咳中药的化学成分入手,探讨其发挥损伤修复作用机制的原理。此外,本研究对各组小鼠肺组织进行label-free蛋白组学检测,明确固本止咳中药治疗COPD模型小鼠的靶点及通路。阐释其对于COPD模型小鼠呼吸道损伤修复多成分-多靶点-多通路整体调控的机制。第三部分:基于western-blot和RT-qPCR技术,对第一部分和第二部分结果富集出现的JAK-STAT信号通路进行验证研究,对通路中JAK1,p-JAK1,STAT3,p-STAT3和SOCS3的蛋白表达水平以及JAK1 mRNA,JAK2mRNA,JAK3mRNA,STAT1 mRNA,STAT3 mRNA,SOCS3mRNA的表达水平进行测定。结果:1)体重监测:固本止咳中药可改善COPD模型小鼠体重增长缓慢的情况。2)肺功能检测:COPD 组较空白组 FEV 0.05,FEV0.1,FEV0.2,PEF,Crs,Cst均明显下降（P<0.01）;Rrs,Ers,Rn均明显升高（P<0.01）;G,H均无统计学差异（P>0.05）。固本止咳中药组较COPD组FEV0.05,FEV0.1,FEV0.2,Crs均明显升高（P<0.05）;Rrs,Ers,Rn均明显下降（P<0.05）;PEF,G,H,Cst均无统计学差异（P>0.05）。3)病理形态学:HE染色结果表明,COPD组小鼠病理形态符合COPD的特征,固本止咳中药可改善COPD模型小鼠50-100μm直径气道、呼吸性细支气管和肺泡的病理形态。透射电镜结果表明,COPD组小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞板层小体出现空泡化,线粒体肿胀,嵴断裂或消失。固本止咳中药组小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞部分板层小体出现空泡化,线粒体肿胀,但程度与COPD组相比明显减轻。4)抗体芯片检测:在40个炎性因子中,COPD组与空白组相比,共有8个显着升高的炎性因子,分别为 IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-3,IL-17 和 IL-12p70（P<0.05）;固本止咳中药组与COPD组相比,共有7个显着降低的因子,分别为IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-3 和 TCA-3（P<0.05）。5)免疫组化检测:与空白组相比,COPD组IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,α-SMA,MMP-9,TIMP-1,MMP-9/TIMP-1,HIF-1α 在肺组织中的表达均明显升高（P<0.05）。与 COPD 组相比,固本止咳中药组 IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,α-SMA,MMP-9,TIMP-1,MMP-9/TIMP-1,HIF-1α在肺组织中的表达均明显下降（P<0.05）。空白组和COPD组,固本止咳中药组与COPD组之间Collegen 1均无统计学差异（P>0.05）。6)中药成分分析:共鉴定出固本止咳中药的41个成分,其中的多种成分被证明可通过抗炎、抗氧化、抑制气道重塑等参与呼吸道损伤修复的调控。7)label-free蛋白组学检测:在COPD组和空白组之间共发现287个差异蛋白,固本止咳中药组和COPD组之间共发现184个差异蛋白。通过对差异蛋白的GO富集分析、KEGG富集分析和REACTOME富集分析发现:固本止咳中药可通过中性粒细胞脱颗粒、补体通路、细胞外基质、JAK-STAT信号通路等多个途径以及多个参与COPD进展的生物标志物,从整体上参与COPD呼吸道损伤修复的调控。8)JAK-STAT信号通路的实验:本研究通过RT-PCR法对各组小鼠肺组织JAK1,JAK2,JAK3,STAT1,STAT3和SOCS3进行了测定,结果表明:与空白组相比,COPD模型小鼠肺组织中 JAK1 mRNA,JAK2 mRNA,JAK3 mRNA,STAT3 mRNA 和 SOCS3 mRNA表达均明显升高（P<0.05）,STAT1 mRNA两组间无统计学差异（P>0.05）。与COPD组相比,固本止咳中药组小鼠肺组织中JAK1 mRNA,STAT3 mRNA表达明显下降（P<0.05）,且 SOCS3 mRNA 表达明显升高（P<0.05）,JAK2mRNA,JAK3 mRNA,STAT1 mRNA与COPD组相比均无统计学差异（P>0.05）。本研究采用western-blot法对各组小鼠肺组织JAK1,p-JAK1,STAT3,p-STAT3,SOCS3进行测定。与空白组相比,COPD 模型小鼠肺组织中 p-JAK1,p-STAT3,p-JAK1/JAK1,p-STAT3/STAT3 明显升高（P<0.05）;JAK1,STAT3,SOCS3与空白组相比均无统计学差异（P>0.05）。与COPD组相比,固本止咳中药组小鼠肺组织中p-JAK1,p-STAT3,p-STAT3/STAT3明显降低（P<0.05）,SOCS3 明显升高（P<0.05）;JAK1,STAT3,P-JAK1/JAK1 与 COPD组相比均无统计学差异（P>0.05）。结论:1)固本止咳中药可通过减少COPD模型小鼠肺组织炎性因子的过度表达,发挥调控呼吸道黏膜炎症损伤修复的作用;并通过改善COPD模型小鼠呼吸道结构、肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构以及细胞外基质的损伤,发挥调控呼吸道结构损伤修复和减少异常的呼吸道损伤修复的作用。体现了中医扶正固卫,肺主皮毛的理论。2)固本止咳中药在COPD损伤修复机制的整体调控中具有多成分-多靶点-多通路的特点,体现了中医整体观念的特点。3)固本止咳中药可通过下调JAK1和STAT3的磷酸化水平,上调SOCS3的表达从而抑制JAK-STAT信号通路。是固本止咳中药基于扶正固卫、肺主皮毛理论调控呼吸道损伤修复在机制上的具体体现。
赵亚楠[3]（2021）在《NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究》文中研究说明第一部分 NLRP3炎症小体介导的免疫抑制在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的作用和机制研究研究背景:弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是最常见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin lymphoma,NHL）,占所有NHL的30-35%。利妥昔单抗联合化疗作为一线治疗手段显着提高了疗效,但仍有三分之一以上的患者难治或复发。90%的难治/复发病例不能通过常规挽救化疗和自体干细胞移植得到缓解。免疫疗法近年来在肿瘤治疗领域取得重要进展,例如免疫检查点阻断剂（ICB）、CAR-T疗法等,已在多种实体瘤中取得一定的疗效,但在DLBCL患者中反应欠佳。因此,探索DLBCL发病过程中调节免疫稳态的相关机制,评估高危因素,对于提高DLBCL的治疗效果十分重要。炎症反应是肿瘤发生的关键因素之一。炎症小体可介导炎性细胞因子释放,产生炎症级联反应,促进形成适合肿瘤细胞生长的炎性微环境。NLRP3炎性小体是研究最广泛的炎症小体,外来病原体入侵或体内细胞的损伤和死亡,可招募、组装并激活NLRP3炎症小体,活化caspase-1,切割IL-1β和IL-18前体,产生有活性的IL-1β和IL-18,从而介导机体的免疫应答,促进机体清除病原体和内源性损伤。此外,NLRP3炎症小体在肿瘤的发生发展中起着重要的调节作用。既往研究表明,NLRP3炎症小体在乳腺癌、纤维肉瘤和胃癌等多种恶性肿瘤中发挥促癌作用,并且NLRP3及其效应细胞因子IL-1β和IL-18可促进免疫抑制性肿瘤微环境形成,参与肿瘤的免疫逃逸。因此,NLRP3炎症小体诱导的免疫抑制可能是肿瘤发生的机制之一。本课题组前期研究发现,初诊NHL患者血清中IL-18升高,治疗缓解后降低;且淋巴瘤细胞株中的NLRP3炎症小体可被活化,伴随NLRP3炎症小体相关基因的表达升高。然而,NLRP3炎症小体在DLBCL发病中的作用尚不清楚。肿瘤细胞可通过多种方式抑制机体的抗肿瘤免疫应答,逃逸宿主的免疫监视。免疫检查点是免疫细胞或肿瘤细胞上表达的调节免疫稳态的分子,对防止自身免疫反应过度激活起着重要作用。然而,肿瘤中过度表达的免疫检查点可使机体免疫功能受到抑制,导致肿瘤的免疫逃逸,例如肿瘤细胞表达的程序性细胞死亡配体1（PD-L1）,与活化T细胞上表达的程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）结合并传递抑制性信号,诱导肿瘤免疫耐受。免疫抑制也是淋巴系统恶性肿瘤发生发展的重要因素之一。研究表明,恶性B淋巴细胞可通过高表达PD-L1逃避免疫监视。另外,肿瘤免疫微环境还存在髓系来源的抑制细胞（MDSCs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）及调节性T细胞（Tregs）等抑制免疫功能的细胞。研究证实,DLBCL中MDSCs可通过IL-10、S100A12及PD-L1介导T细胞功能抑制。近期研究报道,NLRP3炎症小体/IL-1β途径可促进头颈部鳞状细胞癌的肿瘤发生,阻断该途径延缓了肿瘤生长,并伴随着效应T细胞数量的增加和免疫抑制性细胞的减少。鉴于NLRP3炎症小体在肿瘤发生和免疫抑制中的重要作用,我们推测,DLBCL中NLRP3炎症小体异常活化通过介导肿瘤免疫逃逸促进淋巴瘤发生发展。目前,DLBCL中免疫抑制的调节机制尚不明确,对于DLBCL中NLRP3炎症小体的作用及免疫调节机制的深入认识,有助于识别新的生物标志物,逆转免疫抑制状态,并改善DLBCL患者免疫治疗反应。研究目的:本课题拟研究NLRP3炎症小体在DLBCL发病中的作用及其对肿瘤免疫应答的影响,分析其与临床特征和预后的相关性;体内验证NLRP3炎症小体对淋巴瘤小鼠发病的影响;探讨NLRP3炎症小体对T细胞表型和功能的影响及其参与淋巴瘤免疫抑制的作用及机制;探索NLRP3抑制剂对免疫检查点阻断疗法的影响。预期目标的实现,将揭示NLRP3炎症小体介导的免疫失衡在DLBCL发生发展中的作用及机制,为DLBCL提供新的预后标志物和治疗靶点。研究方法:1.收集35例初诊DLBCL肿瘤组织和35例正常淋巴组织（14例扁桃体组织,7例腋窝淋巴结,7例支气管淋巴结和7例胃周淋巴结）,制备微阵列组织芯片。（1）免疫组化染色评估DLBCL肿瘤组织和正常组织中NLRP3炎症小体效应细胞因子（IL-1β、IL-18）的水平,分析NLRP3炎症小体活化与DLBCL临床特征的关系。（2）免疫组化染色检测PD-L1的水平,分析PD-L1的表达与临床特征的关系。（3）分析IL-1β或IL-18表达与PD-L1表达的关系。2.收集初诊、缓解和难治/复发阶段的DLBCL患者外周血标本,同时收集健康对照者及其他类型NHL患者外周血标本,分离外周血单个核细胞（PBMCs）。（1）检测DLBCL患者抗肿瘤免疫应答能力:流式细胞术检测外周血中T细胞和NK细胞比例,检测T细胞和NK细胞表面免疫检查点分子（TIM-3、PD-1、BTLA、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CD160）的表达,检测T细胞分泌细胞因子能力（IFN-γ、TNF-α）及NK细胞脱颗粒能力（颗粒酶、穿孔素、CD107a）,判断T细胞和NK细胞功能是否受损。分析外周血T细胞表达免疫检查点水平与DLBCL临床特征和预后的关系。（2）流式细胞术检测外周血中MDSCs及其亚群（PMN-MDSCs、M-MDSCs）和Tregs的比例,判断免疫抑制性细胞在DLBCL中是否扩增。（3）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测NLRP3炎症小体相关基因（IL1B、IL18、NLRP3、ASC、CASP1、NFKB1）在PBMCs中的表达,比较DLBCL患者和健康对照中的表达差异。3.体外培养DLBCL细胞株（OCI-LY3、RC和DB）,对细胞株进行不同处理:①对照组:PBS处理;②活化组:利用脂多糖（LPS）和三磷酸腺苷（ATP）活化NLRP3炎症小体;③抑制组:在加入LPS和ATP同时,利用NLRP3抑制剂MCC950抑制NLRP3炎症小体活化。（1）提取不同处理组细胞的总蛋白,Western Blot方法验证各组DLBCL细胞株NLRP3炎症小体活化状态。（2）将不同处理组的OCI-LY3和RC细胞株分别与健康志愿者的PBMCs进行间接共培养,分别共培养3、7、10天后,收集共培养体系的PBMCs,进行流式细胞术检测,分析T细胞的比例和表型。4.NLRP3炎症小体介导淋巴瘤免疫失衡的体内研究:（1）A20淋巴瘤小鼠模型构建:体外培养小鼠淋巴瘤细胞株A20细胞,接种于4周龄雌性BALB/c小鼠前肢背部皮下,设置:①对照组:腹腔注射无菌PBS;②NLRP3抑制组:腹腔注射MCC950阻断NLRP3炎症小体活化。比较两组小鼠淋巴瘤生长情况,分析阻断NLRP3炎症小体活化对小鼠淋巴瘤生长的影响。（2）ELISA检测淋巴瘤小鼠肿瘤匀浆和血浆中IL-1β和IL-18的水平,Western Blot检测小鼠肿瘤和脾脏中NLRP3炎症小体相关蛋白的表达,评估体内应用MCC950是否能抑制小鼠NLRP3炎症小体活化。（3）WesternBlot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,分析抑制NLRP3炎症小体对PD-L1表达及相关信号通路的影响。（4）淋巴瘤小鼠抗肿瘤免疫应答检测:分离对照组和NLRP3抑制组小鼠PBMCs、脾细胞、腋窝/腹股沟淋巴结细胞和肿瘤细胞,流式细胞术检测不同部位T细胞表面PD-1和TIM-3的表达,T细胞比例及其产生IFN-γ、TNF-α和Granzyme B的能力,以及免疫抑制性细胞MDSCs、TAMs和Tregs的比例,分析阻断NLRP3炎症小体活化后荷瘤小鼠体内免疫应答的变化。（5）对A20淋巴瘤小鼠分别注射anti-IL-1β和anti-IL-18抗体,观察抑制IL-1β和IL-18活性对小鼠淋巴瘤生长的作用。流式检测小鼠外周血、脾脏、淋巴结和肿瘤等部位T细胞比例及其表面PD-1、TIM-3的表达,以及MDSCs、TAMs和Tregs的比例,分析阻断IL-1β和IL-18活性对淋巴瘤小鼠免疫应答的影响。Western Blot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,分析阻断IL-1 β和IL-18活性对PD-L1表达的影响。（6）对A20淋巴瘤小鼠分别注射PD-L1抗体、NLRP3抑制剂MCC950,观测对小鼠淋巴瘤生长的抑制作用,分组如下:①PD-L1抗体组:腹腔注射抗小鼠PD-L1抗体;②NLRP3抑制组:腹腔注射MCC950;③联合组:腹腔注射MCC950和PD-L1抗体;④对照组:腹腔注射等量IgG。比较各组小鼠抗肿瘤免疫应答的差异:流式检测外周血、脾脏、淋巴结和肿瘤中T细胞的比例、表型和功能,以及免疫抑制性细胞的比例变化,分析NLRP3抑制剂和PD-L1抗体之间的相互作用。5.统计分析:使用SPSS 21和GraphPad Prism 7软件对数据进行分析。数据表示为平均值±标准差或中位数±数据范围或四分位数间距。所用数据为三次独立重复实验的结果。利用Student t检验和Mann-Whitney U检验评估P值,用Pearson相关系数检验相关性,P值小于0.05表示差异具有统计学意义。研究结果:1.IL-18在DLBCL肿瘤组织中显着升高且与PD-L1表达呈正相关。（1）组织芯片染色结果显示,DLBCL肿瘤组织IL-18表达水平明显升高,且与生发中心型DLBCL（GCB-DLBCL）相比,非GCB型（non-GCB）DLBCL具有更高水平的IL-18。进一步亚组分析发现,IL-18和IL-1β在CD10（-）和MUM1（+）的患者中表达水平更高。（2）组织芯片染色结果显示,DLBCL肿瘤组织PD-L1表达水平较正常淋巴组织明显上调,且PD-L1表达与DLBCL生存不良的独立预测因子Ki-67表达成正相关。而且,肿瘤微环境中PD-L1与IL-18的表达水平成正相关。（3）RT-qPCR结果显示,与健康对照相比,DLBCL患者PBMCs中的IL1B和IL18基因表达明显上调。2.流式细胞术检测发现,DLBCL患者抗肿瘤免疫应答受到抑制。（1）流式检测T细胞和NK细胞产生细胞因子水平,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血CD3+T细胞分泌TNF-α和IFN-γ的水平明显减少,NK细胞（CD3-CD56+）比例显着降低,NK细胞产生穿孔素和颗粒酶的水平明显下降。（2）流式检测免疫检查点分子表达,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血中T细胞表面PD-1和TIM-3的阳性率明显上升,NK细胞表面TIM-3和BTLA的表达明显升高。进一步分析患者临床资料发现,PD-1+T细胞比例与血清乳酸脱氢酶（LDH）水平呈正相关。而且,T细胞表达PD-1和TIM-3水平与淋巴瘤Ann Arbor分期和国际预后指数（IPI）有关,Ann Arbor Ⅲ/Ⅳ期的DLBCL患者较Ⅰ/Ⅱ期的患者外周血中PD-1+T细胞和TIM-3+T细胞比例明显升高,IPI≥3分的患者较IPI0-2分的患者PD-1+T细胞和TIM-3+T细胞比例明显升高,提示DLBCL患者T细胞表面PD-1和TIM-3表达的增多与不良预后相关。（3）流式检测免疫抑制性细胞比例,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血中MDSCs和Tregs细胞的比例明显增高,而治疗后缓解的DLBCL患者Tregs比例较初诊患者明显下降,难治/复发DLBCL患者Tregs比例较缓解患者明显升高。3.体外实验证实,DLBCL细胞株的NLRP3炎症小体可被活化并影响PD-L1表达。（1）WesternBlot结果显示:与对照组相比,LPS和ATP处理后,OCI-LY3、RC和DB细胞的蛋白裂解产物中,IL-1β（p17）和PD-L1蛋白水平明显升高;MCC950处理后,OCI-LY3、RC和DB细胞的蛋白裂解产物中,IL-1β（p17）和PD-L1表达明显下调。（2）体外活化或抑制RC或OCI-LY3细胞的NLRP3炎症小体,并与PBMCs共培养,流式结果显示:共培养7天后,RC细胞和OCI-LY3细胞的共培养体系中,NLRP3炎症小体活化组的CD8+T细胞比例均较对照组显着降低,而NLRP3炎症小体抑制组的CD8+T细胞比例较活化组显着升高。4.体内实验证实,MCC950体内阻断NLRP3炎症小体活化可抑制淋巴瘤生长,降低PD-L1表达。（1）我们通过向BALB/c小鼠皮下注射同系A20淋巴瘤细胞株建立了小鼠淋巴瘤模型,接种后7天左右,小鼠右侧斜肋部皮下出现肉眼可见的肿瘤,接种后14天左右,小鼠肿瘤负荷明显增加。至观察终点处死小鼠,ELISA结果显示,肿瘤组织匀浆中IL-1β和IL-18水平明显升高。（2）Western Blot结果证实:腹腔注射MCC950使小鼠肿瘤和脾脏中NLRP3炎症小体效应产物IL-1β和IL-18水平显着降低,并且显着下调淋巴瘤小鼠模型肿瘤中的PD-L1和磷酸化STAT3（pSTAT3）的蛋白水平。（3）分析NLRP3炎症小体与小鼠淋巴瘤生长的关系,发现观察终点时,NLRP3抑制组淋巴瘤小鼠的肿瘤体积和肿瘤重量明显低于对照组。5.流式结果显示,MCC950体内阻断NLRP3炎症小体活化可提高淋巴瘤小鼠的T细胞比例及其产生TNF-α的水平,减少PD-1+或TIM-3+T细胞比例,降低免疫抑制性细胞的水平。（1）与对照组相比,NLRP3抑制组小鼠肿瘤浸润CD8+T细胞明显增多,脾脏CD3+、CD4+、CD8+T细胞比例明显升高,脾脏CD3+T细胞产生TNF-α的水平明显增加,而分泌IFN-γ的水平下降。（2）与对照组相比,NLRP3抑制组小鼠脾脏和淋巴结中CD3+T细胞表达PD-1和TIM-3的比例显着降低。（3）与对照组相比,NLRP3抑制组MDSCs和TAMs比例在小鼠肿瘤、外周血、脾脏中显着降低,Tregs细胞比例在肿瘤和脾脏中显着降低。6.体内中和IL-18可抑制淋巴瘤生长,降低免疫抑制性细胞比例。（1）将淋巴瘤小鼠分别注射IL-1β或IL-18中和抗体,发现观察终点时,anti-IL-1β组和anti-IL-18组小鼠淋巴瘤大小均显着低于对照组。（2）流式结果显示:与对照组相比,anti-IL-18组小鼠肿瘤、外周血和淋巴结中CD8+T细胞比例均显着增加;anti-IL-1β组小鼠淋巴结中CD8+T细胞比例增加,而外周血中CD8+T细胞比例降低。（3）流式检测T细胞表面PD-1和TIM-3的表达,结果显示:anti-IL-18组小鼠外周血和淋巴结中CD8+T细胞表达PD-1降低,肿瘤、外周血和脾脏中CD4+T细胞表达PD-1的比例降低,且肿瘤浸润T细胞表达TIM-3降低;而anti-IL-1β组小鼠T细胞表达PD-1百分比无明显变化,肿瘤T细胞表面TIM-3表达升高。（4）流式检测免疫抑制性细胞的比例,发现:anti-IL-18小鼠外周血MDSCs和TAMs比例均明显低于对照组,且anti-IL-18组小鼠肿瘤和脾脏的Tregs比例较对照鼠显着降低;anti-IL-1 β组小鼠外周血MDSCs和TAMs也明显低于对照组,而Tregs比例无明显改变。（5）Western Blot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,发现anti-IL-18和anti-IL-1β组小鼠肿瘤组织中PD-L1和pSTAT3蛋白表达水平均较对照显着降低。7.NLRP3炎症小体抑制剂和PD-L1抗体对于抑制淋巴瘤生长具有拮抗作用。（1）在本研究中,我们分别用MCC950、anti-PD-L1抗体单一处理或MCC950联合anti-PD-L1抗体处理淋巴瘤小鼠模型,观察对小鼠淋巴瘤生长的影响,结果显示,单用MCC950或anti-PD-L1抗体均能减小淋巴瘤小鼠的肿瘤负荷,而联用MCC950和anti-PD-L 1抗体降低了肿瘤抑制效果。（2）流式分析发现,与对照相比,anti-PD-L1抗体能显着提高肿瘤浸润性CD8+T细胞和总T细胞的比例,并增加脾脏CD8+T细胞IFN-γ和TNF-α产生;而联合MCC950后,肿瘤CD8+T细胞比例及脾脏CD8+T细胞产生IFN-γ和TNF-α的水平明显低于单用anti-PD-L1组。以上结果说明,NLRP3抑制剂会破坏由PD-L1抗体提高的CD8+T细胞比例和产生细胞因子能力。（3）流式分析发现,anti-PD-L1组小鼠脾脏和淋巴结中PD-1+T细胞比例明显高于对照组和MCC950组,而联合组小鼠的脾脏和淋巴结中PD-1+T细胞的百分比也明显高于单用MCC950组。此外,与MCC950组相比,anti-PD-L1组肿瘤浸润的MDSCs和TAMs的百分比均显着提高,而且联合用药组小鼠肿瘤中的MDSCs和TAMs比例也明显高于单用MCC950组。可见,PD-L1抗体在一定程度上破坏了由NLRP3抑制剂降低的免疫抑制因素。结论:1.DLBCL患者中NLRP3炎症小体异常活化,肿瘤组织中效应细胞因子IL-18表达上调,且与共抑制配体PD-L1表达成正相关。2.DLBCL患者体内抗肿瘤免疫应答受到抑制,肿瘤微环境中PD-L1表达增加,外周免疫抑制性细胞群体MDSCs、TAMs和Tregs明显扩增,T细胞表达PD-1和TIM-3增加,与DLBCL不良预后相关。3.阻断NLRP3炎症小体活化可显着抑制小鼠淋巴瘤进展,增强抗肿瘤免疫应答,降低免疫抑制性细胞数量。而且,NLRP3炎症小体主要通过效应因子IL-18介导淋巴瘤中免疫应答的调节。4.A20淋巴瘤小鼠模型体内阻断NLRP3炎症小体活化可拮抗PD-L1抗体对肿瘤的抑制作用。第二部分 γδT17和MDSCs在胃MALT淋巴瘤微环境免疫稳态失衡中的作用及机制研究研究背景胃粘膜相关淋巴组织（Mucosa-associated lymphoid tissue,MALT）淋巴瘤的发生发展与幽门螺杆菌（Helicobacter Pylori,HP）感染导致的胃粘膜区域免疫稳态失衡密切相关。胃MALT淋巴瘤是慢性炎症转化为肿瘤的典型疾病类型。胃粘膜局部微环境中大量免疫细胞浸润、细胞因子产生等导致的免疫稳态失衡,在胃MALT淋巴瘤的发生发展中起重要作用,因此探究其潜在的免疫调节机制对于明确炎症-肿瘤转化的机制意义重大。髓系来源的抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）由处于早期分化阶段的髓系细胞组成。生理状态下MDSCs处于静息状态,缺乏免疫抑制活性。在各种病理状态下,MDSCs被募集到淋巴器官或肿瘤组织中,通过细胞间接触或可溶性细胞因子的作用,产生广泛的免疫抑制作用。MDSCs主要通过抑制T细胞、NK细胞功能介导肿瘤免疫耐受。研究发现,MDSCs中高活性的精氨酸酶1（Arginase 1,Arg-1）消耗TCR合成的原料L-精氨酸,并抑制细胞周期相关蛋白Cyclin D3、CDK4的表达,导致T细胞增殖阻滞。MDSCs通过诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,iNOS）产生一氧化氮,诱导T细胞凋亡。除此之外,MDSCs还能通过促进调节性T细胞（Tregs）聚集发挥免疫抑制作用。由此可见,MDSCs在肿瘤免疫耐受中扮演重要角色。胃粘膜免疫是机体整个免疫网络的重要组成部分,具有独特的结构和功能,其中γδT细胞的富集是胃粘膜区域免疫的重要特性。γδT细胞在胃肠道粘膜中含量丰富,对于维持胃粘膜微环境稳态、抵御外来微生物入侵及调节获得性免疫应答起重要作用。yδT细胞可分泌多种细胞因子,按功能不同可划分为分泌IFN-y的γδT1和分泌IL-17的γδT17,其中的T17的作用日益受到重视。γδT17在纤维肉瘤、皮肤癌、结肠癌、卵巢癌等多种肿瘤的微环境中大量浸润,通过促进血管生成、肿瘤侵袭以及诱导免疫耐受等发挥促癌作用。研究表明,HP感染相关的慢性胃炎可引起γδT细胞大量活化18,而且在胃MALT淋巴瘤微环境中存在IL-17的高表达19,20。然而,关于γδT17在胃MALT淋巴瘤中的作用尚不清楚,有待于进一步研究。近年研究显示,γδT17可通过募集和激活MDSCs来介导结直肠癌和肝细胞癌肿瘤微环境中的免疫耐受。在结肠癌微环境中,IL-23诱导γδT17细胞极化,分泌IL-17、IL-8、TNF-α和GM-CSF等细胞因子,招募并激活MDSCs。在肝癌微环境中,活化的γδT17产生大量IL-17,可促使肿瘤细胞分泌CXCL5,进而招募MDSCs;同时,MDSCs通过分泌IL-23和IL-1β促进γδT17极化,形成正反馈环路,进一步介导肿瘤免疫耐受。由此我们推测,HP感染引起胃粘膜局部慢性炎症,微环境免疫稳态失衡,γδT17被激活,通过分泌IL-17等细胞因子,募集MDSCs,介导肿瘤细胞免疫逃逸,参与胃MALT淋巴瘤发生发展。研究目的本项目拟以胃MALT淋巴瘤区域免疫微环境为切入点,研究γδT17、MDSCs及相关细胞因子在胃MALT淋巴瘤免疫失衡中的关键作用,探索胃MALT淋巴瘤从炎症向肿瘤转化过程中的免疫调节机制。研究方法1.利用H.felis给BALB/c小鼠灌胃,构建小鼠胃MALT淋巴瘤模型,利用快速尿素酶实验和PCR方法检测细菌定植情况,利用H&E染色和免疫组化鉴定小鼠胃粘膜病理特征,动态监测小鼠胃组织成瘤情况。2.H.felis感染后不同时间点（8、11、14、19月）分离小鼠的外周血、脾脏及胃组织,流式细胞术检测MDSCs在胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠中的比例。制备小鼠胃组织的石蜡切片,利用免疫荧光和免疫组化检测胃局部MDSCs（Gr-1+CD 11 b+）的数量及其产生Arg-1和iNOS的水平。3.在胃MALT淋巴瘤小鼠模型发病过程中,利用ELISA和RT-qPCR检测胃组织IL-17蛋白水平和Il17a基因表达的变化,通过流式细胞术分析产生IL-17的三种主要细胞γδT17（TCRγδ+IL-17+）、Th17（CD4+IL-17+）和Tc17（CD8+IL-17+）的比例变化,比较γδT17细胞水平在胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠之间的差异,以及随H.felis感染时间延长的变化趋势。4.比较胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠胃局部细胞因子和趋化因子的差异:RT-qPCR检测Toll样受体（Toll-likereceptor,TLR）、细胞因子及趋化因子的表达,ELISA检测IL-1β、IL-23等细胞因子的表达和水平,Western Blot检测NLRP3炎症小体是否在H.felis感染鼠胃组织活化,分析差异表达的细胞因子或趋化因子在胃MALT淋巴瘤小鼠发病中的作用。5.收集胃MALT淋巴瘤初诊患者和健康对照者的外周血标本,并制备胃MALT淋巴瘤组织和正常胃组织的石蜡组织切片。流式细胞术检测外周血中MDSCs（CD45+Lin-CD33+HLA-DR-CD11b+）、Tregs（CD4+CD25+Foxp3+）、γδT17（TCRγδ+IL-17+）、Th17（CD4+IL-17+）和Tc17（CD8+IL-17+）的比例,比较胃MALT淋巴瘤患者和健康志愿者之间的差异。免疫荧光检测MD S C s（CD33+CD11b+）和γδT17（TCRγδ+IL-17+）在胃MALT淋巴瘤肿瘤组织中的浸润,免疫组化检测Arg-1、iNOS、IL-1β和IL-23的表达。6.统计分析:本研究数据以平均数±标准差或中位数±四分位数间距表示,用Student t检验或Mann-Whitney检验评估,使用 SPSS 21 和GraphPad Prism 7对数据进行分析。P值小于0.05差异具有统计学意义。结果1.胃MALT淋巴瘤小鼠模型鉴定:H&E染色结果显示,从灌胃后8个月开始,H.felis感染鼠胃黏膜出现以淋巴细胞聚集为主的淋巴滤泡,且随感染时间延长,H.felis感染鼠胃黏膜的病理损害逐渐加剧;感染后14个月,淋巴细胞明显破坏粘膜肌层,甚至粘膜全层,形成淋巴上皮损害（LEL）,这是胃MALT淋巴瘤的典型特征。免疫组化证实,H.felis感染鼠胃黏膜聚集的淋巴组织主要由CD20+的B淋巴细胞组成。以上结果证实,长期的H.felis感染会导致BALB/c小鼠胃黏膜病理损害,先后出现炎症、淋巴组织增生、淋巴滤泡形成和LEL,此病程演变与人的胃MALT淋巴瘤的形成过程高度一致。2.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜区域免疫微环境中MDSCs浸润增多。流式结果显示,H.felis感染早期胃部病变较轻时,感染鼠外周血中MDSCs的比例较对照鼠无明显变化;H.felis感染中后期,胃MALT淋巴瘤小鼠模型的外周血中MDSCs的比例较对照鼠明显升高。免疫荧光和免疫组化证实,与对照鼠相比,Gr-1+CD11b+的MDSCs在胃MALT淋巴瘤小鼠模型的胃组织浸润显着增多,而且胃组织局部的Arg-1分泌明显增多。3.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜区域免疫微环境中γδT17大量聚集。RT-qRCR和ELISA结果显示,H.felis感染鼠胃组织IL-17在mRNA和蛋白水平均显着高于对照鼠。同时,免疫组化也证实了 IL-17在胃MALT淋巴瘤小鼠模型淋巴滤泡形成部位的高表达。流式数据显示:与对照鼠相比,H.felis感染后8个月小鼠脾脏γδT细胞的比例明显升高,而CD4+T和CD8+T细胞比例无明显差异;而且,胃MALT淋巴瘤小鼠的脾脏中γδT17在产生IL-17的T淋巴细胞中的比例显着升高,而Th17和Tc17比例在两组小鼠之间无明显变化,提示γδT17是胃MALT淋巴瘤发展过程中调节免疫稳态的主要细胞群体。进一步研究发现,γδT17的比例随着H.felis感染时间的延长逐渐升高,提示的T17与疾病进展的相关性。4.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜病变部位参与γδT17极化和募集的细胞因子和趋化因子表达增加。RT-qPCR结果显示,与对照鼠相比,Tlr2、Tlr7和Tlr9基因在H.felis感染后的小鼠胃组织中表达明显升高。Western Blot结果显示,NLRP3炎症小体的活化产物cleaved caspase-1的蛋白水平在H.felis感染后的小鼠胃组织明显增加。ELISA评估小鼠胃组织匀浆中细胞因子的水平,发现与对照鼠相比,IL-1β和IL-23在胃MALT淋巴瘤小鼠模型的胃组织中显着升高。同时RT-qPCR检测发现,Ccr6和Ccl20在胃MALT淋巴瘤小鼠模型胃组织的表达显着高于对照鼠。5.胃MALT淋巴瘤临床标本检测结果:流式检测发现,与健康志愿者相比,胃MALT淋巴瘤患者外周血中MDSCs和Tregs的比例显着升高。免疫荧光和免疫组化证明,胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中MDSCs和γδT17细胞水平较正常胃组织显着升高,且Arg-1和iNOS在肿瘤微环境中的表达显着上调,同时细胞因子IL-1β和IL-23的表达明显上调。结论1.持续性的H.felis感染可导致小鼠胃组织从胃炎进展到胃MALT淋巴瘤,病理发病过程与人胃MALT淋巴瘤的发生发展高度相似。2.MDSCs在H.felis感染小鼠胃部病变组织和胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中大量浸润,参与炎症向淋巴瘤的转化。3.胃MALT淋巴瘤小鼠模型胃部病变和胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中,IL-17分泌增多,γδT17大量聚集,IL-1β、IL-23的激活和CCL20-CCR6的趋化作用可能参与γδT17在病变部位的浸润。γδT17随感染时间延长逐渐增多,可能通过募集MDSCs参与胃MALT淋巴瘤的进展。总之,胃局部免疫稳态失衡是胃MALT淋巴瘤发生发展的重要因素。
李美蓉[4]（2020）在《减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究》文中研究表明急性白血病发病迅猛、耐药、易复发、复发后更难治、死亡率高,是白血病死亡最常见的疾病类型。随着近几十年药物研发和风险分类管理的不断改善,儿童急性白血病治疗得到了巨大进步,然而成年尤其是老年急性白血病患者的预后仍然较差,许多患者复发后治疗失败,最终死亡。目前,急性白血病的治疗仍以化疗为主。化疗失败或疾病复发时,才考虑进行骨髓移植或造血干细胞移植。然而,化疗副作用强,耐药易复发,经常导致治疗失败和死亡。骨髓或造血干细胞移植也存在供体难寻、手术费用高昂及手术过程痛苦难耐等问题,且仍存在一定复发风险。因此寻找副作用小、疗效可靠且经济的治疗新药具有重大意义。多例急性白血病患者发生严重细菌感染后获得自发缓解的临床报道,结合目前关注度非常高的肿瘤细菌疗法,提示细菌疗法可能是治疗急性白血病的一个新方向。在多种用于肿瘤治疗研究的细菌中,沙门氏菌因其具有良好的肿瘤靶向性和抗肿瘤效果,被广泛应用于各种实体肿瘤治疗。但是沙门氏菌对血液肿瘤的治疗未见报道。经基因工程改造的减毒沙门氏菌VNP20009产生的内毒素毒力减少了5万倍,且其耐受性和安全性已在一期临床试验中得到证实,是研究细菌治疗急性白血病的理想菌株。本课题首次分别以小鼠急性淋巴细胞白血病细胞（Acute lymphoblastic leukemia,ALL）L1210、人源急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）细胞HL-60皮下移植瘤模型,和人源AML融合蛋白MLL-AF9驱动的系统性AML小鼠模型,评估了VNP20009对急性白血病的治疗效果,并探究了其可能的作用机制,主要研究内容如下:1.体外细菌-细胞共培养实验结果表明,减毒沙门氏菌VNP20009呈剂量效应和时间效应抑制多种急性白血病细胞增殖,并诱导其凋亡。2.裸鼠皮下移植瘤模型治疗实验结果表明,VNP20009能抑制急性白血病皮下移植瘤的生长。肿瘤组织苏木素&伊红染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal deoxynucleotidyl transferase（Td T）d UTP Nick-End Labeling,TUNEL）免疫荧光结果表明VNP20009能显着诱导肿瘤细胞凋亡,导致肿瘤中心区域细胞核破碎、DNA降解、胞膜解体,肿瘤组织大面积坏死。Western Blot检测肿瘤组织蛋白表明,VNP20009能显着上调促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3及Cleaved-PARP的表达,诱导急性白血病细胞凋亡。3.MLL-AF9驱动的AML模型小鼠治疗实验结果表明,VNP20009显着抑制小鼠体内AML细胞的增殖;降低AML小鼠外周血白细胞计数及其五分类数值,使其恢复至近正常生理水平;延长了AML小鼠的生存期。4.血清细胞因子与趋化因子检测及流式细胞术检测结果表明,VNP20009一方面能上调抗肿瘤因子γ-干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）的产生,并降低粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）水平来抑制、杀伤肿瘤细胞;另一方面,显着上调分泌趋化因子C-X-C基序配体-10（C-X-C motif ligand-10,CXCL-10）和CC趋化因子配体-2（C-C motif ligand-2,CCL-2）,招募并激活自然杀伤细胞和以CD4+为主的T淋巴细胞的增殖,杀伤、抑制白血病细胞增殖。VNP20009还能进一步刺激T淋巴细胞向CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+效应T淋巴细胞极化,释放IFN-γ,进一步维持、增强机体抗肿瘤免疫力抑制白血病细胞增殖。结论:减毒沙门氏菌VNP20009能显着抑制白血病细胞的增殖,并促进其凋亡,起到治疗和延缓白血病的作用。一方面VNP20009进入机体后,能够诱导多种细胞因子和趋化因子的分泌和多种免疫细胞的增殖,增强机体抗肿瘤免疫力,抑制和杀伤白血病细胞,延长AML小鼠生存期。另一方面移植瘤组织中线粒体促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP的表达增加,提示VNP20009感染后可能通过线粒体凋亡途径诱导急性白血病细胞凋亡。该研究为急性白血病的治疗提供一种新的策略和理论基础。
宋亚军[5]（2020）在《MMF通过抑制Th17细胞及IL-17A下调Vγ4细胞表达KGF的机制研究》文中认为背景和目的心脏、肾脏等器官移植术后,患者须长期服用免疫抑制剂类药物预防和治疗排斥反应,以延长移植物存活。吗替麦考酚酯是临床上常用于实体器官移植术后的免疫抑制剂之一,通过肠道吸收后迅速在肝细胞内代谢成其活性成分-霉酚酸。在体内,霉酚酸可以通过非竞争性地、可逆地抑制次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶的活性,抑制鸟嘌呤核苷酸的经典合成途径,从而选择性地抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞的活化增殖,降低机体的免疫水平,达到减轻对移植物排斥的目的,尽可能保护移植器官功能。但是,吗替麦考酚酯副作用明显,比如白细胞减少、贫血、败血症等,在胃肠道主要为恶心、呕吐、腹痛、腹泻等不良反应,即便使用肠溶剂型也难以改善。临床上多采用减少用药剂量甚至中断服药来减轻副作用。目前,吗替麦考酚酯引发胃肠反应的具体机制尚有待探究。角化细胞生长因子（keratinocyte growth factor,KGF）对多种细胞都具有促进增殖、分化的功能,能够有效改善克罗恩病、缺血再灌注等因素造成的肠粘膜损伤,修复肠粘膜屏障,改善腹痛、腹泻等不良症状。在肠道,KGF多由TCRγδT细胞分泌,在肠粘膜遭受刺激时,KGF表达可升高。多项研究表明,KGF的表达与细胞因子IL-17A高度相关,而作为IL-17A主要细胞来源的Th17细胞,理论上可直接受吗替麦考酚酯的抑制,根据以上反应链条,不难推测:在肠道,吗替麦考酚酯可能通过抑制Th17细胞及其IL-17A的分泌,减少TCRγδT细胞的活化和KGF的表达,进而造成肠粘膜屏障结构和功能受损,这可能是吗替麦考酚酯引发胃肠反应的作用机制之一。为了验证该假说,我们拟建立吗替麦考酚酯诱导的小鼠肠粘膜损伤模型,外源性给予KGF治疗,观察效果并探讨原因;设计体内、外实验,进一步探究吗替麦考酚酯是否通过作用Th17细胞及其特征性细胞因子IL-17A,进而影响肠道TCRγδT细胞表达KGF的部分作用机制。本研究可为减轻吗替麦考酚酯造成的胃肠道反应提供新的研究思路和干预措施。方法:1.建立吗替麦考酚酯诱导小鼠肠粘膜屏障损伤模型C57雄性小鼠,重20 g-25 g,按照:500 mg/kg,每天灌胃1次吗替麦考酚酯混悬液;或:250mg/kg,每天早、晚各灌胃1次的方式建模,连续灌胃14天,每天固定时间称量小鼠的体重,观察小鼠大便性状,处死后称量肠道湿重,并做病理检查,比较两种方法的建模效果。2.外源性KGF对吗替麦考酚酸酯诱导的肠粘损害的保护作用研究我们设计实验,拟从小鼠体重等大体指标、肠道病理变化、肠粘膜通透性、肠上皮细胞凋亡、增殖,紧密链接蛋白表达以及肠粘膜TCRγδ+IEL细胞比例变化等角度,探究外源性KGF对于MMF模型的肠粘膜保护作用。（1）取30只C57小鼠随机分成3组,每组10只,分别为吗替麦考酚酯组（MMF组）,吗替麦考酚酯+重组角化上皮生长因子组（MMF+KGF组）和对照组（Control组）;（2）称量各组小鼠体重、观察肛门血污、肠道肉眼下状态并测量其长度;（3）用FITC-Dextran和多功能酶标仪检测小鼠肠粘膜通透性;（4）取小肠做HE染色并用Chiu’s评分法做病理评分,评估各组小鼠肠粘膜损伤情况;（5）免疫荧光法和蛋白印迹法检测肠粘膜细胞紧密链接蛋白表达情况;（6）分别用Brd U法和TUNEL法检测肠粘膜上皮细胞增殖和凋亡情况;（7）流式细胞仪检测对比各组小鼠肠道TCRγδ+IEL细胞比例。3.吗替麦考酚酯对小鼠肠粘膜Th17细胞比例及IL-17A表达的影响。建立吗替麦考酚酯诱导的肠粘膜损伤模型,并在模型基础上给予Th17细胞回输,或IL-17A细胞因子腹腔注射,观察各组小鼠肠粘膜损伤,Th17细胞比例以及IL-17A表达情况,以期阐释吗替麦考酚酯的肠粘膜损害作用是否与Th17细胞抑制及其IL-17A表达下调有关。（1）动物模型的建立与分组:取40只C57小鼠随机分成4组,每组10只,分别为空白对照组（Control组）,吗替麦考酚酯组（MMF组）,MMF+Th17细胞回输组（MMF+Th17组）,和MMF+IL-17A腹腔注射组（MMF+IL-17A组）;（2）取小肠做HE染色并用Chiu’s评分法做病理评分,评估各组小鼠肠粘膜损伤情况;（3）流式细胞仪检测各组小鼠肠粘膜Th17细胞比例;（4）免疫印迹法检测各组小鼠肠粘膜IL-17A的表达;4.IL-17A作用Vγ4细胞表达KGF机制的初步探讨（1）用IL-17A（1μg/kg/day,连续5天）腹腔注射野生型小鼠、抗体清除Vγ1细胞小鼠、抗体清除Vγ4细胞小鼠、JAK/STAT信号阻断剂（AG490）小鼠,空白对照组以同样方式注射生理盐水。5天后,用免疫组化法观察KGF表达情况,蛋白印迹法检测JAK/STAT信号通路蛋白磷酸化情况;（2）体外培养Vγ4T淋巴细胞,实验组用IL-17A刺激,对照组加等量PBS缓冲液,6 h后用ELISA法检测细胞培养上清液中KGF蛋白的表达,用RT-PCR法检测KGF在RNA水平的变化,蛋白印迹法检测Vγ4T细胞内JAK/STAT信号通路蛋白磷酸化情况。结果:1.与以往报道的方法相比,在保证灌饲吗替麦考酚酯总量不变的情况下,早8:00,晚6:00两个时间点分别灌胃的方法具有省时、稳定的优点,所以,我课题组采用这一方法建模。2.与对照组相比,MMF组小鼠体重减轻,肠粘膜损伤和通透性增加,紧密链接蛋白（ZO-1、Claudin-1）的表达减少,分布紊乱。肠粘膜上皮细胞的增殖减少,凋亡增加;相对于MMF组,MMF+KGF组肠粘膜屏障损害减轻,肠上皮细胞增殖增加,凋亡减少;肠上皮细胞间的紧密链接蛋白更加稳定,肠上皮细胞内的TCRγδ+细胞比例升高。3.与对照组相比,MMF组肠粘膜病理损伤严重,而MMF+Th17组和MMF+IL-17A组肠粘膜损伤好转,病理评分比MMF组下降;流式细胞检测显示MMF组肠粘膜Th17细胞比例下降,MMF+Th17组肠粘膜Th17细胞比例有所回升,MMF+IL-17A组肠粘膜Th17细胞比例与MMF组未见差异。4.免疫组化结果显示,与空白对照组相比,用IL-17A腹腔注射后,模型对照组、抗体清除Vγ1细胞组肠粘膜KGF表达增多,抗体清除Vγ4细胞组、AG490组小鼠KGF表达未见差异;蛋白印迹结果显示,用IL-17A腹腔注射后,与空白对照组相比,模型对照组、抗体清除Vγ1细胞组p-JAK2、p-STAT3表达上升,抗体清除Vγ4细胞组、AG490组小鼠p-JAK2、p-STAT3表达未见差异;在体外细胞培养实验中,相对于对照组,实验组（IL-17A刺激）KGF在蛋白和RNA水平表达升高,蛋白印迹法检测到Vγ4T细胞内p-JAK2、p-STAT3表达升高。5.结论:1.相对于传统,改良后的建模方法（早8:0,晚6:00用250 mg/m L的吗替麦考酚酯混悬液100μL灌胃）,建模时间缩短,肠粘膜损伤明确,最终血药浓度与传统方法无差异。模型的稳定性好,成功率高。2.外源性给予KGF可以有效减轻吗替麦考酚酯造成的肠粘膜损伤,这一作用可能是通过促进肠粘膜上皮细胞增殖、抑制其凋亡,保护肠上皮细胞间的紧密链接蛋白（ZO-1、Claudin-1）,稳定肠上皮内的TCRγδ+细胞实现的。3.回输Th17细胞和腹腔注射IL-17A细胞因子可以有效减轻吗替麦考酚酯造成的肠粘膜损伤,这些结果提示:吗替麦考酚酯抑制肠粘膜Th17细胞及IL-17A表达有可能是其造成肠粘膜损伤的部分机制。4.肠粘膜上分泌KGF的γδT细胞亚型主要是Vγ4;IL-17A可以激活Vγ4细胞,增加KGF分泌;体在外实验中,IL-17A可以通过激活JAK/STAT信号通路,上调p-JAK2、p-STAT3水平,进而调控KGF表达;JAK2抑制剂AG490可以有效抑制Vγ4细胞分泌KGF。这些结果提示:IL-17A可通过上调肠粘膜Vγ4细胞JAK/STAT信号通路磷酸化水平调控KGF表达。
修磊[6]（2020）在《γδT细胞在金黄色葡萄球菌乳腺感染中的作用及机制研究》文中指出金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）是一种寄生于动物体表的条件性致病菌,能引起人和多种动物的感染性疾病,如心内膜炎、肺炎、骨髓炎和菌血症等。此外,S.aureus还可引起哺乳期妇女和动物的乳腺炎,严重威胁人类健康和畜牧业健康发展。S.aureus耐药菌株的涌现和疫苗预防效果的局限性使得深入研究其发病的免疫学机制已迫在眉睫。目前,S.aureus乳腺感染的相关免疫调控机制并不完全清楚,最新研究表明,一些非传统的T细胞群（如γδT细胞）参与了病原微生物感染的免疫应答,并且在调节免疫反应类型和强度上发挥重要作用。γδT细胞作为连接固有免疫应答与适应性免疫应答的桥梁,广泛分布于各种黏膜和皮下组织,在黏膜免疫防御中扮演着重要的角色。有研究表明,γδT细胞对细菌感染的免疫应答因感染部位的不同而存在着差异。乳腺作为机体的特殊组织器官,在感染S.aureus后,乳腺组织中γδT细胞动态变化如何?发挥怎样的功能?具体机制如何?尚未见报道。本研究通过S.aureus感染小鼠乳腺模型,系统分析乳腺组织中γδT细胞的动态变化、应答规律和分泌细胞因子特征;利用TCRδ-/-小鼠,探究乳腺γδT细胞在感染S.aureus后的主要功能。利用Vγ4抗体清除的小鼠和IL-17A-/-小鼠,明确乳腺γδT细胞在S.aureus感染过程中发挥作用的机制。研究内容及方法:建立小鼠S.aureus乳腺感染模型,检测感染24 h内乳腺组织及脾脏中NK细胞、NK T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞以及γδT细胞的动态变化;流式细胞术和ELISA法检测乳腺组织内γδT细胞的表型及分泌细胞因子情况。利用TCRδ-/-小鼠乳腺感染模型,检测敲除γδT细胞后乳腺组织中S.aureus定殖量、病理变化、趋化因子表达量、嗜中性粒细胞数量及MPO活性;流式细胞术分析小鼠乳腺Th1,Th2,Th17,Tc以及Treg细胞变化情况,明确乳腺γδT细胞在S.aureus感染过程中所发挥的功能。进一步,分析S.aureus感染后乳腺γδT细胞的亚型,明确其主要亚型Vγ1和Vγ4γδT细胞的动态变化及分泌细胞因子特征。利用InVivoMAb anti-mouse TCR Vγ1（clone 2.11）单克隆抗体和InVivoMAb anti-mouse TCR Vγ4（clone UC3-10A6）单克隆抗体清除乳腺Vγ1和Vγ4γδT细胞,检测乳腺组织中S.aureus定殖量、病理变化情况及嗜中性粒细胞募集情况,确定乳腺Vγ1和Vγ4γδT细胞在S.aureus感染中的作用。最后,利用IL-17A-/-小鼠,检测乳腺组织中S.aureus定殖量、病理变化、趋化因子表达及嗜中性粒细胞募集情况,分析探讨乳腺Vγ4γδT细胞在抗S.aureus感染中的作用机制。实验结果:1)S.aureus感染小鼠乳腺后,乳腺组织中CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞及NK T细胞无显着变化,而γδT细胞变化显着。在感染24 h内,乳腺内γδT细胞呈先升高后降低的趋势,感染S.aureus 3 h后达到峰值,至24 h时其比例降为1.95%,与对照组相比差异不显着。对乳腺中γδT细胞表型进行检测后发现其高表达CD44和CD69分子,进一步对γδT细胞分泌的细胞因子进行检测后发现,乳腺γδT细胞主要分泌IL-17A和IFN-γ。2)S.aureus感染TCRδ-/-小鼠后,对乳腺内细菌定殖量和病理变化情况进行检测,结果发现TCRδ-/-小鼠乳腺组织细菌定殖量显着升高,乳腺组织病理程度加剧。进一步探究发现TCRδ-/-小鼠乳腺组织中趋化因子KC、MIP-2及IL-8的表达量显着降低,中性粒细胞数量显着减少,组织MPO活性显着下降,IL-17A和IFN-γ的表达量降低。另外,与WT小鼠相比,TCRδ-/-小鼠乳腺及脾脏中Th1、Th17、Tc以及Treg细胞比例显着降低,而Th2细胞比例则无明显变化。提示乳腺γδT细胞在S.aureus感染过程中起到免疫保护作用。3)S.aureus感染小鼠乳腺后,流式细胞术检测γδT细胞主要亚型及其动态变化情况,结果发现,Vγ1和Vγ4γδT细胞在感染后3 h和6 h的比例显着升高,与对照组相比差异显着;进一步发现,Vγ1γδT细胞在S.aureus感染早期主要产生IFN-γ,而Vγ4γδT细胞在S.aureus感染早期主要产生IL-17A。利用抗体分别将乳腺组织内Vγ1γδT细胞和Vγ4γδT细胞清除,结果发现,与对照组相比,Vγ1γδT细胞清除小鼠和Vγ4γδT细胞清除小鼠乳腺内细菌定殖量均显着增加,病理程度加剧,中性粒细胞数量显着降低,提示Vγ1和Vγ4γδT细胞是乳腺抵御S.aureus感染的主要γδT细胞亚型。4)进一步利用IL-17A-/-小鼠,探讨Vγ4γδT细胞在S.aureus感染中的机制。结果发现,与WT组小鼠相比,IL-17A-/-小鼠乳腺中细菌定殖量显着增加,病理程度加剧,趋化因子KC、MIP-2及IL-8的表达量显着降低。流式细胞术检测WT小鼠与IL-17A-/-小鼠乳腺组织内中性粒细胞的数量,结果显示,与WT组相比,IL-17A-/-小鼠乳腺内中性粒细胞数量显着降低,提示γδT细胞是通过分泌IL-17A,进而招募趋化因子,募集中性粒细胞,清除细菌,发挥免疫保护作用。研究结论:1.γδT细胞是乳腺感染S.aureus早期最主要的T淋巴细胞类型。这类细胞高表达CD44和CD69分子,并分泌IL-17A和IFN-γ。2.敲除γδT细胞后,乳腺中性粒细胞和趋化因子减少,乳腺炎症和细菌定殖量增加。表明γδT细胞在乳腺S.aureus感染早期对细菌清除和降低组织损伤方面起关键的正调控作用。敲除γδT细胞后,乳腺Th1、Th17、Tc以及Treg细胞比例降低,提示γδT细胞可能对机体适应性免疫应答具有一定的调节作用。3.S.aureus感染后,γδT细胞以Vγ1和Vγ4两种亚型为主,Vγ1γδT细胞主要分泌IFN-γ,Vγ4γδT细胞主要分泌IL-17A。Vγ1γδT细胞和Vγ4γδT细在乳腺S.aureus感染早期对细菌清除和降低组织损伤方面起关键的正调控作用,是抵御S.aureus感染的主要γδT细胞亚型。4.乳腺Vγ4γδT细胞通过分泌IL-17A,进而招募趋化因子,募集中性粒细胞,清除细菌,发挥免疫保护作用。本研究丰富了乳腺局部抗感染免疫应答的资料,为S.aureus乳腺炎的预防和治疗提供理论依据与实验数据。
马占川[7]（2020）在《MDSC分泌的Arg-1对肠炎小鼠Th17细胞的影响及橡黄素治疗机制的研究》文中研究表明研究背景与目的:在炎症性肠炎（Inflammatory bowel disease,IBD）中,多种免疫细胞和肠道菌群相互影响共同导致肠炎进展。其中,由于Th17细胞在肠炎中的关键作用成为近年来研究的热点。我们先前的研究结果表明髓系来源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSC）通过分泌 Ⅰ 型精氨酸酶（arginase-1,Arg-1）促进Th17细胞的分化,从而加重系统性红斑狼疮的进展。但是在炎症性肠炎中,MDSC与Th17细胞的关系仍不明确,阻碍了肠炎治疗的研究。此外,橡黄素在肠炎治疗中的表现出一定功效,但其作用机制还有待于进一步研究。因此,本研究以髓系细胞Arg-1敲除（ArgmyeKO）小鼠构建肠炎模型,研究MDSC对Th17细胞功能的影响,并探究橡黄素在肠炎治疗中的作用机制,为炎症性肠炎的治疗提供新的思路。研究方法:（1）3.5%葡聚糖硫酸钠喂养ArgmyeKO小鼠或野生型小鼠8～12天得到肠炎小鼠。从喂养之日起每天记录小鼠体重,对粪便硬度,粪便潜血水平进行评分,直至小鼠死亡,测量结直肠长度。以时间为横坐标评分为纵坐标绘制肠炎小鼠疾病得分曲线,以时间为横坐标存活率为纵坐标绘制肠炎小鼠生存曲线,对比两组肠炎小鼠结直肠长度,借此评估肠炎状态下Arg-1对小鼠的影响。（2）流式分选纯化肠炎小鼠脾脏MDSC,与带有CFSE标记的CD3、CD28刺激的小鼠T细胞共培养3天,流式检测评估Arg-1敲除对MDSC功能的影响。（3）在肠炎发病前后收集小鼠外周血,脾脏细胞以及派氏集合淋巴结细胞检测MDSC、Th17细胞、Treg细胞以及γδT细胞的比例。取肠炎小鼠结直肠做HE染色评估免疫细胞浸润状态和肠粘膜屏障受损情况。（4）流式检测肠炎小鼠MDSC Arg-1的分泌,检测Th17细胞IL-17A、IL-17F以及IL-22的分泌;荧光定量PCR检测肠炎小鼠结直肠组织中ACTI、IL-22、IL-23、OCLN、COX-2 的表达。（5）流式分选纯化野生型小鼠脾脏MDSC,转输给ArgmyeKO小鼠,记录小鼠体重,粪便硬度,便血程度,结直肠长度。流式检测转输MDSC后肠炎小鼠派氏集合淋巴结和肠黏膜淋巴结中Th17细胞IL-17A、IL-17F的表达水平。（6）在第0,3,5,7天给肠炎小鼠腹腔注射橡黄素,橡黄素用量按0.5 μM/g体重计算。记录小鼠体重,粪便硬度,便血程度,结直肠长度。流式检测肠炎小鼠外周血,脾脏以及肠道固有层中MDSC 比例以及Arg-1和pSTAT3的水平,分选脾脏MDSC荧光定量PCR检测ESRI、ESR2的水平,检测小鼠脾脏和外周血派氏集合淋巴结和肠黏膜淋巴结中Th17细胞和γδT细胞IL-17A、IL-17F的表达水平。荧光定量PCR检测橡黄素治疗后肠炎小鼠结直肠组织中ACT1、IL-22、IL-23、OCLN、COX-2 的表达。研究结果:（1）肠炎期间Argmye KO小鼠体重下降明显,便血严重,肠组织中大量免疫细胞浸润,死亡率高于WT组小鼠。（2）肠炎期间ArgmyeKO小鼠结直肠组织IL-17A表达水平低于WT组小鼠;IL-17F表达水平高于WT组小鼠。ArgmyeKO小鼠派氏集合淋巴结中Th17细胞IL-17A的分泌量低于WT组小鼠,而IL-17F表达量则高于WT组小鼠。（3）肠炎期间ArgmyeKO小鼠肠组织和外周血中MDSC L比例低于WT组小鼠;其中M-MDSC 比例显着低于WT组,G-MDSC 比例组间无统计学意义。脾脏MDSC 比例在组间无统计学意义。此外,ArgmyeKO小鼠MDSC三个抑制分子Arg-1,iNOS,IDO表达水平低于WT组小鼠。ArgmyeKO小鼠结直肠中ACT1和COX-2表达量高于WT组小鼠;IL-22,IL-23,OCLN表达量在ArgmyeKO小鼠结直肠中更低。（4）转输WT来源的MDSC后,ArgmyeKCO小鼠便血减轻,体重流失程度减轻,结直肠比对照组小鼠更长。流式结果显示转输MDSC后,ArgmyeKO小鼠派氏集合淋巴结和肠黏膜淋巴结中Th17细胞分泌更多的IL-17A;而IL-17F的表达量低于对照组。（5）给予橡黄素治疗后,肠炎小鼠疾病评分降低,体重降低程度减轻,结直肠长度比对照组小鼠更长。流式结果显示治疗组小鼠外周血,脾脏和肠组织中MDSC 比例明显升高。MDSC表面雌激素受体表达量上升,胞内pSTAT3水平提高,MDSC分泌更多Arg-1。（6）给予橡黄素治疗后,肠炎小鼠结直肠组织IL-17A、IL-17F表达量升高。流式结果显示派氏集合淋巴结,肠黏膜淋巴结中Th17细胞和γδ T细胞分泌更多IL-17A;而IL-17F水平也高于对照组小鼠。治疗组小鼠结直肠中ACT1,IL-22,IL-23和OCLN表达量高于对照组小鼠;COX-2表达水平下降。结论:本研究发现在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中,激活MDSC中ESR/STAT3信号通路可以上调MDSC Arg-1的分泌水平。经橡黄素治疗后,肠炎小鼠体内MDSC 比例显着升高并分泌大量Arg-1。Arg-1提高Th17细胞IL-17A的表达同时抑制IL-17F的水平,促进肠粘膜修复相关因子的表达,从而缓解肠炎。我们的数据强调了 MDSC来源的Arg-1在小鼠肠炎中对Th17细胞IL-17A和IL-17F的调节作用,揭示了橡黄素缓解肠炎发病的机制,并为肠炎的治疗提供了新的思路。
佟柏楠[8]（2020）在《CD161分子在自身免疫性葡萄膜炎中的表达及其作用机制的研究》文中认为研究背景:葡萄膜炎是指发生于虹膜、睫状体、脉络膜组织、玻璃体、视网膜及视网膜血管炎症的总称。葡萄膜炎的病因复杂,但以自身免疫紊乱所导致的葡萄膜炎最为常见,而自身免疫性葡萄膜炎比较常见为Behcet病和Vogt-小柳原田综合征。自身免疫性葡萄膜炎病情复杂、病程长、易反复发作、治疗困难,严重影响患者的视觉功能和生活质量。近年来,人们对葡萄膜炎的免疫发病机制进行了广泛的研究,发现多种抗原或自身抗原、天然免疫细胞、适应性免疫细胞和细胞因子均参与了葡萄膜炎的发病过程,其中CD4+T细胞,包括Th1、Th17、Th22和Treg细胞及其相关的细胞因子在葡萄膜炎的发病过程中起着关键作用。因此,从免疫学和分子生物学角度探究葡萄膜炎患者炎症性反应和适应性免疫系统调节机制,对寻找葡萄膜炎治疗的靶点具有重要意义。CD161分子是一种同型二聚体C型凝集素,这一表面分子最初被认为是在啮齿类动物NK细胞上表达的NKRP1糖蛋白的人类同源物,与啮齿类动物的同源物具有46%-47%的同源性。最近有研究证实CD161在人类T细胞中也有表达,在外周血淋巴细胞中,CD161不仅表达于CD4+TCRαβ+T细胞,还可以表达于CD8+TCRαβ+T细胞、CD4-CD8-TCRαβ+T细胞和CD4-CD8-TCRγδ+T细胞。CD161intCD4+和CD161highCD8+T细胞也已从胎儿脐带血（UCB）中分离出来,它们在脐带血中表现出幼稚表型。在存在Th17极化细胞因子培养的情况下,IL-17的产生仅限于CD161+CD4+CD45RA+部分,这意味着Th17细胞来源于CD161+CD4+T细胞的祖细胞。并且CD161分子可能作为IL-17产生的细胞标记物,参与了细胞免疫反应。已有大量研究表明CD161可以激活诱导T细胞扩增、CD161的多态性、可以识别CD161+T细胞上的其他受体等一系列功能,使得CD161分子有可能作为治疗多种疾病的潜在治疗靶点。cAMP反应元件调控因子α（CREMα）属于转录因子超家族中的一员。人类多于20种的CREM异构体是通过差异剪接过程、转录因子、启动子和启动密码子来实现的。CREM的表达通过组织细胞和发育特异性机制受到了严格的调控。因此,CREM介导的基因转录选择性表达在一些细胞中（如雄性生殖细胞、肾上腺细胞、垂体细胞和T淋巴细胞）并被人们广泛研究。人类T淋巴细胞主要表达CREMα这一亚型,最近的研究表明,CREMα可以激活CD4+T细胞中某些细胞因子基因的转录,还影响IL-17家族细胞因子的表观遗传修饰和转录调控。CREMα被认为是免疫细胞中组织特异性基因调控的中心贡献者。由此推测CD161分子和CREMα可能参与了自身免疫性葡萄膜炎的发病过程,两者可能存在着相互调控关系,并在自身免疫性葡萄膜炎发病中发挥着一定的作用。目的:本研究的目的是检测活动期葡萄膜炎患者外周血中T细胞表达CD161分子的水平,探讨CD4+CD161+T细胞的作用机制,并进一步研究CREMα与CD161分子表达水平之间可能的调控关系。方法:1.活动期葡萄膜炎患者外周血中T细胞表面CD161分子的分布与表达本研究以我国最为常见的葡萄膜炎类型BD和VKH患者作为研究对象。利用流式细胞术检测CD161分子在活动期BD和VKH患者治疗前后T细胞中的分布和表达,以无自身免疫性疾病的正常人作为对照。利用Luminex检测对照组和活动期BD和VKH患者治疗前后血清中IL-17A等细胞因子的表达情况。2.环孢素对CD161分子的作用和影响体外将环孢素与活动期葡萄膜炎患者和对照组的外周血单个核细胞共培养。利用流式细胞术检测环孢素作用前后活动期BD和VKH患者组和对照组T细胞中CD161分子的表达情况。利用Luminex检测环孢素作用前后活动期BD和VKH患者组和对照组细胞培养上清中IL-17A等细胞因子的表达情况。3.活动期自身免疫性葡萄膜炎患者中CREMα的表达利用免疫磁珠分选出活动期葡萄膜炎患者和对照组外周血中的CD4+T细胞,采用RT-qPCR法和Western blot法研究CD4+T细胞中CREMα、CD161、RORγt和IL-17A转录水平和蛋白水平的表达情况。4.CREMα对CD161分子表达的调控作用利用小干扰RNA技术,向活动期BD和VKH患者外周血CD4+T细胞中转染CREMαsiRNA以抑制CREMα的表达水平,利用RT-qPCR法和Western blot法检测CD161、RORγt和IL-17A mRNA和蛋白的表达变化。结果:1.CD161分子在CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞中均有表达。活动期BD和VKH患者外周血中CD161+CD3+和CD161+CD3+CD4+T细胞比例显着高于对照组。活动期BD和VKH患者外周血中CD161+Th17细胞水平明显高于健康对照组和治疗后的患者组。进一步分析了对照组和活动期BD和VKH患者治疗前后外周血中CD4+CD161+和CD4+CD161-T细胞分泌IL-17A的水平,结果显示CD4+CD161+T细胞分泌IL-17A的水平明显高于CD4+CD161-T细胞。检测对照组和活动期BD和VKH患者治疗前后血清中IL17A等细胞因子的表达情况,结果显示活动期BD和VKH患者的IL-6、IL-17A、IFN-γ和TNF-α水平均高于健康对照组和治疗后的患者组。2.体外加入环孢素后可显着下调活动期BD和VKH患者组CD161的表达水平及Th17细胞的比例。同时也可显着下调对照组CD161的表达水平及Th17细胞的比例,因此其作用为非特异性。对照组和活动期BD和VKH患者组细胞培养上清中IL-1β、IL-2、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF等细胞因子的表达情况,同样显示环孢素可以非特异性降低这些细胞因子的表达水平。3.活动期BD和VKH患者外周血CD4+T细胞中CREMα、CD161、RORγt和IL-17A mRNA转录水平与蛋白表达水平均明显高于对照组和治疗后的患者组。4.向活动期BD和VKH患者的CD4+T细胞中转染CREMαsiRNA后,CREMα表达受到抑制,同时CD161、RORγt和IL-17AmRNA转录水平与蛋白表达水平也降低。结论:CD161分子在CD4+和CD8+T细胞中均有分布,在活动期自身免疫性葡萄膜炎患者外周血CD4+T细胞中高表达,并且CD4+CD161+T细胞与IL-17A的分泌有关,CREMα作为转录因子,参与了CD161、RORγt和IL-17A的表达调控,环孢素在控制临床炎症的同时,可以抑制CD161分子及Th17细胞的频率和细胞因子的表达,提示CD161分子或CREMα可作为治疗自身免疫性葡萄膜炎的新靶点。
王玥琦[9]（2020）在《固本止咳中药方对慢阻肺模型小鼠呼吸道黏膜免疫细胞及因子的影响》文中提出背景:慢性阻塞性肺疾病是以不完全可逆的气流受限为特征的阻塞性肺病。急慢性炎症交替持续存在,造成气道重构和肺气肿,表现为劳力性呼吸困难等,为患者的日常生活和社会带来沉重负担。中医药治疗慢阻肺不仅可缓解症状,还能减少急性加重,延缓疾病进展,而其机制缺乏深入研究。黏膜免疫具有重要作用,但中医药对呼吸道黏膜免疫影响机制的研究数量少、处于起步阶段。固本止咳中药方是一个针对慢阻肺稳定期的病机特点,具有扶正祛邪之功效的经验方。前期临床研究表明其能够缓解患者的症状、提高肺功能、调节免疫功能。动物实验研究显示其能够减轻慢阻肺模型小鼠气道炎症,改善肺功能和病理损伤,机制有待进一步研究。目的:1.研究固本止咳中药方对呼吸道黏膜免疫中关键细胞γ δT细胞及其细胞因子KGF的影响,探究其对黏膜免疫功能的影响及扶正祛邪的机制。2.研究固本止咳中药方对循环中及黏膜局部炎症因子的影响,探讨其改善患者症状及疾病进展严重程度的机制。3.为黏膜免疫功能与“卫气”之间的联系、为中医药以扶正固本实现“治未病”以及为从调节黏膜免疫入手治疗慢阻肺提供实验依据。方法:按照固本止咳中药方制作干浸膏,配制成高剂量0.55g生药/ml、中剂量0.28g生药/ml、低剂量0.09g生药/ml。将125只SPF级ICR雌性小鼠随机分为5组:空白对照组、模型对照组、固本止咳中药方高、中、低剂量组,每组25只。采用持续香烟烟雾暴露12周（除第1、29、57天）加经鼻腔向呼吸道滴入LPS溶液（第1、29、57天,共3次）的方法建立慢阻肺小鼠模型,而后两对照组用蒸馏水、中药组用固本止咳中药方溶液灌胃,共4周。造模及药物干预过程中观察其一般生理活动,监测体重。灌胃结束后用小动物肺功能仪测量肺功能。肺组织切片HE染色后观察形态学改变及细胞浸润,评价小鼠造模效果;肺组织切片进行免疫组化染色,检测小鼠肺组织中α βTCR和γ δ TCR表达情况、KGF和KGFR分泌情况;参考小肠黏膜上皮细胞间淋巴细胞分离方法,总结出肺组织淋巴细胞分离方法,用流式细胞术分析其中的αβT细胞和γ δ T细胞群;肺组织匀浆后采用Western Blot方法检测其中的KGF和KGFR蛋白,应用ELISA方法检测KGF蛋白含量,并用RT-PCR法检测KGF的mRNA水平;收集小鼠的血清、支气管肺泡灌洗液和肠黏液,用ELISA方法检测其中的炎性因子IL-6和IL-13水平。结果:1.一般生命质量情况:空白对照组小鼠无死亡,皮毛光泽柔顺,呼吸和缓,频率适中,节律均匀,活动正常,体重逐渐增加;慢阻肺模型组小鼠死亡10只,毛发枯暗,部分有脱毛,熏烟时躁动蹿跳,后期多扎堆蜷缩,甚则全身颤抖,呼吸急促,胸腹部起伏明显,时有不规则点头运动,甚者张口呼吸,体重较空白组明显偏低（P<0.001）。高剂量、中剂量固本止咳中药方组分别死亡1只,低剂量固本止咳中药方组死亡4只,造模期间一般情况同慢阻肺模型组,给予中药灌胃后与模型组相比毛发较顺泽,躁动程度有所减轻,呼吸困难可见改善,频率减缓,高剂量、低剂量固本止咳中药方组体重明显高于模型组（P<0.001）。2.肺组织切片HE染色显示空白对照组小鼠气道和肺泡结构正常,纤毛整齐,肺泡形状、大小规整,气道黏膜上皮完整;模型对照组支气管黏膜皱襞形成、有片状脱落,使管腔变窄或闭塞;肺泡壁破坏,肺泡腔不规则扩大,部分融合成肺大泡,气道周围及肺间质可见炎症细胞浸润,符合慢阻肺病理学表现。经固本止咳中药方治疗的三组与模型对照组对比,可见形态学方面的改善,体现在支气管和肺泡结构较完整,管腔狭窄程度减轻,气道黏膜上皮相对完整,纤毛排列规则、脱落减少,肺泡大小比较均匀,肺大泡数量减少,气道管壁周围及肺间质内炎症细胞浸润程度减轻。3.肺功能测量:模型对照组呼吸系统粘性阻力、弹性阻力明显高于空白对照组（P<0.05）;呼吸系统动态顺应性明显低于空白对照组（P<0.05）。高、中、低剂量固本止咳中药方组呼吸系统粘性阻力明显低于模型对照组（P<0.05）;中剂量固本止咳中药方组弹性阻力明显低于模型对照组（P<0.05）、呼吸系统动态顺应性明显高于模型对照组（P<0.05）。肺组织阻尼模型对照组明显高于空白对照组（P<0.05）;高剂量、低剂量中药组明显低于模型对照组（P<0.05）。准静态顺应性高剂量固本止咳中药方组明显高于模型对照组,准静态弹性量高剂量固本止咳中药方组明显低于模型对照组（P<0.05）。4.肺组织免疫组化染色实验中,空白对照组可见α β T细胞、γ δT细胞均少量存在于肺组织中;模型对照组几乎未见γ δT细胞存在;高、中、低剂量固本止咳中药方组,可见较多γ δ T细胞存在于气管附近,较模型组有明显升高,小鼠肺组织α β T/γ δT细胞比例在模型组较空白对照组升高,固本止咳中药方组较模型组呈降低趋势。5.肺组织淋巴细胞流式分析:小鼠γδT细胞比例在模型组较空白对照组有降低的趋势,低剂量固本止咳中药方组较模型组有明显升高（P<0.05）。6.肺组织切片免疫组织化学染色,空白对照组肺组织中有少量KGF表达;模型对照组少于空白对照组;高、中、低剂量固本止咳中药方组KGF表达明显高于模型组,且稍高于空白对照组。7.Western blot检测结果显示,KGF、FGFR2蛋白表达量模型对照组较空白对照组明显降低（P<0.05）,中剂量固本止咳中药方组KGF表达较模型对照组明显升高（P<0.05）,高剂量固本止咳中药方组、低剂量固本止咳中药方组FGFR2表达较模型对照组明显升高（P<0.05）。8.ELISA检测结果显示,高剂量固本止咳中药方组KGF蛋白含量较模型对照组明显升高（P<0.05）。9.Real Time PCR检测结果显示,KGF蛋白的mRNA含量模型对照组明显低于空白对照组,中、低剂量中药组明显高于模型对照组（P<0.05）。10.小鼠血清中的IL-6含量慢阻肺模型对照组高于空白对照组（P<0.05）,高剂量中药组低于模型对照组（P<0.05）;血清中的IL-13含量各组间未见明显差异。BALF中的IL-6含量慢阻肺模型对照组高于空白对照组（P<0.05）;高剂量中药组与模型组对照组对比无统计学差异,中剂量中药组低于空白对照组、模型对照组以及高剂量中药组（P<0.05）,低剂量中药组低于空白对照组、模型对照组以及高剂量中药组（P<0.05）;BALF中的IL-13含量慢阻肺模型对照组高于空白对照组（P<0.05）,高剂量中药组以及中剂量中药组低于模型组对照组（P<0.05）。肠黏液中的IL-6含量各组间未见明显差异;肠黏液中的IL-13含量慢阻肺模型对照组高于空白对照组（P<0.05）,高、中、低剂量中药组低于模型组对照组（P<0.05）。结论:1.持续香烟烟雾暴露加经鼻腔向呼吸道内滴入LPS溶液的方法造成小鼠肺部形态学病理改变以及肺功能改变与慢阻肺的特征相吻合。2.固本止咳中药方由黄芪、淫羊藿、炒白术、百部、黄芩、赤芍、防风组成,其可以提高慢阻肺模型小鼠生命质量及体重。3.固本止咳中药方可以改善慢阻肺模型小鼠肺组织形态学病理变化。4.固本止咳中药方治疗可减轻慢阻肺模型小鼠呼吸道阻塞程度、提高肺组织顺应性。5.固本止咳中药方明显减低慢阻肺模型小鼠血清和BALF中的IL-6含量以及BALF和肠黏液中的IL-13含量,有效控制气道及全身炎症状态,改善气道及肺组织结构损伤。6.固本止咳中药方通过调节慢阻肺模型小鼠肺组织γ δT细胞比例,促进KGF及KGFR的分泌,加快肺组织损伤的修复,起到改善呼吸道黏膜完整性、增强黏膜免疫功能的作用。与固本止咳中药方通过扶正祛邪、补气助阳、健脾益肾、止咳化痰、活血化瘀,从而增强“卫气”的作用彼此呼应。据此推测,呼吸道黏膜免疫功能是“正气卫外”作用的物质基础之一,中医药通过调节黏膜免疫功能,实现“扶正祛邪”的作用,从而达到延缓疾病进展、减少急性发作的目的,为慢阻肺的治疗提供了新的思路。7.根据肠上皮细胞间淋巴细胞提取方法,在本研究中总结并完善的肺组织淋巴细胞提取分离的实验操作方法,也将为呼吸道黏膜免疫的研究提供实验基础。
王盛东[10]（2020）在《丙戊酸钠联合唑来膦酸增强γδ T细胞介导的杀伤骨肉瘤效应》文中提出骨肉瘤是发病率最高的原发恶性骨肿瘤,常见于儿童和青少年,具有局部侵犯和早期肺转移的趋势。通过使用新辅助化疗联合手术的治疗方案,已经将骨肉瘤患者的5年生存率提高到了60%-80%,但在过去的近40年间并未得到进一步改善。尤其是对于复发和发生肺转移的患者,目前尚无有效的治疗手段,预后极差。同时,目前临床的一线化疗药,如甲氨蝶呤、阿霉素、顺铂、异环磷酰胺等毒副作用很大,且耐药的情况常有发生,疗效有限。因此,寻找新型、高效和安全的治疗方案是目前亟待解决的问题。免疫治疗被认为是除手术、化疗、放疗以外的第四大治疗手段。其中,过继细胞输注治疗（ACT）是最有前景的免疫治疗方案之一,已经在白血病的研究中取得了显着的成果。包括NK细胞、巨噬细胞和T细胞在内的各种免疫细胞均被研究应用于ACT中,尤其是T细胞,因其在抗肿瘤免疫效应中扮演着重要角色,成为ACT的首选效应细胞。然而,包括骨肉瘤在内的多数实体肿瘤,都缺少特异性、高表达的免疫治疗靶点,成为了ACT应用的一个主要限制因素。γδT细胞占外周血T细胞的1～10%,因其能够直接识别肿瘤细胞并且不依赖MHC的限制而被认为是充满前景的效应T细胞。活化的γδT细胞能够产生穿孔素、颗粒酶和炎症因子直接杀伤被识别的肿瘤细胞,从而产生有效的抗肿瘤效应。本课题组在先前研究已经证实通过唑来膦酸（ZOL）预处理后,γδT细胞能够在体外对骨肉瘤细胞和软骨肉瘤细胞产生显着的杀伤效应。因而,过继转移γδT细胞有望成为治疗包括骨肉瘤在内的各种恶性实体肿瘤的一种有效治疗方案。然而,大量体外研究显示诱导γδT细胞产生强大的免疫效应所需的ZOL浓度较高,已超出体内实验和临床应用所能长时间维持的浓度。因而,我们需要寻找有效的佐剂以增强ZOL的作用,从而降低其诱导γδT细胞发挥显着免疫效应所需的浓度,促进该方案的临床应用。丙戊酸钠（VPA）是已经得到FDA批准的一种去乙酰化酶抑制剂,临床广泛应用于抗癫痫治疗。近年来研究显示VPA还具有抑制肿瘤细胞增殖和激活免疫系统的潜在作用。不仅如此,VPA还表现出能够增强包括放疗、化疗和多种免疫治疗杀伤肿瘤效应的潜能,并且对正常组织毒性较小。早有研究报道组蛋白去乙酰化酶抑制剂或许具有增强γδT细胞免疫效应的作用,其中VPA似乎与γδT细胞的多种功能相关,具体仍有待进一步阐明。综上,我们推测VPA能够联合ZOL发挥协同作用,显着增强γδT细胞介导的抗骨肉瘤免疫效应。本次研究中,我们发现VPA能够显着的增强ZOL诱导的γδT细胞抗骨肉瘤效应,表现出协同作用。并且,相比单药刺激,VPA联合ZOL刺激的γδT细胞,表达更高水平的细胞毒作用相关的标记分子和炎症因子等,包括CD107a、Perforin和IFN-γ等。我们进一步发现VPA和ZOL能够协同阻断甲羟戊酸途径,引起中间产物积聚,从而激活γδT细胞。我们还通过建立免疫缺陷鼠骨肉瘤模型,进行过继输注γδT细胞实验。结果显示,相比单ZOL处理组,VPA联合ZOL能够显着增强γδT细胞的体内抗骨肉瘤效应,有效抑制骨肉瘤的增长,并促进T细胞的浸润。组织学检测也显示联合处理组表现出最显着的甲羟戊酸通路阻断效果。我们还搜集了7例骨肉瘤临床样本,来自原发、复发、转移和化疗耐药等不同患者,分离培养获得原代骨肉瘤细胞。实验结果表明VPA联合ZOL能够协同增强γδT细胞杀伤原代骨肉瘤细胞的作用,为该治疗方案的临床试验提供依据。综上,本研究表明VPA联合ZOL能够协同阻断甲羟戊酸通路,引起中间产物积聚,从而刺激γδT细胞发挥强大的杀伤骨肉瘤效应。
二、人类γδT细胞细胞毒活性的调控机制和作用途径（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人类γδT细胞细胞毒活性的调控机制和作用途径（论文提纲范文）
（1）肺癌肿瘤微环境的系统解析及靶向中药发现（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肿瘤微环境的复杂性与异质性 |
| 1.2 肿瘤微环境的解析方法 |
| 1.2.1 通过原位免疫组织化学分析肿瘤微环境 |
| 1.2.2 利用细胞计数仪分析肿瘤微环境的细胞组成 |
| 1.2.3 基于基因表达谱估算肿瘤微环境的组成 |
| 1.3 免疫检查点阻断治疗与肺癌肿瘤微环境解析 |
| 1.3.1 免疫检查点阻断治疗 |
| 1.3.2 肺癌肿瘤微环境解析 |
| 1.4 肿瘤微环境的多通路调控与中药调控 |
| 1.4.1 多通路调控抗肿瘤免疫力 |
| 1.4.2 中药治疗与抗肿瘤免疫力 |
| 1.4.3 系统药理学发现激活抗肿瘤免疫力的中药 |
| 1.5 本论文研究内容 |
| 第二章 整合单细胞转录组解析非小细胞肺癌肿瘤微环境 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 非小细胞肺癌scRNA数据收集以及细胞类型鉴定 |
| 2.2.2 TCGA肺腺癌和肺鳞癌转录组数据以及临床特征收集 |
| 2.2.3 基于单细胞转录组的NSCLC肿瘤微环境细胞丰度分析 |
| 2.2.4 多因素组合分型生存分析 |
| 2.2.5 基于肿瘤微环境组成的肺腺癌和肺鳞癌的分型 |
| 2.2.6 统计分析 |
| 2.2.7 基于受体—配体关系的细胞间相互作用 |
| 2.2.8 细胞丰度离散程度评估 |
| 2.3 结果和讨论 |
| 2.3.1 非小细胞肺癌肿瘤微环境细胞图谱构建 |
| 2.3.2 非小细胞肺癌肿瘤微环境细胞图谱概述及准确性评估 |
| 2.3.3 探索非小细胞肺癌基质细胞的丰度异质性以及分布特征 |
| 2.3.4 肿瘤微环境中细胞丰度与临床特征的关联 |
| 2.3.5 预测潜在的免疫治疗靶点 |
| 2.3.6 推断潜在的免疫检查点阻断治疗响应的生物标记 |
| 2.3.7 肺癌存在着复杂的、异质的细胞间通讯 |
| 2.3.8 .基于肿瘤微环境组成的非小细胞细胞肺癌分类 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 基于肿瘤微环境细胞图谱的肺癌生存期预测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 方法与材料 |
| 3.2.1 TCGA肺腺癌和肺鳞癌细胞图谱解析 |
| 3.2.2 统计分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1.肺腺癌和肺鳞癌多元线性Cox回归模型构建 |
| 3.3.2.基于微环境组成的风险指数模型对肺腺癌和肺鳞癌生存期的预测 |
| 3.3.3.基于微环境组成的风险指数独立于多种临床特征 |
| 3.3.4.微环境组成的风险指数在不同临床特征下对生存期的预测作用 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 系统药理学:PD-1/PDL1 阻断组合治疗的新策略 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 方法和材料 |
| 4.2.1 非小细胞肺癌微环境细胞图谱 |
| 4.2.3 利用网络扩散方法发现与肿瘤微环境表型相关的靶通路 |
| 4.2.4 评价非小细胞肺癌肿瘤微环境中基因表达的细胞特异性 |
| 4.2.5 药代动力学评价 |
| 4.2.6 靶点预测 |
| 4.2.7 网络图构建 |
| 4.2.8 RNA测序 |
| 4.2.9 基因集富集分析(GSEA) |
| 4.2.10 样品制备 |
| 4.2.11 细胞培养 |
| 4.2.12 小鼠肿瘤模型 |
| 4.2.13 免疫荧光 |
| 4.2.14 肿瘤组织处理 |
| 4.2.15 流式细胞术检测 |
| 4.2.16 实时定量PCR |
| 4.2.17 数据分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 基于肿瘤微环境细胞图谱的PD-1/PD-L1 抑制剂耐药机制解析 |
| 4.3.2 苦参中潜在的抗肿瘤活性物质及其作用靶点 |
| 4.3.3 氧化苦参碱的靶点与肺腺癌生存预后以及CD8~+T细胞浸润密切相关 |
| 4.3.4 跨尺度的多细胞通路分析揭示氧化苦参碱靶向肿瘤微环境的机制 |
| 4.3.5 氧化苦参碱抑制肿瘤生长并促进肿瘤微环境中CD8~+T 细胞的浸润 |
| 4.3.6 氧化苦参碱增敏抗PD-L1 阻断疗效 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述一 扶正固卫、肺主皮毛理论与慢性阻塞性肺疾病呼吸道损伤修复 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 蛋白质组学在中医药中的应用研究 |
| 参考文献 |
| 第一部分 固本止咳中药对COPD模型小鼠的治疗作用和调控呼吸道损伤修复作用研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 基于组学的固本止咳中药调控COPD模型小鼠呼吸道损伤修复机制的整体研究 |
| 前言 |
| 实验一 基于质谱技术的固本止咳中药成分分析 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 实验二 基于蛋白组学的固本止咳中药调控COPD模型小鼠损伤修复机制研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 基于JAK-STAT信号通路的固本止咳中药调控COPD模型小鼠呼吸道损伤修复机制研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 NLRP3炎症小体介导的免疫抑制在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的作用和机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 γδT17和MDSCs在胃MALT淋巴瘤微环境免疫稳态失衡中的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 第三部分 文献综述 炎症、肿瘤和免疫: 微环境中的密切交流 |
| 一、肿瘤中炎症的类型 |
| 二、炎症与肿瘤的发生发展 |
| 三、炎症反应的关键信号通路与肿瘤 |
| 四、炎症和肿瘤免疫 |
| 五、靶向炎症反应和肿瘤治疗 |
| 六、总结和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论着 |
（4）减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 白血病概述 |
| 1.1.1 白血病的定义及常见症状 |
| 1.1.2 白血病的发现及分类 |
| 1.1.3 白血病发病机制研究进展 |
| 1.1.4 白血病流行病学 |
| 1.1.5 白血病的治疗 |
| 1.2 白血病自发性缓解与细菌感染 |
| 1.3 细菌抗肿瘤研究 |
| 1.3.1 细菌抗肿瘤研究历程 |
| 1.3.2 细菌抗肿瘤的优势 |
| 1.3.3 细菌抗肿瘤的应用前景 |
| 1.4 沙门氏菌抗肿瘤研究 |
| 1.4.1 沙门氏菌有效靶向肿瘤 |
| 1.4.2 沙门氏菌介导肿瘤细胞自我死亡 |
| 1.4.3 沙门氏菌减少肿瘤转移 |
| 1.4.4 沙门氏菌诱发宿主抗肿瘤免疫反应 |
| 1.4.5 沙门氏菌增强肿瘤化疗敏感性 |
| 1.4.6 沙门氏菌联合治疗进一步促进了肿瘤的消退 |
| 1.4.7 沙门氏菌的遗传学改造 |
| 1.4.8 沙门氏菌可作为递呈肿瘤治疗分子载体 |
| 1.5 减毒沙门氏菌VNP20009的研究 |
| 1.5.1 减毒沙门氏菌VNP20009的构建及遗传特点 |
| 1.5.2 减毒沙门氏菌VNP20009的生物分布特性 |
| 1.5.3 减毒沙门氏菌VNP20009的毒理学评价 |
| 1.5.4 减毒沙门氏菌VNP20009的抗肿瘤研究 |
| 1.6 课题研究思路、目的、意义及内容 |
| 1.6.1 研究思路 |
| 1.6.2 研究目的和意义 |
| 1.6.3 研究内容 |
| 第二章 VNP20009对急性淋巴细胞白血病细胞的体内外生长抑制作用及机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株及细胞株 |
| 2.2.2 实验动物及饲养 |
| 2.2.3 试剂与耗材 |
| 2.2.4 主要试剂的配制 |
| 2.2.5 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 细菌-细胞体外共培养实验 |
| 2.3.4 Annexin V-PE/7-ADD双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3.5 L1210皮下瘤模型建立 |
| 2.3.6 动物分组与给药治疗 |
| 2.3.7 石蜡切片的制备 |
| 2.3.8 石蜡切片苏木素&伊红(H&E)染色分析 |
| 2.3.9 石蜡切片缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光分析 |
| 2.3.10 总蛋白的提取 |
| 2.3.11 蛋白浓度测定 |
| 2.3.12 Western Blot检测目标蛋白 |
| 2.3.13 统计学分析 |
| 2.4 研究结果 |
| 2.4.1 VNP20009 体外抑制L1210/Jurkat细胞增殖 |
| 2.4.2 VNP20009 体外诱导L1210/Jurkat细胞凋亡 |
| 2.4.3 VNP20009治疗L1210细胞荷瘤小鼠体重和活动未见异常 |
| 2.4.4 VNP20009抑制L1210皮下移植瘤生长 |
| 2.4.5 VNP20009引起L1210皮下移植瘤组织坏死 |
| 2.4.6 VNP20009诱导L1210皮下移植瘤细胞凋亡 |
| 2.4.7 VNP20009治疗L1210皮下移植瘤凋亡蛋白表达量升高 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 VNP20009对急性髓系白血病细胞的体内外生长抑制作用及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株及细胞株 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 主要试剂与耗材 |
| 3.2.4 主要试剂的配制 |
| 3.2.5 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 3.3.2 细胞培养 |
| 3.3.3 细菌-细胞体外共培养实验 |
| 3.3.4 Annexin V-PE/7-ADD双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.3.5 HL-60皮下瘤模型建立 |
| 3.3.6 动物分组与给药治疗 |
| 3.3.7 石蜡切片的制备 |
| 3.3.8 石蜡切片苏木素&伊红(H&E)染色分析 |
| 3.3.9 石蜡切片缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光分析 |
| 3.3.10 总蛋白的提取 |
| 3.3.11 蛋白浓度测定 |
| 3.3.12 Western Blot检测目标蛋白 |
| 3.3.13 统计学分析 |
| 3.4 研究结果 |
| 3.4.1 VNP20009体外抑制HL-60细胞增殖 |
| 3.4.2 VNP20009体外诱导HL-60细胞凋亡 |
| 3.4.3 VNP20009治疗HL-60细胞荷瘤小鼠体重和活动情况无异常 |
| 3.4.4 VNP20009抑制HL-60皮下移植瘤生长 |
| 3.4.5 VNP20009引起HL-60皮下移植瘤组织坏死 |
| 3.4.6 VNP20009诱导HL-60皮下移植瘤细胞凋亡 |
| 3.4.7 VNP20009治疗HL-60皮下移植瘤组织凋亡蛋白表达量增加 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 VNP20009 对系统性MLL-AF9 驱动型AML小鼠的治疗作用及免疫激活研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株及细胞 |
| 4.2.2 实验动物 |
| 4.2.3 主要试剂与耗材 |
| 4.2.4 主要试剂的配制 |
| 4.2.5 主要仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 4.3.2 沙门氏菌VNP20009的组织分布 |
| 4.3.3 MLL-AF9 驱动型AML白血病细胞的复苏 |
| 4.3.4 MLL-AF9 驱动型AML白血病细胞小鼠尾静脉注射造模 |
| 4.3.5 抗凝全血样本的采集 |
| 4.3.6 血清样本的采集 |
| 4.3.7 MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血中白血病细胞(GFP+)检测 |
| 4.3.8 血涂片瑞氏-吉姆萨染色 |
| 4.3.9 小鼠外周血细胞分类计数 |
| 4.3.10 原代脾脏单细胞悬液的制备 |
| 4.3.11 原代骨髓单细胞悬液的制备 |
| 4.3.12 原代白血病细胞红细胞裂解处理 |
| 4.3.13 原代白血病细胞的冻存 |
| 4.3.14 MLL-AF9 驱动型AML小鼠分组与给药治疗 |
| 4.3.15 细胞因子与趋化因子的测定 |
| 4.3.16 流式细胞术检测细胞表面分子 |
| 4.3.17 流式细胞术检测胞内细胞因子的表达 |
| 4.3.18 统计学分析 |
| 4.4 研究结果 |
| 4.4.1 VNP20009小鼠组织分布情况 |
| 4.4.2 MLL-AF9 驱动型AML小鼠模型的构建 |
| 4.4.3 VNP20009 治疗MLL-AF9 驱动型AML小鼠体重未见明显异常 |
| 4.4.4 VNP20009 抑制MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血中白血病细胞的增殖 |
| 4.4.5 VNP20009 抑制MLL-AF9 驱动型AML小鼠脾脏中白血病细胞的增殖 |
| 4.4.6 VNP20009 影响MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血细胞的分布 |
| 4.4.7 NP20009对MLL-AF9驱动型AML主要器官重量的影响 |
| 4.4.8 VNVNP20009 延长MLL-AF9驱动型 AML小鼠生存期 |
| 4.4.9 VNP20009调节MLL-AF9驱动型 AML小鼠血清细胞因子&趋化因子的分泌 |
| 4.4.10 VNP20009调节MLL-AF9驱动型 AML小鼠血清细胞因子&趋化因子的分泌 |
| 4.4.11 VNP20009 激活 MLL-AF9驱动型 AML 小鼠外周血中T淋巴细胞的增殖 |
| 4.4.12 VNP20009 促进 MLL-AF9 驱动型 AML 小鼠脾脏中 IFN-γ+效应T淋巴细胞的极化 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）MMF通过抑制Th17细胞及IL-17A下调Vγ4细胞表达KGF的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| Abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 建立吗替麦考酚酯诱导小鼠肠粘膜屏障损伤模型 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 外源性 KGF 对吗替麦考酚酸酯诱导的肠粘损害的 保护作用研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 吗替麦考酚酯降低小鼠肠粘膜Th17细胞比例及IL-17A的表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 总结 |
| 第五章 IL-17A调控Vγ4 细胞表达KGF机制的初步探讨 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料和方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 总结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 γδT细胞在人类疾病中的免疫学作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）γδT细胞在金黄色葡萄球菌乳腺感染中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 金黄色葡萄球菌感染与免疫逃逸 |
| 1.1.1 金黄色葡萄球菌概述 |
| 1.1.2 金黄色葡萄球菌感染的发病机制 |
| 1.1.3 宿主对S.aureus的防御策略 |
| 1.1.4 金黄色葡萄球菌的免疫逃逸策略 |
| 1.2 S.aureus乳腺炎研究进展 |
| 1.2.1 乳腺发育及结构 |
| 1.2.2 乳腺的免疫应答 |
| 1.2.3 金黄色葡萄球菌乳腺炎 |
| 1.2.4 金黄色葡萄球菌乳腺炎的治疗 |
| 1.3 γδT细胞在感染性疾病中的作用 |
| 1.3.1 γδT细胞概述 |
| 1.3.2 γδT细胞亚型及分布 |
| 1.3.3 γδT细胞的抗原识别与活化 |
| 1.3.4 产IL-17的γδT细胞 |
| 1.3.5 产IFN-γ的 γδT 细胞 |
| 1.3.6 γδT细胞在感染性疾病中的功能 |
| 1.4 本课题的研究内容和意义 |
| 第二章 γδT细胞在S.aureus感染中的应答特征研究 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 S.aureus ATCC27543 菌株活化 |
| 2.2.2 S.aureus小鼠乳腺感染模型的建立 |
| 2.2.3 临床观察 |
| 2.2.4 乳腺内S.aureus数量检测 |
| 2.2.5 乳腺组织切片的制备与观察 |
| 2.2.6 qPCR检测乳腺内细胞因子 |
| 2.2.7 ELLISA检测炎性细胞因子变化情况 |
| 2.2.8 流式细胞术检测γδT细胞动态变化情况 |
| 2.2.9 免疫荧光检测乳腺组织中γδT细胞变化情况 |
| 2.2.10 γδT细胞表型检测 |
| 2.2.11 胞内细胞因子染色 |
| 2.2.12 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 S.aureus小鼠乳腺感染模型的建立 |
| 2.3.2 乳腺中γδT 细胞数量在S.aureus感染早期迅速升高 |
| 2.3.3 小鼠脾脏中免疫细胞动态变化结果 |
| 2.3.4 乳腺组织中细胞因子IL-17A、IL-23及IFN-γ的表达量显着增加 |
| 2.3.5 S.aureus感染过程中γδT 细胞高表达CD44和CD69 |
| 2.3.6 乳腺中γδT细胞是IL-17A和 IFN-γ的主要来源细胞 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 γδT细胞在S.aureus感染中的功能研究 |
| 3.1 材料与设备 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 菌株 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 乳腺S.aureus定殖量检测 |
| 3.2.2 乳腺病理切片制备与观察 |
| 3.2.3 乳腺组织MPO及趋化因子KC、MIP2和IL-8 检测 |
| 3.2.4 乳腺组织嗜中性粒细胞检测 |
| 3.2.5 乳腺组织中细胞因子的检测 |
| 3.2.6 乳腺组织T淋巴细胞检测 |
| 3.2.7 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 敲除γδT 细胞后乳腺组织中S.aureus定殖量显着增加 |
| 3.3.2 敲除γδT细胞后乳腺组织病变程度加剧 |
| 3.3.3 敲除γδT细胞后趋化因子表达量及嗜中性粒细胞数量显着减少 |
| 3.3.4 敲除γδT 细胞后乳腺组织MPO活性降低 |
| 3.3.5 敲除γδT 细胞后乳腺组织中IL-17A和 IFN-γ表达量降低 |
| 3.3.6 敲除γδT细胞后Th1型细胞数量减少 |
| 3.3.7 敲除γδT细胞对Th2型细胞数量无显着影响 |
| 3.3.8 敲除γδT细胞后Th17型细胞数量减少 |
| 3.3.9 敲除γδT细胞后Tc型细胞数量减少 |
| 3.3.10 敲除γδT 细胞后Treg细胞数量减少 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 γδT 细胞在S.aureus感染中的作用机制研究 |
| 4.1 材料与设备 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 菌株 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 Vγ1和Vγ4γδT细胞动态变化检测 |
| 4.2.2 Vγ1和Vγ4γδT细胞胞内细胞因子检测 |
| 4.2.3 小鼠乳腺内Vγ1和Vγ4γδT 细胞清除 |
| 4.2.4 Vγ1和Vγ4γδT 细胞清除后乳腺组织细菌定殖量检测 |
| 4.2.5 Vγ1和Vγ4γδT 细胞清除后乳腺组织嗜中性粒细胞检测 |
| 4.2.6 Vγ1和Vγ4γδT 细胞清除后乳腺组织细胞因子检测 |
| 4.2.7 Vγ1和Vγ4γδT 细胞清除后胞内细胞因子检测 |
| 4.2.8 IL-17A~(-/-)小鼠乳腺S.aureus数量检测 |
| 4.2.9 IL-17A~(-/-)小鼠乳腺病理切片制备与观察 |
| 4.2.10 IL-17A~(-/-)小鼠乳腺组织MPO及趋化因子KC、MIP-2和IL-8 检测 |
| 4.2.11 IL-17A~(-/-)小鼠乳腺组织嗜中性粒细胞检测 |
| 4.2.12 统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 S.aureus感染过程中乳腺Vγ1和Vγ4γδT细胞数量显着升高 |
| 4.3.2 乳腺Vγ1γδT 细胞主要产生IFN-γ |
| 4.3.3 乳腺Vγ4γδT细胞主要产生IL-17A |
| 4.3.4 小鼠乳腺内Vγ1和Vγ4γδT 细胞清除效果 |
| 4.3.5 Vγ1和Vγ4γδT 细胞清除后乳腺内细菌定殖量显着增加 |
| 4.3.6 Vγ1和Vγ4γδT 细胞清除后乳腺嗜中性粒细胞数量显着降低 |
| 4.3.7 Vγ1γδT 细胞清除后乳腺组织中IFN-γ表达量显着降低 |
| 4.3.8 Vγ4γδT 细胞清除后乳腺组织中IL-17A表达量显着降低 |
| 4.3.9 IL-17A基因敲除小鼠乳腺S.aureus定殖量增加 |
| 4.3.10 IL-17A基因敲除后乳腺病变程度加剧 |
| 4.3.11 IL-17A基因敲除后乳腺趋化因子表达量及嗜中性粒细胞数量显着降低 |
| 4.3.12 IL-17A基因敲除后乳腺组织MPO活性降低 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 创新点及展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文目录 |
（7）MDSC分泌的Arg-1对肠炎小鼠Th17细胞的影响及橡黄素治疗机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 炎症性肠炎 |
| 1.2.1 炎症性肠炎概述 |
| 1.2.2 炎症性肠炎的机制 |
| 1.2 Th17细胞 |
| 1.2.1 Th17细胞概述 |
| 1.2.2 Th17细胞的起源和发育 |
| 1.2.3 Th17细胞的可塑性 |
| 1.2.4 Th17细胞在IBD中的功能 |
| 1.3 调节性免疫细胞概述 |
| 1.3.1 调节性T细胞 |
| 1.3.2 调节性B细胞 |
| 1.3.3 调节性红细胞 |
| 1.3.4 调节性的髓系细胞 |
| 1.4 MDSC与自身免疫病 |
| 1.4.1 MDSC的起源 |
| 1.4.2 MDSC的功能 |
| 1.4.3 MDSC扩增的调控机制 |
| 1.4.4 MDSC功能的调控机制 |
| 1.4.5 MDSC与自身免疫病 |
| 1.4.6 MDSC在炎症性肠炎中的作用 |
| 1.5 自身免疫病中MDSC与Th17细胞的关系 |
| 1.6 炎症性肠病中MDSC和Th17细胞的展望 |
| 第2章 肠炎小鼠中MDSC影响Th17细胞IL-17A和IL-17F的表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验材料和试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Arg~(myeKO)小鼠的构建 |
| 2.3.2 炎症性肠炎小鼠模型的构建 |
| 2.3.3 肠炎分级评分标准 |
| 2.3.4 外周血单个核细胞的分离 |
| 2.3.5 脾脏单细胞悬液制备 |
| 2.3.6 小肠派氏集合淋巴结细胞分离 |
| 2.3.7 肠系膜淋巴结细胞分离 |
| 2.3.8 结直肠固有层淋巴结细胞分离 |
| 2.3.9 体外刺激PBMC实验 |
| 2.3.10 细胞表面染色 |
| 2.3.11 细胞内染色 |
| 2.3.12 抑制实验 |
| 2.3.13 抑制实验检测 |
| 2.3.14 荧光定量PCR |
| 2.3.15 转输实验 |
| 2.3.16 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 肠炎条件下Arg~(myeKO)小鼠Th17细胞IL-17A表达降低,IL-17F表达升高 |
| 2.4.2 肠炎条件下Arg~(myKO)小鼠MDSC比例下降 |
| 2.4.3 肠炎条件下Arg~(myeKO)小鼠肠组织中保护性因子表达下调 |
| 2.4.4 转输WT小鼠来源的MDSC缓解Arg~(myeKO)小鼠肠炎 |
| 2.5 实验讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 橡黄素通过ESR/STAT3通路促进MDSC存活 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 数据库 |
| 3.2.2 软件 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.2.4 试剂耗材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Arg~(myeKO)小鼠的构建 |
| 3.3.2 体外实验橡黄素处理髓系细胞 |
| 3.3.3 橡黄素治疗肠炎小鼠 |
| 3.3.4 肠炎分级评分标准 |
| 3.3.5 橡黄素互作基因的预测 |
| 3.3.6 基因富集和通路分析 |
| 3.3.7 小鼠骨髓细胞的分离 |
| 3.3.8 荷瘤小鼠脾脏细胞的分离 |
| 3.3.9 人脐带血单个核细胞的分离 |
| 3.3.10 细胞表面染色 |
| 3.3.11 细胞内染色 |
| 3.3.12 荧光定量PCR |
| 3.3.13 数据分析及统计方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 MDSC雌激素受体的激活通过STAT3通路上调Arg-1的分泌 |
| 3.4.2 扩增的MDSC减轻DSS诱导的小鼠肠炎 |
| 3.5 实验讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 在肠炎小鼠中橡黄素通过MDSC产生的Arg-1调节Th17细胞因子分泌 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验材料和试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Arg~(myeKO)小鼠的构建 |
| 4.3.2 橡黄素治疗实验 |
| 4.3.3 外周血单个核细胞的分离 |
| 4.3.4 脾脏单细胞悬液制备 |
| 4.3.5 小肠派氏集合淋巴结细胞分离 |
| 4.3.6 肠系膜淋巴结细胞分离 |
| 4.3.7 结直肠固有层淋巴结细胞分离 |
| 4.3.8 体外刺激PBMC实验 |
| 4.3.9 细胞表面染色 |
| 4.3.10 细胞内染色 |
| 4.3.11 荧光定量PCR |
| 4.3.12 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 橡黄素通过上调ESR/pSTAT3促进MDSC促进Arg-1分泌 |
| 4.4.2 MDSC分泌的Arg-1促进Th17细胞IL-17A的表达,抑制IL-17F的水平 |
| 4.4.3 MDSC来源的Arg-1促进小鼠肠组织中保护性因子表达下调 |
| 4.5 实验讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（8）CD161分子在自身免疫性葡萄膜炎中的表达及其作用机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 葡萄膜炎免疫学发病机制及治疗最新研究进展 |
| 1.1.1 葡萄膜炎概述 |
| 1.1.2 抗原在葡萄膜炎发病中的作用 |
| 1.1.3 天然免疫细胞在葡萄膜炎发病中的作用 |
| 1.1.4 自身免疫性T细胞和细胞因子在葡萄膜炎中的作用 |
| 1.1.5 其它细胞因子在葡萄膜炎中的作用 |
| 1.1.6 葡萄膜炎治疗的最新研究进展 |
| 1.2 CD161分子与T细胞 |
| 1.2.1 CD161分子概述 |
| 1.2.2 CD161的配体 |
| 1.2.3 CD161分子在人类T cells上的免疫表型 |
| 1.3 转录因子CREMα与T细胞 |
| 1.3.1 CREMα简介 |
| 1.3.2 CREMα介导T细胞的调控机制 |
| 第2章 活动期自身免疫性葡萄膜炎患者外周血中T细胞表面CD161分子的分布与表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 样本来源 |
| 2.1.2 诊断及排除标准 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.2 实验方法与步骤 |
| 2.2.1 样本采集 |
| 2.2.2 血清的分离 |
| 2.2.3 外周血单个核细胞(PBMC)分离 |
| 2.2.4 细胞表面染色 |
| 2.2.5 细胞培养 |
| 2.2.6 细胞内细胞因子染色 |
| 2.2.7 Luminex检测细胞因子 |
| 2.2.8 数据统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 正常人和活动期葡萄膜炎患者外周血T细胞中CD161分子分布与表达 |
| 2.3.2 活动期自身免疫性葡萄膜炎患者Th1和Th17细胞的表达水平 |
| 2.3.3 活动期葡萄膜炎患者CD161~+Th1和CD161~+Th17细胞的表达水平 |
| 2.3.4 活动期葡萄膜炎患者CD8~+CD161~+T细胞分泌和表达IFN-γ的水平 |
| 2.3.5 活动期葡萄膜炎患者血清IL17A等细胞因子的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 环孢素对CD161分子的作用和影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 样本来源 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 样本采集 |
| 3.2.2 外周血单个核细胞(PBMC)分离 |
| 3.2.3 细胞培养 |
| 3.2.4 细胞培养上清液的提取 |
| 3.2.5 细胞表面染色和细胞内细胞因子染色 |
| 3.2.6 Luminex检测细胞因子 |
| 3.2.7 数据统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 环孢素对活动期葡萄膜炎患者Th1和Th17细胞表达水平的影响 |
| 3.3.2 环孢素对活动期葡萄膜炎患者CD161~+Th17细胞表达水平的影响 |
| 3.3.3 环孢素对活动期葡萄膜炎患者CD8~+CD161~+T细胞表达IFN-γ水平的影响 |
| 3.3.4 活动期葡萄膜炎患者细胞培养上清中IL17A等细胞因子的表达 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 活动期自身免疫性葡萄膜炎患者中CREMα的表达 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 样本来源 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.2 实验方法和步骤 |
| 4.2.1 PBMC分离 |
| 4.2.2 免疫磁珠分选CD4~+T细胞 |
| 4.2.3 CD4~+T细胞总RNA的提取 |
| 4.2.4 CD4~+T细胞总RNA浓度测定 |
| 4.2.5 CD4~+T细胞总RNA逆转录合成cDNA |
| 4.2.6 实时荧光定量PCR(RT-qPCR) |
| 4.2.7 CD4~+T细胞蛋白的提取 |
| 4.2.8 总蛋白浓度的测定 |
| 4.2.9 Western Blot检测 |
| 4.2.10 数据统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CD4~+T细胞磁珠分选结果 |
| 4.3.2 活动期自身免疫性葡萄膜炎患者CREMα、CD161、RORγt和IL-17A mRNA的表达情况 |
| 4.3.3 活动期自身免疫性葡萄膜炎患者CREMα、CD161、RORγt和IL-17A蛋白的表达情况 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 CREMα对CD161分子表达的调控作用 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 样本来源 |
| 5.1.2 主要仪器设备 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 溶液配制 |
| 5.2 实验方法和步骤 |
| 5.2.1 PBMC分离 |
| 5.2.2 免疫磁珠分选CD4~+T细胞 |
| 5.2.3 CD4~+T细胞的培养 |
| 5.2.4 实验分组 |
| 5.2.5 设计及合成siRNA |
| 5.2.6 CD4~+T细胞的siRNA转染 |
| 5.2.7 CD4~+T细胞总RNA的提取、CD4~+T细胞总RNA浓度测定、CD4~+T细胞总RNA逆转录合成cDNA和实时荧光定量PCR(RT-qPCR) |
| 5.2.8 CD4~+T细胞蛋白的提取、总蛋白浓度的测定和WesternBlot检测 |
| 5.2.9 数据统计分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 对活动期自身免疫性葡萄膜炎患者CD4~+T细胞中转染siRNA后,CREMα、CD161、RORγt和 IL-17A mRNA的转录情况 |
| 5.3.2 对活动期自身免疫性葡萄膜炎患者CD4~+T细胞中转染siRNA后,CREMα、CD161、RORγt和 IL-17A蛋白的表达情况 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）固本止咳中药方对慢阻肺模型小鼠呼吸道黏膜免疫细胞及因子的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 呼吸道黏膜免疫系统在慢阻肺中的作用及中医药的作用机制研究进展 |
| 一、慢阻肺的疾病概述 |
| 二、慢阻肺中的病理变化导致了疾病的后果 |
| 三、呼吸道黏膜免疫系统在慢阻肺中起到重要作用 |
| 1.黏膜免疫系统概述 |
| 2.黏膜免疫系统在全身以网络方式运作 |
| 3.黏膜定居的微生物群影响黏膜免疫系统的功能 |
| 4.上皮细胞在黏膜免疫作用中表现出多种生物学特性 |
| 5.黏膜免疫中的免疫球蛋白S-IgA通过多种作用保护黏膜 |
| 6.黏膜免疫系统的防御和保护作用对于呼吸道至关重要 |
| 7.黏膜免疫中的关键细胞——γδT细胞 |
| 四、慢阻肺中的炎症损伤 |
| 1.香烟烟雾对肺组织损伤的作用机制 |
| 2.慢阻肺患者存在系统性炎症 |
| 3.慢阻肺的免疫反应 |
| 五、角质细胞生长因子的作用及其在慢阻肺中的作用机制 |
| 六、中医药对黏膜免疫的作用机制研究进展 |
| 1.增强黏膜屏障功能 |
| 2.调节黏膜免疫细胞及其成分 |
| 3.对呼吸道黏膜免疫作用的研究 |
| 七、小结与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、实验材料 |
| 1.实验小鼠 |
| 2.实验试剂 |
| 3.仪器 |
| 二、方法 |
| 1.技术路线图 |
| 2.实验动物分组 |
| 3.固本止咳中药方药物的制备 |
| 4.慢阻肺小鼠模型建立及给药方法 |
| 5.小鼠肺功能检测 |
| 6.小鼠支气管肺泡灌洗液、血清、肠黏液标本收集 |
| 7.小鼠肺组织形态学标本采集及处理 |
| 8.小鼠肺组织γδT淋巴细胞分离及流式细胞仪检测 |
| 9.小鼠肺组织切片T淋巴细胞受体免疫组化染色 |
| 10.小鼠血清、BALF、肠黏液中炎症因子含量检测 |
| 11.小鼠肺组织中KGF及KGFR的检测 |
| 12.统计方法 |
| 结果 |
| 一、固本止咳中药方提高慢阻肺模型小鼠生命质量及体重 |
| 二、固本止咳中药方改善慢阻肺模型小鼠肺组织形态学病理变化 |
| 三、固本止咳中药方减轻小鼠呼吸道阻塞程度、提高肺组织顺应性 |
| 四、固本止咳中药方降低慢阻肺模型小鼠肺组织αβT/γδT细胞比例 |
| 五、固本止咳中药方增加慢阻肺模型小鼠肺组织KGF及KGFR含量 |
| 1.免疫组织化学染色实验结果表明固本止咳中药方增加小鼠肺组织KGF含量 |
| 2.Western blot检测结果表明固本止咳中药方可增加小鼠肺组织KGF、FGFR2蛋白表达 |
| 3.ELISA方法检测结果表明固本止咳中药方增加慢阻肺模型小鼠肺组织KGF蛋白表达 |
| 4.Real Time PCR检测结果表明固本止咳中药方增加慢阻肺模型小鼠肺组织KGF的mRNA含量 |
| 六、固本止咳中药方增加小鼠血清、肺泡灌洗液中的IL-6含量和肺泡灌洗液、小肠黏液中的IL-13含量 |
| 讨论 |
| 一、中医对慢阻肺的认识 |
| 二、固本止咳中药方的组方及成分药理分析 |
| 三、中医理论中“肺卫”之屏障防御作用与黏膜免疫功能具有相关性 |
| 1.现代医学免疫功能与中医理论之“正气”功能相同 |
| 2.正气中的肺卫之气具有护卫人体的屏障作用 |
| 3.卫气与黏膜免疫在位置结构、性质和作用机制上均有相似性 |
| 四、中医药增强卫气的机制为增强黏膜免疫机械屏障、调节黏膜免疫细胞及因子 |
| 五、黏膜免疫是呼吸系统免疫的首道防线,其中的γδ T细胞与慢阻肺有关 |
| 六、固本止咳中药方可通过下调慢性炎症介质细胞因子减轻慢阻肺炎症反应 |
| 七、固本止咳中药方可通过上调γδT细胞比例减轻慢阻肺的炎症反应、促进组织修复 |
| 八、固本止咳中药方可促进KGF分泌从而有助于慢阻肺中的组织修复 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（10）丙戊酸钠联合唑来膦酸增强γδ T细胞介导的杀伤骨肉瘤效应（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文对照缩写词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 骨肉瘤的现状 |
| 1.2 过继细胞治疗 |
| 1.3 γδ T细胞 |
| 1.4 唑来膦酸 |
| 1.5 丙戊酸钠 |
| 2 丙戊酸钠联合唑来膦酸协同促进γδ T细胞杀伤骨肉瘤细胞系及其机制探究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 丙戊酸钠联合唑来磷酸协同致敏γδ T细胞杀伤骨肉瘤细胞系 |
| 2.4 丙戊酸钠联合唑来膦酸协同致敏γδ T细胞杀伤骨肉瘤细胞机制 |
| 2.5 丙戊酸钠联合唑来膦酸协同阻断甲羟戊酸通路促进γδ T细胞杀伤骨肉瘤细胞 |
| 2.6 讨论与小结 |
| 3 丙戊酸钠联合唑来膦酸促进γδ T细胞杀伤原代骨肉瘤细胞效应研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 4 丙戊酸钠联合唑来膦酸致敏γδ T细胞体内抑制骨肉瘤增殖的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 γδ T细胞介导的抗肿瘤免疫治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简介及研究生期间科研情况 |
四、人类γδT细胞细胞毒活性的调控机制和作用途径（论文参考文献）
- [1]肺癌肿瘤微环境的系统解析及靶向中药发现[D]. 黄超. 西北农林科技大学, 2021
- [2]固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究[D]. 王明哲. 北京中医药大学, 2021(01)
- [3]NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究[D]. 赵亚楠. 山东大学, 2021(11)
- [4]减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究[D]. 李美蓉. 华南理工大学, 2020
- [5]MMF通过抑制Th17细胞及IL-17A下调Vγ4细胞表达KGF的机制研究[D]. 宋亚军. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [6]γδT细胞在金黄色葡萄球菌乳腺感染中的作用及机制研究[D]. 修磊. 内蒙古大学, 2020(01)
- [7]MDSC分泌的Arg-1对肠炎小鼠Th17细胞的影响及橡黄素治疗机制的研究[D]. 马占川. 吉林大学, 2020(08)
- [8]CD161分子在自身免疫性葡萄膜炎中的表达及其作用机制的研究[D]. 佟柏楠. 吉林大学, 2020(08)
- [9]固本止咳中药方对慢阻肺模型小鼠呼吸道黏膜免疫细胞及因子的影响[D]. 王玥琦. 北京中医药大学, 2020(04)
- [10]丙戊酸钠联合唑来膦酸增强γδ T细胞介导的杀伤骨肉瘤效应[D]. 王盛东. 浙江大学, 2020(01)
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