自噬相关基因Atg3在埃博拉病毒组装过程中的作用研究

论文摘要

自噬是真核细胞清除胞内冗余物质的降解机制,也是细胞针对病原体入侵的一种天然免疫机制。自噬相关基因3（Autophagy-related gene 3,Atg3）在细胞自噬发生过程中起决定性作用。为研究Atg3对埃博拉病毒（Ebola virus,EBOV）组装的影响,本研究首先根据CRISPR/Cas9技术构建了携带有Atg3基因靶向向导RNA（guide RNA,gRNA）、表达Cas9的重组质粒pSpCas-Atg3,将此质粒转染至人胚胎肾细胞293T中,之后采用流式分选结合有限稀释法筛选单细胞克隆。细胞基因测序及Western Blot试验表明成功获得了Atg3基因敲除的细胞系。在Agt3基因敲除细胞系和野生型细胞中分别共同转染表达EBOV囊膜蛋白（Glycoprotein,GP）和基质蛋白的重组质粒,包装病毒样颗粒（Virus-like particles,VLP）;同时在两种细胞中组装整合有EBOV的重组HIV假病毒,获得的假病毒感染非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）,通过测定报告基因的活性判定病毒对细胞的侵入能力。结果显示Atg3基因缺失后,VLP所整合的GP蛋白显著增多,假病毒对细胞的侵染能力也明显增强（P<0.001）,表明Agt3能够负调控EBOV的组装和入侵。本研究为开发新抗病毒药物提供了新思路。

论文目录

• 材料与方法
•   1 质粒、菌株及细胞
•   2 主要试剂、工具酶及抗体
•   3 sgRNA的设计
•   4 重组质粒的构建
•   5 细胞转染、分选及稳定敲除细胞的筛选
•   6 Atg3基因敲除细胞的鉴定
•   7 Atg3敲除细胞自噬缺陷的验证
•   8 Atg3基因对EBOV组装的影响
•   9 埃博拉伪型病毒入侵靶细胞的检测
•   1 0 统计学分析
• 结果
•   1重组质粒的构建
•   2 Atg3基因敲除细胞单克隆的筛选及鉴定
•   3 Atg3 KO细胞的功能性验证
•   4 Atg3基因对EBOV组装的影响
• 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 刘鑫,王斌,姚晓雨,郑永辉,范春玲

关键词: 自噬,自噬相关基因,埃博拉病毒,囊膜蛋白

来源: 病毒学报 2019年06期

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 黑龙江八一农垦大学动物科技学院,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所-美国密歇根州立大学天然免疫联合实验室兽医生物技术国家重点实验室

基金: 黑龙江省农垦总局重点科研计划项目(项目号：HKKYZD190312),题目：化脓隐秘杆菌HJ-1型感染小鼠模型的建立及评价~~

分类号: R373.9

DOI: 10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003601

页码: 888-894

总页数: 7

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