多聚唾液酸转移酶ST8SIA4中PSTD区域的结构与功能分析

论文摘要

唾液酸转移酶家族是糖基转移酶超家族的重要成员,其广泛分布于细菌、古细菌及真核细胞生物中,被认为是起源古老的转移酶家族之一。在真核细胞中唾液酸转移酶属于GT29家族,通过糖基化修饰位点与靶点不同,可分为六个亚家族。尽管GT29家族成员众多,但在高等生物,只有ST8SIA2（STX）和ST8SIA4（PST）两个转移酶具有多聚唾液酸化修饰功能,而其它成员仅以单聚或寡聚糖为主。独特的多聚唾液酸功能域（PSTD）与位点识别功能域（PBR）赋予了 ST8SIA2与ST8SIA4酶的多聚化功能。目前已经报道多种蛋白可被多聚唾液酸转移酶所修饰,神经细胞黏附因子（NCAM）是其主要的载体,并涉及神经发育、认知、免疫、肿瘤、微生物侵染等重要的生物功能。特别是多聚唾液酸糖基化修饰是肿瘤细胞的普遍特征,并与肿瘤细胞的侵袭、转移有关。因此,以多聚唾液酸转移酶为靶点的药物开发为抗肿瘤提供了一新的途径。目前,由于缺乏转移酶抑制靶点与作用机制的信息,限制了对其在不同领域中的开发与利用。本文以多聚唾液酸转移酶中PSTD与PBR两个重要的功能域为主要研究对象,以分子进化、核磁结构解析与分子模拟等为主要研究方法,拟通过多角度探索多聚唾液酸转移酶的进化机制与其结构信息,为其功能与机制的探索提供一定的认识。从进化的角度,通过对ST8SIA4与ST8SIA2两个多聚唾液酸转移酶的功能分化分析,观察到两个基因分化主要源于氨基酸的理化性质的差异,在ST8SIA4酶中主要分布于86-104区域,该区域位于多聚底物结合的PBR区域中。考虑PBR主要识别特异性蛋白修饰位点,ST8SIA4与ST8SIA2两个酶的功能分化主要源于对不同修饰靶点的识别上。而在PSTD功能城上,在ST8SIA2与ST8SIA4中均比较保守。通过其功能分化分析,ST8SIA2与ST8SIA4在不同的功能域上可能受不同的选择作用,进一步的位点选择模型分析,支持了在ST8SIA4在进化过程中受到正选择的作用,并正选择的位点主要分布在PBR功能域附近。通过对PSTD区域的NMR结构解析,发现PSTD主要由L260-K272共13个氨基酸形成的α-螺旋组成,在N端（L258-R259）及C端（K272-S279）氨基酸片段上为无结构区域。为了进一步研究多聚唾液酸（PSA）与PSTD的结合,同时解析了 PSA存在下的结合态结构。通过两者结构的比对,在底物加入后,N端的L260-H262,C端的K272至C末端两个区域存在着明显的差异。1H-15N-HSQC谱图能够观察到两种状态下,在多个非碱性氨基酸位点,如L260、1261、G266、W268、L269、N271均有不同程度的结合。这表明多聚唾液酸与PSTD的结合过程中,其表面上的非碱氨基酸在结合底物或糖链延伸过程中,同样起着重要的作用。在该结构基础上,通过分子对接的方法进一步的发现,在野生型的PSTD中,PSA可以静电、氢键的方式与其PSTD功能域上氨基酸进行结合。对其非碱性氨基酸位点突变后,会影响到PSA与PSTD上氨基酸结合位点与结合方式。通过PSTD与酸性多糖（肝素、多聚唾液酸、透明质酸、硫酸软骨素）及小分子（唾液酸、CMP）的结合实验,发现PSTD与肝素、硫酸软骨素、多聚唾液酸等酸性多糖之间均有结合作用。在此基础上,进一步分析了肝素与PSTD主要为静态结合方式,其结合的位点位于螺旋结构上的L260、Y267、W268与L269等非碱性氨基酸位点。小分子CMP及其衍生物与PSTD域同样有结合能力,其主要也为静态结合,但其结合能力较肝素弱。由于以上几个酸性多糖与小分子CMP对抑制肿瘤侵润、迁移等有重要作用,其PSTD区域可能为其重要的作用靶点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
•   1.1 糖与糖生物学
•   1.2 糖缀合物与糖基转移酶
•   1.3 唾液酸及其糖缀合物
•     1.3.1 唾液酸单体
•     1.3.2 唾液酸缀合物与唾液酸转移酶
•     1.3.3 唾液酸的正常生理功能
•     1.3.4 唾液酸与人类疾病的关系
•     1.3.5 唾液酸的应用
•   1.4 神经细胞黏附因子与多聚唾液酸转移酶
•   1.5 核磁共振波谱学（NMR）基本原理
•     1.5.1 核磁共振波谱学在生物大分子的运用概述
•     1.5.2 NMR用于蛋白质三维结构解析
•     1.5.3 NMR用于核酸结构解析
•     1.5.4 NMR用于多肽结构解析
•     1.5.5 NMR在生物大分子的动力学分析
•     1.5.6 NMR在生物大分子相互作用研究中的应用
•     1.5.7 NMR在其它方面的运用
•   1.6 本课题研究的目的与意义
• 第二章 材料和方法
•   2.1 常用菌种与质粒信息
•   2.2 菌种保存、培养基和抗生素
•     2.2.1 菌种保存
•     2.2.2 常用培养基
•     2.2.3 常用抗生素配制方法
•   2.3 常用分子生物学方法
•     2.3.1 常用试剂
•     2.3.2 基因克隆
•     2.3.3 感受态细胞制备与质粒转化
•   2.4 原核表达载体构建、表达与纯化
•     2.4.1 PSTD域的原核表达载体构建
•     2.4.2 表达载体诱导
•     2.4.3 蛋白纯化
•     2.4.4 蛋白分子筛纯化
•     2.4.5 融合蛋白酶切及其纯化分析
•   2.5 圆二色光谱（CD）实验
•   2.6 等温滴定（ITC）测量
•   2.7 荧光光谱测定
•   2.8 激光拉曼光谱测定
•   2.9 生物信息学分析方法
•     2.9.1 常用软件与数据库
•     2.9.2 基本方法
•   2.10 NMR解析PSTD-22AA肽结构
•     2.10.1 样品制备
•     2.10.2 NMR实验
•     2.10.3 信号归属
•     2.10.4 结构计算
•   2.11 蛋白模拟分析
•     2.11.1 同源建模
•     2.11.2 PSTD突变模型构建与条件设置
•     2.11.3 PSTD与底物分子对接
• 第三章 ST8SIA家族的进化分析
•   3.1 引言
•   3.2 结果
•     3.2.1 唾液酸转移酶（GT29）家族的分析
•     3.2.2 GT-29家族的细菌中的同源序列分析
•     3.2.3 唾液酸2,8亚家族成员的进化分析
•     3.2.4 ST8SIA2与ST8SIA4功能分化研究
•   3.3 讨论
• 第四章 ST8SIA4中PSTD区域的NMR结构分析
•   4.1 引言
•   4.2 结果
•     4.2.1 大肠杆菌表达PSTD区域的实验结果
•     4.2.2 PSTD-22AA肽的NMR结构解析
•   4.3 讨论
• 第五章 多聚唾液酸PSA与PSTD区域的结合研究
•   5.1 引言
•   5.2 结果
•     5.2.1 多肽与底物的对接结果
•     5.2.2 同源模建PSTD结合口袋与底物的对接结果
•   5.3 讨论
• 第六章 抑制剂与多聚唾液酸转移酶PSTD域的结合研究
•   6.1 引言
•   6.2 结论
•     6.2.1 圆二色谱法研究不同底物与PSTD-22AA肽的结合
•     6.2.2 ITC研究不同底物与PSTD-22AA肽的结合
•     6.2.3 肝素对PSTD-22AA肽的结合研究
•     6.2.4 低分子肝素对PSTD-22AA肽的结合研究
•     6.2.5 肝素与PSTD-22AA肽的结合沉淀物的分析
•   6.3 讨论
• 结论与展望
•   结论
•   本文的主要创新点
•   本文存在的问题及深入方向
• 参考文献
• 附录
•   附录一 图谱傅里叶变换脚本
•   附件二 NMR中常用缩略语表
•   附录三 天然氨基酸结构及自旋系统示意图
•   附录四 20种天然氨基酸COSY、TOCSY相关模式
•   附录五 部分PBR-35AA肽的实验结果
•   附录六 不同底物与PSTD-22AA肽的对接实验结果
•   附录七 PSTD功能域中非碱性氨基酸突变子的构建
• 致谢
• 攻读学位期间所发表的学术论文和研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 彭立新

导师: 黄日波

关键词: 多聚唾液酸转移酶,唾液酸,生物大分子核磁,抑制剂

来源: 广西大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 广西大学

分类号: Q936

总页数: 140

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