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拟南芥SNARE蛋白VAMP711通过调控质膜H+-ATPase响应干旱胁迫的机制研究

2020-12-02阅读(449)

拟南芥SNARE蛋白VAMP711通过调控质膜H+-ATPase响应干旱胁迫的机制研究

论文摘要

干旱胁迫是植物生长发育过程中遇到的主要非生物胁迫之一,它严重抑制植物的生长和作物的产量。植物激素脱落酸（Abscisic Acid,ABA）在植物干旱胁迫响应过程中具有非常重要的作用。研究表明,干旱胁迫来临时,植物可以通过ABA信号转导途径抑制质膜H+-ATPase活性,从而促进气孔的关闭以防止体内过多的水分损耗。质膜H+-ATPase持续激活的突变体ost2-2D（H+-ATPase家族成员AHA1基因的突变）具有明显的干旱胁迫敏感表型。表明质膜H+-ATPase活性在响应干旱胁迫方面具有非常重要的作用。但是目前ABA调节质膜H+-ATPase活性的机制还不是很清楚。为了寻找参与ABA通过质膜H+-ATPase促进气孔关闭过程中的调控因子,本研究利用ABA处理的稳定表达AHA1的转基因材料,通过免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）和液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry,LC-MS/MS）的方法筛选到与 AHA 1互作的蛋白 VAMP711（Vesicle-Associated Membrane Protein711）。拟南芥VAMP711 属于 SNARE（Soluble NSF-Attachment Protein Receptor）蛋白家族,在介导囊泡与液泡的融合过程具有重要功能。通过荧光素酶互补成像（Firefly Luciferase Complementation Imaging,LCI）实验发现,VAMP711 与 AHA1 之间的互作受 ABA 诱导。双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC）实验,发现VAMP711与AHA1的互作部分存在于细胞膜上。酵母双杂交（Yeast Two-hybrid）实验表明,AHA1/AHA2的C端887至897之间的11个氨基酸残基对VAMP711与AHA1/AHA2的互作是必需的。拟南芥质膜H+-ATPase活性分析发现,VAMP711基因的缺失会造成质膜H+-ATPase活性的升高;在体外,原核表达的VAMP711蛋白能够直接抑制质膜H+-ATPase活性;酵母系统中,VAMP711能够抑制依赖拟南芥质膜H+-ATPase AHA2活性的酵母在葡萄糖培养基上生长。这些结果表明,植物VAMP711为质膜H+-ATPase的负调控因子。为了进一步探究植物中VAMP711通过质膜H+-ATPase响应干旱胁迫的分子机制,本研究检测了 VAMP711对质膜H+-ATPase在细胞膜上蛋白量的影响。蛋白免疫印迹（Western Blotting,WB）实验结果表明,VAMP711不影响质膜H+-ATPase在细胞膜上的含量。对GFP-VAMP711的亚细胞定位分析发现,在ABA处理下VAMP711向细胞膜靠近;非损伤微测实验（Non-invasive Micro-test Technique,NMT）和质膜H+-ATPase活性实验结果表明,ABA虽然对野生型和vamp711的质膜H+-ATPase活性都有抑制,但是对vamp711的抑制程度低于野生型,表明ABA对质膜H+-ATPase的活性的抑制部分由VAMP711介导。在拟南芥ost2-2D突变体中过表达VAMP711能够部分的抑制ost2-2D的干旱胁迫敏感表型,表明在拟南芥中VAMP711通过抑制质膜H+-ATPase的活性响应干旱胁迫。综上所述,本研究发现拟南芥SNARE蛋白VAMP711参与调节ABA介导的质膜H+-ATPase活性抑制以促进气孔关闭过程。在干旱胁迫下,植物中ABA的积累促进VAMP711与AHA1/AHA2在细胞膜上互作,抑制了质膜H+-ATPase的活性,从而促进气孔关闭,减少植物体内水分的损耗,提高植物的耐旱性。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略词表
  • 第一章 文献综述
  • +-ATPase的研究现状'>  1.1 植物质膜H+-ATPase的研究现状
  • +-ATPase的认识'>    1.1.1 对植物质膜H+-ATPase的认识
  • +-ATPase的活性调节'>    1.1.2 植物质膜H+-ATPase的活性调节
  • +-ATPase参与的生物学过程调控过程'>    1.1.3 质膜H+-ATPase参与的生物学过程调控过程
  •   1.2 植物中SNARE蛋白的概述
  •     1.2.1 SNARE蛋白的结构与分类
  •     1.2.2 SNARE蛋白的生理学功能研究
  •   1.3 ABA信号转导途径对干旱胁迫的响应
  •     1.3.1 ABA信号转导途径中的主要作用元件
  •     1.3.2 ABA信号转导途径在植物生长发育过程中的功能探究
  •   1.4 本研究的目的和意义
  • 第二章 实验材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 植物材料
  •     2.1.2 常用菌株和载体
  •     2.1.3 载体构建信息
  •     2.1.4 酶和试剂
  •     2.1.5 实验仪器
  •   2.2 常用培养基及溶液的配制
  •     2.2.1 常用培养基的配制
  •     2.2.2 常用溶液的配制
  •     2.2.3 常用抗生素与激素
  •     2.2.4 蛋白质免疫印迹相关溶液
  •     2.2.5 GST标签原核蛋白纯化相关溶液
  •     2.2.6 拟南芥细胞质膜微囊的分离及活性测量相关溶液配置
  •     2.2.7 测定非损伤氢离子流速的相关试剂
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 植物培养条件
  •     2.3.2 载体构建
  •     2.3.3 大肠杆菌（DH5α）电击感受态细胞的制备
  •     2.3.4 小量提取质粒DNA（碱裂解法）
  •     2.3.5 植物（拟南芥）基因组DNA的提取
  •     2.3.6 目的基因转录水平的表达分析
  •     2.3.7 拟南芥转基因植株的获得
  •     2.3.8 用CRISP/Cas9技术获得突变体
  •     2.3.9 拟南芥的有性杂交
  •     2.3.10 GST标签的原核蛋白表达与纯化
  •     2.3.11 酵母双杂交实验
  • +-ATPase互补实验'>    2.3.12 酵母（RS72） H+-ATPase互补实验
  •     2.3.13 荧光素酶互补（LCI）实验
  •     2.3.14 双分子荧光互补（BiFC）实验
  •     2.3.15 叶绿素含量测定
  •     2.3.16 拟南芥质膜微囊体的提取
  • +-ATPase （PM H+-ATPase）活性的测定'>    2.3.17 质膜H+-ATPase （PM H+-ATPase）活性的测定
  •     2.3.18 非损伤氢离子流速的测定
  •     2.3.19 离体叶片失水实验以及ABA介导的气孔开度实验
  •     2.3.20 红外相机检测叶片表面温度实验
  •     2.3.21 干旱胁迫处理实验
  •   2.4 引物
  •     2.4.1 质粒构建引物
  •     2.4.2 实时荧光定量PCR产物
  •     2.4.3 突变体鉴定引物
  • 第三章 结果与分析
  • +-ATPase的活性影响'>  3.1 植物激素ABA对质膜H+-ATPase的活性影响
  • +-ATPase蛋白AHA1互作'>  3.2 VAMP711蛋白与质膜H+-ATPase蛋白AHA1互作
  • +-ATPase蛋白AHA1互作'>    3.2.1 VAMP711与质膜H+-ATPase蛋白AHA1互作
  •     3.2.2 AHA1和VAMP711亚细胞定位以及组织表达模式分析
  •     3.2.3 AHA1和VAMP711互作位置分析
  • +-ATPase互作特异性分析'>  3.3 VAMP711和质膜H+-ATPase互作特异性分析
  •     3.3.1 VAMP711和AHA1的C端互作
  •     3.3.2 VAMP711与AHA家族成员互作的特异性分析
  •     3.3.3 VAMP711与AHA1/AHA2的C端相互作用
  • +-ATPase的活性'>  3.4 VAMP711负调控质膜H+-ATPase的活性
  •     3.4.1 CRISPR/Cas9技术获得vamp711突变体
  • +-ATPase活性升高'>    3.4.2 VAMP711基因缺失突变体中质膜H+-ATPase活性升高
  • +-ATPase的直接抑制作用'>    3.4.3 VAMP711对质膜H+-ATPase的直接抑制作用
  • +-ATPase的抑制'>    3.4.4 酵母异源系统验证VAMP711对质膜H+-ATPase的抑制
  •     3.4.5 突变体vamp711高pH胁迫耐受表型的观察
  • +-ATPase活性的调控机制研究'>  3.5 VAMP711对质膜H+-ATPase活性的调控机制研究
  • +-ATPase在细胞膜上的蛋白量'>    3.5.1 VAMP711不影响质膜H+-ATPase在细胞膜上的蛋白量
  •     3.5.2 ABA促进VAMP711与质膜的靠近
  • +-ATPase的活性'>    3.5.3 ABA通过VAMP711抑制质膜H+-ATPase的活性
  • +-ATPase活性'>    3.5.4 VAMP711的Longin结构域抑制质膜H+-ATPase活性
  •   3.6 突变体vamp711对干旱胁迫的响应
  •     3.6.1 突变体vamp711的失水表型分析
  •     3.6.2 突变体vamp711的气孔表型分析
  •   3.7 VAMP711参与调控AHA1介导的干旱胁迫响应
  •     3.7.1 过表达VAMP711能够抑制ost2-2D失水过快表型
  •     3.7.2 突变体ost2-2D中过表达VAMP711的气孔开度表型分析
  •     3.7.3 突变体ost2-2D中过表达VAAMP711的叶温表型分析
  •     3.7.4 突变体ost2-2D中过表达VAMP711的另外两个株系的干旱胁迫敏感表型分析
  • 第四章 讨论与结论
  •   4.1 分析与讨论
  • +-ATPase活性响应干旱胁迫'>    4.1.1 VAMP711通过调控质膜H+-ATPase活性响应干旱胁迫
  •     4.1.2 VAMP711与AHA1/AHA2互作的可能机制
  • +-ATPase活性'>    4.1.3 ABA信号转导途径部分通过VAMP711调控质膜H+-ATPase活性
  • +-ATPase活性机制的深入探究'>    4.1.4 VAMP711负调控质膜H+-ATPase活性机制的深入探究
  •     4.1.5 VAMP7参与植物对干旱胁迫的响应
  • +-ATPase活性调控具有功能多样性'>    4.1.6 VAMP711介导的质膜H+-ATPase活性调控具有功能多样性
  •   4.2 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 个人简历

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 薛媛

    导师: 郭岩

    关键词: 拟南芥,质膜,干旱胁迫响应

    来源: 中国农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 中国农业大学

    分类号: Q945.78

    总页数: 133

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