家蚕BmPSI及其互作蛋白BmSPX对下游Bmdsx的调控研究

论文摘要

家蚕是鳞翅目昆虫模式生物,其雌雄个体经济价值差异明显,因此对家蚕性别决定的研究不仅可为鳞翅目害虫防治提供参考,而且在养蚕业方面具有产业应用价值。先前研究发现位于家蚕性别决定信号通路下游的Bmdsx基因是家蚕性别分化开关基因,Bmdsx的不同选择性剪接形式决定了家蚕个体性别分化的方向。BmPSI（Byxbom mori P-element somatic inhibitor）蛋白可以特异地结合上Bmdsx pre-mRNA的第4外显子CE1元件,促进Bmdsx的雄性特异性剪接。当敲除BmPSI基因后,转基因家蚕个体中许多性别调控关键基因出现表达紊乱,下游最关键的Bmdsx的剪切形式出现变化,雄性个体中出现Bmdsx雌性剪接形式。另外,先前研究者曾构建家蚕酵母双杂交早期胚胎cDNA文库,并以BmPSI为诱饵筛选文库,发现了与BmPSI结合的剪接体蛋白——BmSPX,我们推测BmSPX可能参与家蚕Bmdsx的选择性剪切过程。为研究PSI调控dsx在昆虫物种间的保守性以及BmPSI互作蛋白BmSPX对下游Bmdsx选择性剪切的调控作用,我们设计实验方案,获得以下研究结果:1.BmPSI结构域与Bmdsx pre-mRNA的结合活性研究BmPSI蛋白包含4个KH1结构域,该类结构域为RNA结合结构域,本研究构建分别删除其中1个KH1结构域的截短蛋白表达载体,纯化这4种截短蛋白,将4种截短蛋白和全长BmPSI蛋白分别与CE1 RNA探针进行EMSA结合实验。结果显示,4个截短蛋白对CE1结合能力都减弱,其中删除了第一个和第二个KH1结构域的2个截短蛋白与CE1结合能力最弱,这表明家蚕BmPSI蛋白结合CE1的能力由4个KH1结构域共同提供,其中前面两个KH1结构域起主要作用。2.BmPSI蛋白结合CE1关键氨基酸位点的发现及验证将4个KH1结构域氨基酸序列进行多序列比对,根据前两个KH1中保守氨基酸位点筛选影响BmPSI结合CE1探针的潜在关键氨基酸位点。同时基于先前文献报道,KH1活性主要受内部保守锌肽重复序列Ile-Gly-X2-Gly-X2-Ile（IGGI）影响,本研究对BmPSI结合RNA能力的7个潜在关键氨基酸位点分别进行突变,过量表达并纯化这7种突变的全长BmPSI蛋白。将突变蛋白和CE1序列的RNA探针分别进行EMSA实验,结果发现其中I116G、L127G和mut IGGI这三种突变蛋白的结合能力明显减弱,利用EMSA冷竞争实验证实结合特异。利用圆二色光谱技术检测突变蛋白二级结构,结果显示三种突变蛋白与野生型BmPSI蛋白相比无明显结构差异,同时采用ITC（等温滴定量热法）对突变蛋白与CE1探针的结合亲和常数进行测定,结果发现这三种突变的引入都使BmPSI蛋白结合CE1探针的能力显著减弱。3.PSI结合dsx pre-mRNA在斜纹夜蛾中的保守性研究为研究PSI蛋白与CE1调控元件结合在鳞翅目昆虫中的保守性,本研究开展了家蚕以外的鳞翅目昆虫的PSI蛋白研究。基于斜纹夜蛾基因组计划已经完成,本研究分析了斜纹夜蛾基因组中双性基因（Sldsx）的序列信息,结果显示Sldsx的CE1元件序列与家蚕中序列完全相同。然后,对斜纹夜蛾SlPSI基因进行克隆,构建表达载体并纯化该蛋白。将SlPSI蛋白与CE1探针进行EMSA结合实验,结果显示SlPSI蛋白与CE1探针结合。根据家蚕BmPSI突变位点信息,对SlPSI相同氨基酸位点进行突变,后利用EMSA实验比较突变蛋白与CE1探针的结合能力,结果发现其中I116和IGGI两种位点对SlPSI蛋白结合RNA的能力具有重要的影响,而L127位点的突变对SlPSI结合CE1能力无明显影响。本研究结果表明PSI蛋白与dsx pre-mRNA中CE1元件的结合在鳞翅目昆虫中具有一定的保守性。4.家蚕BmPSI结合蛋白BmSPX的功能研究先前研究表明家蚕性别决定关键蛋白BmPSI可与剪切体蛋白BmSPX结合,为进行BmSPX的功能研究,本实验首先利用piggyBac转基因增量表达载体构建piggyBac-BmSPX重组载体,通过胚胎显微注射获得家蚕BmSPX增量表达品系Over-BmSPX,通过多代连续饲养及荧光筛选获得稳定携带红色荧光的转基因品系。提取转基因个体基因组,对转基因插入情况进行检测,发现BmSPX插入位点在第11号染色体基因间区。通过转基因个体cDNA实时荧光定量PCR检测,发现在转基因雄性个体中,BmSPX表达量上调了约30倍;而在雌性转基因个体中,BmSPX表达量上调了约4倍。综上结果可知,我们获得了稳定遗传的转基因BmSPX增量表达品系。对发育至蛾期的转基因增量表达BmSPX家蚕进行表型观察,同时观察到内生殖器和外生殖器的发育紊乱现象。因此我们推断BmSPX基因在雌、雄家蚕性别分化过程中均发挥重要作用。为研究BmSPX在家蚕性别决定中的生理功能,我们对Over-BmSPX转基因品系进行分子水平检测,检测到伴随BmSPX基因表达的明显上调,BmMasc、BmIMP和Bmdsx-F等基因表达量发生明显变化。同时,将BmSPX基因克隆到pSL1180过表达载体中,利用家蚕BmE细胞对家蚕BmSPX和BmPSI两种蛋白进行CO-IP（免疫共沉淀）实验,证实两者在家蚕细胞环境下存在相互作用。利用家蚕胚胎细胞系BmE细胞进行亚细胞定位,发现BmSPX蛋白属于核质穿梭蛋白。由于BmSPX具有精巢组织特异表达的性质,这与家蚕性别决定关键基因BmMasc精巢特异高量表达的情况一致,因此,我们利用CO-IP实验证明:BmSPX蛋白确实与BmMasc蛋白存在相互作用关系。结合转基因品系Over-BmSPX检测及以上其他实验结果,我们推断BmSPX蛋白作为Bmdsx雄特异性剪切阻遏复合体中的蛋白组分参与Bmdsx的选择性剪切。同时,BmSPX蛋白表达量的积累能够造成家蚕性别决定级联网络的调控变化,引起上游BmMasc、BmIMP的表达上调进而促进Bmdsx的雄特异性剪切,进而促进家蚕个体的雄性化发育。综上所述,本论文对家蚕性别决定关键蛋白BmPSI参与Bmdsx选择性剪接的关键氨基酸位点进行鉴定,首次发现除保守锌肽重复序列Ile-Gly-X2-Gly-X2-Ile外对KH1结构域结合RNA能力具有显著调控作用的关键氨基酸位点I116,并发现PSI蛋白对双性基因dsx pre-mRNA关键元件CE1的结合在鳞翅目昆虫中具有一定保守性;通过多种分子手段证明可与BmPSI结合的家蚕剪接体蛋白BmSPX在家蚕性别决定中具有重要作用,使得家蚕性别决定级联调控进一步完善。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
•   1.1 性别决定
•     1.1.1 遗传性别决定机制
•     1.1.2 环境性别决定机制
•   1.2 果蝇的性别决定
•     1.2.1 果蝇性别决定通路
•     1.2.2 果蝇中PSI基因的研究
•   1.3 家蚕的性别决定
•     1.3.1 家蚕性别通路
•     1.3.2 家蚕BmPSI基因的研究
•   1.4 家蚕BmSPX的发现
• 第2章 引言
•   2.1 研究背景
•   2.2 目的与意义
•   2.3 研究内容
•   2.4 技术路线
• 第3章 家蚕BmPSI的蛋白性质及表达谱分析
•   3.1 实验材料与试剂
•     3.1.1 实验材料
•     3.1.2 实验试剂及仪器
•     3.1.3 实验主要溶液配制
•   3.2 实验方法与步骤
•     3.2.1 定量引物设计
•     3.2.2 蛋白性质在线分析
•     3.2.3 五龄第三天各组织RNA的提取
•     3.2.4 cDNA合成
•     3.2.5 Actin3 检测cDNA质量
•     3.2.6 荧光定量PCR
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 BmPSI蛋白性质分析
•     3.3.2 BmPSI蛋白结构预测
•     3.3.3 BmPSI各组织表达定量分析
•   3.4 讨论
• 第4章 BmPSI蛋白表达及性质研究
•   4.1 实验材料与试剂
•     4.1.1 实验材料
•     4.1.2 实验试剂和仪器
•     4.1.3 实验主要溶液配制
•   4.2 实验方法与步骤
•     4.2.1 BmPSI全长引物的设计
•     4.2.2 BmPSI的克隆
•     4.2.3 重组原核表达载体的构建
•     4.2.4 蛋白小量诱导表达检测
•     4.2.5 BmPSI蛋白原核诱导表达及纯化
•     4.2.6 抗体制备及抗体效果检测
•     4.2.7 BmPSI在家蚕组织表达检测
•     4.2.8 BmPSI时期表达情况检测
•     4.2.9 BmPSI蛋白亚细胞定位
•     4.2.10 BmPSI蛋白二级结构测定
•     4.2.11 不同BmPSI剪切形式的发现
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 BmPSI的克隆和载体构建
•     4.3.2 BmPSI的小量诱导表达
•     4.3.3 MBP-BmPSI蛋白的纯化
•     4.3.4 纯化后的BmPSI蛋白送制抗体,并进行蛋白二级结构测定
•     4.3.5 BmPSI多克隆抗体效果检测
•     4.3.6 蛋白水平检测BmPSI在精、卵巢中的表达
•     4.3.7 蛋白水平检测BmPSI在家蚕五起之后的表达情况
•     4.3.8 BmPSI-L的发现
•     4.3.9 BmPSI的蛋白定位
•   4.4 讨论
• 第5章 对BmPSI结合CE1 的关键位点研究
•   5.1 实验材料与试剂
•     5.1.1 实验材料
•     5.1.2 实验试剂和仪器
•     5.1.3 实验主要溶液配制
•   5.2 实验方法与步骤
• 1 结构域截短蛋白的纯化'>    5.2.1 KH₁结构域截短蛋白的纯化
•     5.2.2 借助BCA试剂盒调平蛋白浓度
•     5.2.3 截短蛋白的凝胶阻滞（EMSA）实验
• 1 结构域多序列比对'>    5.2.4 BmPSI中 KH₁结构域多序列比对
• 1-1 关键氨基酸位点的突变引物设计'>    5.2.5 KH₁-1 关键氨基酸位点的突变引物设计
•     5.2.6 突变蛋白原核表达菌株的构建
•     5.2.7 突变蛋白的诱导表达和纯化
•     5.2.8 突变蛋白浓度调平及凝胶阻滞（EMSA）实验
•     5.2.9 等温滴定量热法检测蛋白与RNA的结合能力
•     5.2.10 对I116G、L127G及 mutIGGI突变蛋白二级结构的检测
•   5.3 实验结果与分析
•     5.3.1 BmPSI的截短设计
•     5.3.2 BmPSI的截短片段PCR扩增
•     5.3.3 BmPSI截短蛋白原核表达重组载体的构建
•     5.3.4 BmPSI截短蛋白的表达及纯化
•     5.3.5 截短蛋白浓度调平后的 EMSA（凝胶阻滞）实验
• 1 多序列比对寻找结合RNA的关键氨基酸位点'>    5.3.6 KH₁多序列比对寻找结合RNA的关键氨基酸位点
•     5.3.7 BmPSI潜在关键结合位点的克隆及突变蛋白的表达
•     5.3.8 突变蛋白浓度调平后的 EMSA（凝胶阻滞）实验
•     5.3.9 ITC检测BmPSI及3 种关键位点突变蛋白结合CE1 的能力
•     5.3.10 对I116G、L127G及 mut IGGI突变蛋白二级结构的检测
•   5.4 讨论
• 第6章 对SlPSI结合CE1 区段的保守性研究
•   6.1 实验材料与试剂
•     6.1.1 实验材料
•     6.1.2 实验试剂和仪器
•     6.1.3 实验主要溶液配制
•   6.2 实验方法与步骤
•     6.2.1 PSI基因进化树分析
•     6.2.2 Sldsx基因序列分析
• 1-1 氨基酸多序列比对'>    6.2.3 多物种PSI蛋白KH₁-1 氨基酸多序列比对
•     6.2.4 SlPSI基因的克隆及原核表达载体构建
•     6.2.5 SlPSI的原核诱导表达及蛋白纯化
•     6.2.6 SlPSI与CE1探针之间的 EMSA 实验
•     6.2.7 SlPSI突变蛋白的设计引物合成
•     6.2.8 SlPSI突变蛋白的纯化
•     6.2.9 SlPSI 突变蛋白的 EMSA 实验
•   6.3 实验结果与分析
•     6.3.1 PSI基因进化树分析
•     6.3.2 Sldsx基因序列分析
•     6.3.3 PSI基因物种间多序列比对
•     6.3.4 SlPSI基因的克隆及原核表达载体的构建
•     6.3.5 SlPSI蛋白的表达纯化
•     6.3.6 SlPSI蛋白与CE1 结合的验证
•     6.3.7 SlPSI结合CE1 潜在关键位点突变蛋白的克隆
•     6.3.8 SlPSI 突变蛋白的 EMSA 结合实验
•   6.4 讨论
• 第7章 BmPSI互作蛋白BmSPX的功能研究
•   7.1 材料与方法
•     7.1.1 实验材料
•     7.1.2 实验仪器
•     7.1.3 实验试剂
•   7.2 实验方法
•     7.2.1 增量表达BmSPX的转基因品系的获得
•     7.2.2 BmSPX的生物信息学分析
•     7.2.3 转基因过表达BmSPX家蚕的下游靶基因检测
•     7.2.4 BmSPX与 BmPSI的结合验证
•     7.2.5 BmSPX的亚细胞定位
•     7.2.6 BmSPX与 BmPSI的结合验证
•   7.3 结果与分析
•     7.3.1 BmSPX转基因增量表达品系的建立
•     7.3.2 Over-BmSPX品系的转基因情况检测
•     7.3.3 Over-BmSPX品系家蚕表型观察
•     7.3.4 BmSPX蛋白性质分析
•     7.3.5 BmSPX蛋白结构预测
•     7.3.6 Over-BmSPX品系中家蚕性别关键基因的表达检测
•     7.3.7 BmSPX 与 BmPSI 的结合验证实验
•     7.3.8 BmSPX蛋白定位
•     7.3.9 BmSPX与 BmMasc之间互作研究
•   7.4 讨论
• 第8章 综合与讨论
•   8.1 家蚕BmPSI的蛋白性质及表达谱分析
•   8.2 BmPSI蛋白表达及性质研究
•   8.3 BmPSI结合CE1 的关键位点研究
•   8.4 SlPSI结合CE1 区段的保守性研究
•   8.5 BmSPX的功能研究
• 参考文献
• 在读期间发表论文及参研课题
•   发表文章
•   参研课题
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王瑶

导师: 查幸福

关键词: 家蚕,斜纹夜蛾

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西南大学

分类号: Q963

总页数: 114

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