一种肿瘤通用疫苗的设计方法及胰腺癌通用疫苗论文和设计-莫凡

全文摘要

本发明公开了一种肿瘤通用疫苗的设计方法及其在胰腺癌的应用，设计方法包括：寻找肿瘤的所有突变位点的数据；对体细胞突变数据进行突变功能过滤，保留了外显子区域和可变剪切类型的突变位点；分析每个突变位点在对应癌症人群中的突变频率；利用数据计算每个基因在对应癌症中的表达量；判断多肽与MHC的亲和力情况，选取突变型多肽免疫原性强的位点；若存在n个突变的组合满足其中n为满足条件的最小值，则为最大覆盖的最少突变组合；将突变组合输入疫苗设计程序，设计多肽疫苗序列；通过这样的设计方法得到的通用型多肽疫苗组合覆盖患者的覆盖率高，缩短患者等待治疗的时间，提高免疫效果，降低肿瘤的耐药发生概率。

主设计要求

1.一种肿瘤通用疫苗的设计方法，其特征在于，包括如下步骤：寻找肿瘤的所有突变位点的数据；对体细胞突变数据进行突变功能过滤，保留了外显子区域和可变剪切类型的突变位点；分析每个突变位点在对应癌症人群中的突变频率，突变频率：F＝Nmut\/Ntotal，其中F表示突变位点的群体频率，Nmut表示携带该突变的患者人数，Ntotal表示总患者数；若F＆lt;1％，则剔除该位点；利用数据计算每个基因在对应癌症中的表达量，即RPKM值，若RPKM＆lt;1，则剔除该位点；对经过RPKM值筛选后的位点，判断其突变型多肽和对应的野生型多肽与MHC的亲和力情况，选取突变型多肽免疫原性强的位点；对选取出的突变型多肽免疫原性强的位点，若存在n个突变的组合满足则Cn为最大覆盖的最少突变组合，其中n表示满足条件的最小值，Cn表示n个突变的组合，F表示覆盖患者的比例；该n个突变的组合为最大覆盖的最少位点组合；将最大覆盖位点组合对应的短多肽，输入疫苗设计程序，设计多肽疫苗序列。

设计方案

1.一种肿瘤通用疫苗的设计方法，其特征在于，包括如下步骤：

寻找肿瘤的所有突变位点的数据；

对体细胞突变数据进行突变功能过滤，保留了外显子区域和可变剪切类型的突变位点；

分析每个突变位点在对应癌症人群中的突变频率，突变频率：F＝N_{mut<\/sub>\/N_{total<\/sub>，其中F表示突变位点的群体频率，N_{mut<\/sub>表示携带该突变的患者人数，N_{total<\/sub>表示总患者数；若F<1％，则剔除该位点；}}}}

利用数据计算每个基因在对应癌症中的表达量，即RPKM值，

设计说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是一种肿瘤通用疫苗的设计方法及其在胰腺癌的应用。

背景技术

癌症(cancer)也称恶性肿瘤，是由于机体细胞失去正常调控，过度增殖而引起的疾病。过度增殖的细胞称癌细胞，癌细胞常可侵犯周围组织(浸润，invasion)，甚至可经体内循环系统和\/或淋巴系统转移到身体其他部分(癌症转移)。世界上影响因子最高的医学期刊——《临床肿瘤杂志》(CA:A Cancer Journal for Clinicians,CA Cancer J Clin)公布了2018年全球185个国家关于36种类型肿瘤的发病率和死亡率，预计到2018年，全球将有1810万肿瘤新发病例和960万肿瘤死亡病例。其中肺癌是发病率最高的癌症，占总病例数的11.6％，并且是癌症死亡的主要原因，占癌症总死亡人数的18.4％。发病率较高的其他癌症分别为乳腺癌(11.6％)，结直肠癌(10.2％)，前列腺癌(7.1％)和胃癌(5.7％)。死亡率较高其他癌症分别为结直肠癌(9.2％)，胃癌(8.2％)和肝癌(8.2％)。国家癌症中心发布的最新的癌症数据显示，2014年我国恶性肿瘤估计新发病例数380.4万例,我国每天约有1万人确诊为癌症，相当于每分钟就有7人患癌。肿瘤发病率为278.07\/10万，肿瘤死亡率为167.89\/10万。

目前，绝大多数癌症的治疗原则仍然是以外科手术治疗为主，放疗、化疗为辅。多数癌症在早期并无明显的特征，当发现的时候已处于中、晚期，癌细胞很可能已经转移到了身体其他部分，手术的方法并不能完全切除肿瘤，术后五年生存率也低；一些癌症对放化疗敏感性较低，并不能从放、化疗中明显获益；化疗药物对杀灭肿瘤细胞并无特异性，在杀死癌细胞的同时也会大量杀死正常细胞现，使人体出现恶心、呕吐、脱发、白细胞减少等毒、副作用，常常使病人难以耐受，强大的毒副作用使化疗难以执行，过度化疗可能缩短患者的存活期。当传统的治疗方法不能够带来最好的治疗获益，靶向药治疗也作为一种可选的治疗方法。例如，NCCN指南中用于治疗子宫内膜癌的药物包括Bevacizumab和Trastuzumab；目前经CFDA批准的用于治疗胰腺癌的药物包括Gemcitabine,Capecitabine和Erlotinib等。但靶向药治疗也同样存在副作用较大的问题，而且随着用药时间的加长，病人很容易出现耐药性，从而对靶向药不敏感。相较于上述方法的弊端，免疫治疗显示出光明前景，但却只有一小部分人有效。以pembrolizumab为例，在黑色素瘤中有效率只有33％，在其它肿瘤中的有效率大多也在10-30％之间。

在此背景下，肿瘤疫苗开始受到重视，利用肿瘤多肽疫苗诱导机体免疫应答从而消灭癌细胞的方法更为安全，有效。肿瘤多肽疫苗是一种精准的医疗策略，它可以特异性靶向癌细胞，理论上可以做到消除所有肿瘤及其转移灶。近年来，由于肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原的发现，以及人们对肿瘤诱导免疫应答和肿瘤逃避免疫监视机制的深入研究和理解，肿瘤多肽疫苗的研究已经取得了可喜的成就。2008年，Yang B等人利用KRAS G12V突变多肽负载树突状细胞，在小鼠体内引起了强烈的特异性细胞毒性T淋巴细胞反应，能够特异性的杀伤胰腺癌细胞。2011年，Synne Wedén等人研究发现，KRAS氨基酸序列上第5-21位，长度为17且其中第12位氨基酸发生突变的多肽序列，在胰腺癌患者体内能够引起强烈的免疫反应，并且能够有效的延长胰腺癌患者的生存周期。2016年，Doreen O.Jackson等人研究发现，在剂量为1000mcg时，多肽疫苗E39显著降低了子宫内膜癌的复发率，且2年无病生存率显著提高。多项研究表明，肿瘤多肽疫苗在肿瘤治疗甚至治愈方面有着特殊的优势和光明的前景。

个体化多肽疫苗的一般设计流程，是根据肿瘤患者的个体遗传基因结构和功能差异，找出患者肿瘤组织特有的体细胞突变，分析出这些突变产生的新生抗原，用化学合成方法制备能够被患者组织相容性复合体(MHC)特异识别的多肽疫苗，注入患者体内，激活特异性T细胞应答和免疫风暴。然而，如果按照目前的个体化设计方法，必须针对每一位患者单独制备一组疫苗序列和治疗方案，这些序列和方案的普适性极低。目前从患者样本采集，到遗传信息检测，再到多肽疫苗制备完成，整个过程需要花费大概10-12周左右的时间。期间，患者不仅要遭受身体不适的煎熬，而且一旦病情有所恶化，就会错过最佳的治疗时机。虽然，有研究报道过部分可以用于治疗癌症的多疫苗肽，但这些研究的重点在于某一条或某几条疫苗肽的免疫效果，并没有考虑到疫苗肽的适用范围，研究成果只能覆盖一小部分患者。

此外，鉴于癌症治疗难，死亡率高的现状，提前做到有效预防就显得尤其重要。因此，针对这些问题，我们开发了兼具癌症治疗性及预防性的通用型多肽疫苗。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种肿瘤通用疫苗的设计方法及胰腺癌通用疫苗，通过这样的设计方法得到的通用型多肽疫苗组合覆盖患者的覆盖率高，只需要简单的个别突变位点检测，就能够直接用于携带有突变的患者，缩短患者等待治疗的时间；组合疫苗肽的免疫效果要强于单条疫苗肽的免疫效果；且多靶点的治疗方案可以有效降低肿瘤的耐药发生概率，使得治疗效果更佳更持久。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种肿瘤通用疫苗的设计方法，包括如下步骤：

寻找肿瘤的所有突变位点的数据；

对体细胞突变数据进行突变功能过滤，保留了外显子区域和可变剪切类型的突变位点；

利用数据计算每个基因的在对应癌症中的表达量，即RPKM值，

设计图

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