一、细胞周期素依赖激酶抑制因子p16表达与神经母细胞瘤发生发展的相关性研究（论文文献综述）
张波[1]（2021）在《Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制》文中研究表明邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯[di-（2-ethylhexyl）phthalate,DEHP]作为最常用邻苯二甲酸酯（phthalate esters,PAEs）类的增塑剂,广泛存在于环境介质中,可通过呼吸、饮食和皮肤接触等途径进入婴幼儿体内。进入体内的DEHP可在肝脏和小肠细胞中首先水解并通过其他代谢产物邻苯二甲酸单-2-乙基己酯[mono-（2-ethylhexyl）phthalate,MEHP]对机体产生毒性作用。神经母细胞瘤（neuroblastoma,NB）是最常见的小儿颅外恶性肿瘤,严重危害儿童的生命健康。一些环境内分泌干扰物能够促进神经母细胞瘤的增殖和迁移。DEHP作为一种具有神经毒性作用的环境内分泌干扰物可能影响神经母细胞瘤的增殖和迁移,但其作用机制尚不清楚。本研究通过体外培养神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞并给予MEHP暴露,明确MEHP暴露对SH-SY5Y细胞增殖和迁移的影响;通过抑制Notch信号通路,探讨Notch信号通路在MEHP暴露影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用机制,可为防治神经母细胞瘤和DEHP的健康损害提供科学依据。第一部分 MEHP对SH-SY5Y细胞增殖的影响及其机制目的:明确MEHP对SH-SY5Y细胞增殖、周期和凋亡的影响,探讨细胞周期和细胞凋亡关键基因在其中的作用。方法:SH-SY5Y细胞采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基常规培养。给予SH-SY5Y细胞梯度浓度MEHP暴露,CCK8法检测SH-SY5Y细胞存活率;根据CCK8结果确定染毒剂量与实验分组为空白对照组、溶剂对照组（0.1%DMSO）、低剂量组（10μM MEHP）、中剂量组（50μM MEHP）、高剂量组（250μM MEHP）,暴露时间为12h和24h。采用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况;实时荧光定量PCR方法检测细胞周期、凋亡关键基因C-MYC、Cyclin D1、CDK4、P27、Bax、Bcl-2 m RNA表达水平;western blot方法检测细胞周期、凋亡关键蛋白C-MYC、Cyclin D1、CDK4、P27、Bax、Bcl-2的表达水平。采用IBM SPSS 24.0进行统计分析,MEHP暴露组和对照组多组间差异比较采用单因素方差分析（One Way ANOVA）,组间两两比较采用LSD检验法（Least-Significant Difference）,非正态数据采用秩和检验。检验水准为α=0.05。结果:1.MEHP暴露12h和24h后,各染毒剂量组SH-SY5Y细胞存活率均明显高于对照组（P<0.05）;随着暴露时间的增加,32、64、128、250、500和1000μM MEHP组细胞存活率明显升高（P<0.05）。2.MEHP暴露12h和24h后,MEHP暴露组G1期细胞数量均显着减少（P<0.05）,MEHP组细胞S期细胞百分比增加（P<0.05）。3.MEHP暴露12h和24h,MEHP暴露组SH-SY5Y细胞凋亡水平显着减低（P<0.05）;且24h组250μM MEHP暴露组细胞凋亡水平低于12h组（P<0.05）。4.MEHP暴露12h和24h后,中、高剂量组C-MYC、Cyclin D1 m RNA和蛋白表达水平升高（P<0.05）;CDK4和P27的m RNA和蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）。5.MEHP暴露12h和24h后,中、高剂量组SH-SY5Y细胞Bax m RNA和蛋白表达水平降低（P<0.05）;Bcl-2 m RNA和蛋白表达水平升高（P<0.05）。结论:1.MEHP暴露可以调节SH-SY5Y细胞周期、抑制细胞凋亡,促进SH-SY5Y细胞增殖。2.MEHP暴露能够上调细胞周期关键蛋白C-MYC、Cyclin D1的表达,加速细胞周期,促进SH-SY5Y细胞增殖。3.MEHP暴露能够调节细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达,抑制SHSY5Y细胞凋亡,促进神经母细胞瘤增殖。第二部分 MEHP对SH-SY5Y细胞迁移的影响及其机制目的:明确MEHP对SH-SY5Y细胞迁移的影响,探讨细胞迁移关键基因和趋化因子在其中的作用。方法:SH-SY5Y细胞培养和实验分组与染毒同第一部分。采用ELISA法检测趋化因子VEGF、PDGF、TGF-β1和CXCL-8分泌水平;划痕实验检测细胞迁移水平;transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力;实时荧光定量PCR方法检测细胞迁移关键基因E-Cadherin、N-Cadherin、SNAIL、TWIST、Vimentin、HIF-1α、GPR81和Versican m RNA表达水平;western blot方法检测细胞迁移关键蛋白表达水平。结果:1.MEHP暴露可增加SH-SY5Y细胞的迁移距离,MEHP暴露24h后,细胞的迁移距离显着增加（P<0.05）。2.MEHP暴露可增加SH-SY5Y细胞的侵袭能力,中、高剂量MEHP暴露组细胞侵袭能力显着升高（P<0.05）。3.MEHP暴露可增加SH-SY5Y细胞的VEGF、PDGF以及TGF-β1的分泌水平,且24h组VEGF、PDGF和TGF-β1水平显着高于12h组（P<0.05）。4.MEHP暴露12h和24h后,中、高剂量组SH-SY5Y细胞E-Cadherin基因m RNA和蛋白表达水平显着低于对照组和DMSO组（P<0.05）;高剂量组NCadherin基因m RNA和蛋白表达水平显着高于其余各组（P<0.05）;与12h暴露组相比,24h高剂量组SH-SY5Y细胞N-Cadherin m RNA的表达水平升高（P<0.05）;中剂量组Vimentin基因m RNA和蛋白表达水平显着升高（P<0.05）,高剂量组Vimentin基因m RNA和蛋白表达水平显着高于对照组、DMSO组和低剂量组;与12h暴露组相比,24h各剂量组Vimentin m RNA的表达水平升高（P<0.05）;中、高剂量组SNAIL基因m RNA和蛋白表达升高（P<0.05）;中、高剂量MEHP暴露组HIF-1α基因m RNA和蛋白表达水平显着升高（P<0.05）,与12h暴露组相比,24h高剂量组SH-SY5Y细胞HIF-1αm RNA的表达水平更高（P<0.05）;中、高剂量MEHP暴露组Versican基因m RNA和蛋白表达水平显着高于对照组和DMSO组（P<0.05）,与12h暴露组相比,24h高剂量SHSY5Y细胞Versican m RNA的表达水平升高（P<0.05）。结论:1.MEHP暴露可促进SH-SY5Y细胞迁移和侵袭。2.MEHP暴露可调控迁移关键基因E-Cadherin、N-Cadherin、SNAIL、Vimentin、HIF-1α和Versican的表达,促进SH-SY5Y细胞迁移和侵袭。3.MEHP暴露可能通过上调趋化因子VEGF、PDGF和TGF-β1的分泌,增强SH-SY5Y细胞的迁移能力。第三部分 MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路的影响目的:明确MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路的影响,探讨Notch信号通路蛋白表达水平与SH-SY5Y细胞增殖和迁移以及相关基因表达的关系。方法:实验分组与染毒同第一部分。实时荧光定量PCR方法检测细胞Notch信号通路基因m RNA表达水平;western blot方法检测细胞Notch信号通路基因的蛋白表达水平。采用Pearson相关分析检验Notch信号通路蛋白表达与SH-SY5Y细胞增殖、迁移及其相关蛋白的相关性。结果:1.MEHP暴露可增加中、高剂量组SH-SY5Y细胞Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4、Dll-1和Jagged-2 m RNA表达水平,降低Dll-4 m RNA表达水平（P<0.05）。2.MEHP暴露可增加中、高剂量组SH-SY5Y细胞Notch-1、Notch-2、Notch-3和Jagged-2蛋白表达水平,降低Dll-4蛋白表达水平（P<0.05）。3.MEHP暴露12h和24h后,SH-SY5Y细胞周期和细胞凋亡水平与Notch-1、Jagged-2和Dll-4等蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。4.MEHP暴露12h和24h后,细胞周期关键蛋白CDK4表达水平与Dll-1蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;Cyclin D1和C-MYC蛋白表达水平与Notch-1、Notch-2、Notch-4、Jagged-2、Dll-1和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。MEHP暴露12h和24h后,凋亡相关蛋白Bax的表达水平与Notch-1、Notch-4和Dll-4蛋白表达水平显着相关,Bcl-2的表达水平与Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。5.MEHP暴露12h和24h后,SH-SY5Y细胞迁移和侵袭能力与Notch-1、Jagged-2、Dll-1和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。6.MEHP暴露12h和24h后,细胞迁移相关蛋白E-Cadherin表达水平与Notch-1和Jagged-2蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;N-Cadherin蛋白表达水平与Notch-1、Jagged-2蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;SNAIL蛋白表达水平与Notch-4、Jagged-2和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;Vimentin和HIF-1α蛋白表达水平与Notch-1、Jagged-2和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;Versican蛋白表达水平与Notch-1、Notch-4和Jagged-2蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。7.MEHP暴露12h和24h后,趋化因子VEGF的表达水平与Notch-2和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;PDGF的表达水平与Notch-1、Notch-4、Dll-1和Jagged-2蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;TGF-β1的表达水平与Notch-3和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;CXCL-8的表达水平与Jagged-2蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。结论:1.MEHP暴露可上调Notch信号通路中Notch-1、Notch-2、Notch-3、Jagged-2的蛋白表达水平,下调Dll-4的蛋白表达水平。2.MEHP暴露所致SH-SY5Y细胞的增殖和迁移与Notch通路蛋白表达密切相关。3.Notch信号通路可能通过调节细胞增殖和迁移关键基因的表达在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖和迁移中发挥作用。4.Notch信号通路可能通过调节细胞趋化因子的分泌在MEHP促进SHSY5Y细胞迁移中发挥作用。第四部分 Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制目的:明确Notch信号通路在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制。方法:采用DAPT抑制Notch信号通路表达,western blot方法检测Hes-1蛋白表达水平,检测Notch信号通路的抑制效率。暴露剂量与实验分组为空白对照组、溶剂对照组（0.1%DMSO）、DAPT组（50μM DAPT）、MEHP组（250μM MEHP）和MEHP+DAPT组（50μM DAPT+250μM MEHP）,暴露时间为24h。Western blot方法检测细胞Notch信号通路抑制后细胞增殖和迁移相关蛋白表达水平,其余实验方法同第一部分。数据处理与分析方法同第一部分。结果:1.SH-SY5Y细胞DAPT暴露后24h后,各剂量组（0、5、10、25、50、100μM DAPT）细胞存活率无明显变化（P>0.05）;经50μM DAPT处理的SH-SY5Y细胞内Hes-1蛋白表达水平显着降低（P<0.05）,Notch信号通路被有效抑制。2.DAPT可显着逆转MEHP所致SH-SY5Y细胞S期细胞数量增多。3.细胞凋亡结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP组细胞凋亡水平显着降低（P<0.05）。4.细胞迁移情况结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP组细胞迁移距离显着增加（P<0.05）;与MEHP组相比,DAPT+MEHP组细胞迁移距离降低,差异无统计学意义（P>0.05）。5.细胞侵袭结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP组细胞侵袭水平显着增加（P<0.05）,与MEHP组相比,DAPT+MEHP组细胞侵袭水平降低,差异无统计学意义（P>0.05）。6.趋化因子结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP组细胞VEGF、PDGF、TGF-β1和CXCL-8水平显着增加（P<0.05）;且DAPT+MEHP组细胞VEGF和TGF-β1水平显着低于MEHP组（P<0.05）。7.细胞周期和凋亡相关蛋白结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP组细胞C-MYC、Bcl-2蛋白表达水平升高,Bax蛋白表达水平显着降低（P<0.05）;DAPT+MEHP组C-MYC、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达水平显着低于MEHP组（P<0.05）。8.细胞迁移相关蛋白结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP细胞Vimentin、SNAIL、HIF-1α和Versican蛋白表达水平显着升高（P<0.05）;MEHP组和DAPT+MEHP组细胞E-Cadherin蛋白表达水平显着降低（P<0.05）;DAPT+MEHP组HIF-1α和N-Cadherin蛋白表达水平显着低于MEHP组（P<0.05）。结论:1.Notch信号通路能在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖和迁移中起正向调控作用。2.Notch信号通路可能通过调节细胞周期关键蛋白Cyclin D1、C-MYC,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖中发挥作用。3.Notch信号通路可能通过调节细胞迁移关键蛋白N-Cadherin的表达在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中发挥作用。4.Notch信号通路可能影响肿瘤细胞趋化因子VEGF和TGF-β1的分泌在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中发挥作用。
徐阳[2]（2020）在《阳离子PCL-b-P（GMA-EA）载体递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的研究》文中研究说明背景:近年来,采用微生物载体递送靶向炎症通路的基因在肿瘤治疗中取得了良好的效果。微生物载体主要包括病毒与细菌。病毒类载体可以分成两类:整合型和非整合型病毒载体,细菌主要包括厌氧菌和兼性厌氧菌。尽管已有大量的研究表明,应用减毒沙门菌体内递送基因能取得良好的治疗效果,但是,由于生物载体的安全性问题,限制了其临床转化过程。近期,人工合成载体递送基因抗肿瘤成为研究热点。人工合成载体包括脂质体和阳离子聚合物。聚醚酰亚胺（Polyetherimide,PEI）是经典的阳离子聚合物,并作为阳离子基因载体研究的金标准被广泛应用。但是PEI毒性较高,体内转染效率不高,这使得开发新型阳离子基因载体成为现阶段的研究热点。现阶段国内已开发出一系列合成基因载体用于治疗肿瘤,但是相关的体内研究仅局限于肿瘤本身,机体对合成载体递送基因抗肿瘤的综合反应仍未知。神经母细胞瘤（Neuroblastoma,NB）是儿童最常见的颅外实体肿瘤,最常见的发生部位是肾上腺。约有50%以上的患儿生存率低于40%,探寻有效的治疗靶点是神经母细胞瘤研究的热点。在临床上,神经母细胞瘤组织血运丰富,常出现早期转移,且伴有大量出血、坏死和钙化。抑制炎症致癌信号通路在该肿瘤的治疗中发挥明显作用。维甲酸/干扰素联合应用诱导的细胞凋亡调控基因19（Genes associated with retinoid-interferon-induced mortality 19,GRIM-19）可以通过抑制转录因子信号转导和转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription-3,STAT3）通路抑制恶性肿瘤的生长。虽然近期的研究表明,STAT3信号通路在神经母细胞瘤转移和化疗耐药的患儿中至关重要,但是尚缺乏临床病理分期与GRIM-19的相关性报道。异种移植瘤的体内实验提示抑制STAT3信号通路可以抑制神经母细胞瘤的生长,但是不足以评估抑制该通路后肿瘤局部微环境的改变。我们推测在神经母细胞瘤同种移植瘤中,过表达GRIM-19可能通过抑制STAT3信号通路的机制,抑制肿瘤细胞的生长,促进凋亡,而且抑制MMP-9表达,减轻瘤内出血,提高治疗效果。众所周知,多数肿瘤化疗的一线药物顺铂具有明显的内皮细胞毒性,治疗后可明显增加血浆血管性血友病因子（Von Willebrand factor,v WF）水平。针对致病机制的基因治疗具有高效低毒的特点,理论上对机体毒副作用较小。虽然已经开发出许多脂质体、阳离子载体用于神经母细胞瘤的治疗研究,可是如何在体内达到最大的治疗效果仍需仔细评估。方法:1、基因载体的合成与表征:通过酶促聚合反应合成双亲性嵌段共聚物PCL-b-P（GMA-EA）（PCG）,核磁检测PCG的化学结构,凝胶电泳检测PCG与GRIM-19质粒的结合能力,动态光散射评估PCG与GRIM-19质粒复合物的粒径和ζ电位。在人宫颈癌Hela细胞、人肝癌Hep G2细胞和鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞中,用细胞增殖活性检测（CCK-8）检测PCG与EGFP-N1质粒复合物的细胞毒性,用流式细胞仪或荧光显微镜检测PCG的转染效率。2、临床样本的分析:收集吉林大学白求恩第一医院住院确诊为神经母细胞瘤的28例患儿手术标本的石蜡切片,通过免疫组化分析GRIM-19的表达与神经母细胞瘤患儿年龄、性别、肿瘤大小、INSS分期、INPC分期、淋巴结和/或脉管转移的相关性。3、PCG递送GRIM-19基因抑制神经母细胞瘤的体内外研究:用PEI作为阳性对照,采用Western blot检测PCG介导的GRIM-19在鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞中的转染效率。体外实验分为6组,分别为对照组、PCG组、裸p GRIM-19组、PCG/p CDNA组、PCG/p GRIM-19组和PEI/p GRIM-19组,应用细胞增殖实验（CCK-8）、克隆形成实验、Brd U检测、流式凋亡检测、免疫荧光、划痕及Transwell实验,探讨PCG介导的GRIM-19过表达对肿瘤增殖、凋亡及转移的影响。体内实验中,分为对照组、PEI/p GRIM-19组和PCG/p GRIM-19共3组,应用免疫组化及Western blot检测GRIM-19的转染效率,通过免疫组化检测PCNA的表达,细胞凋亡检测（TUNEL）及Western blot检测分析裸鼠移植瘤治疗后增殖及凋亡的改变。进一步的体内实验分为对照组、顺铂组和PCG/p GRIM-19组共3组,检测各组裸鼠生存期的差异,自动血液分析仪检测裸鼠血红蛋白,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血浆中v WF,HE染色检测荷瘤鼠肺部改变,免疫组化检测肿瘤组织p-STAT3、MMP-9的表达,评价肿瘤组织学、瘤内出血、贫血及肺栓塞等肿瘤相关并发症改变。结果:1、N/P=1（阳离子聚合物中的N和DNA中的P的摩尔比）时,PCG完全阻止GRIM-19质粒DNA在凝胶电泳中的泳动。在w/w（质量比）为5-50的范围内,PCG能将p GRIM-19质粒压缩成200-400 nm大小,表面电势为25-30 m V的纳米粒子。在人宫颈癌Hela细胞、人肝癌Hep G2细胞和鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞中,PCG（w/w=20）在细胞中有效递送EGFP-N1质粒,同时对细胞的毒性较小。2、神经母细胞瘤组织中GRIM-19蛋白表达水平较癌旁正常组织下调或缺失。肿瘤组织中GRIM-19表达水平与年龄（P=0.0012）、INSS分期（P=0.0012）、INPC分期（P=0.0299）、淋巴结和/或脉管转移（P=0.0062）呈负相关,与性别及肿瘤原发部位无关。3、体外实验中,PCG载体可以将GRIM-19基因转染进Neuro2a细胞并提高GRIM-19基因的蛋白表达水平,其转染效率高于PEI。在对照组、PCG组、裸p GRIM-19组、PCG/p CDNA组、PCG/p GRIM-19组和PEI/p GRIM-19组中,PCG/p GRIM-19组和PEI/p GRIM-19组细胞凋亡增加,细胞增殖和细胞迁移抑制。PCG介导细胞内过表达GRIM-19蛋白抑制了STAT3信号通路,抑制了Cyclin D1、Bcl-2、MMP2和MMP9的表达。体内实验中,在对照组、PEI/p GRIM-19组和PCG/p GRIM-19组中,PCG/p GRIM-19组移植瘤生长抑制最明显,该组GRIM-19蛋白表达增加,PCNA表达下调,TUNEL染色及Cleaved caspase-3上调。在对照组、顺铂组和PCG/p GRIM-19组中,PCG/p GRIM-19组小鼠生存期延长最明显,该组大体观见瘤内出血减少,裸鼠血红蛋白升高,v WF下调,HE提示肺栓塞减少,肿瘤组织内p-STAT3下调,下游靶基因MMP-9表达下调。结论:1.人工合成的双亲性阳离子聚合物PCG能在体内外进行有效的基因转染。2.神经母细胞瘤肿瘤组织中GRIM-19的表达下调或缺失,其表达水平与年龄、INSS分期、INPC分期、淋巴结和/或脉管转移呈负相关。3.在裸鼠同种移植瘤模型中,PCG递送p GRIM-19可以有效抑制STAT3信号通路,不仅直接抑制肿瘤细胞的生长,而且抑制MMP-9表达,减轻瘤内出血。顺铂化疗引起荷瘤裸鼠内皮损伤及肺血栓增加,基因递送组v WF下调,肺血栓减少,小鼠生存期延长。阳离子PCG载体递送p GRIM-19抑制神经母细胞瘤的治疗策略可能为肿瘤治疗提供有价值的参考。
戴小凡[3]（2020）在《长链非编码RNA MALAT1在前列腺癌中的功能和作用机制》文中研究说明研究背景:前列腺癌（prostate cancer,PCa）作为男性第二大常见癌症,具有高发病率和高死亡率的特征,占癌症相关死亡率的13%,确定的危险因素包括种族、高龄、遗传家族史和雄激素水平。在PCa的病理生理学方面,雄激素是人体内必不可少的类固醇激素,它主要通过雄激素受体（androgen receptor,AR）发挥效应,可以控制前列腺的发育、生长及分化,当撤除雄激素后,会造成前列腺细胞凋亡,在男性特征的发展和维持中起着关键作用。临床研究发现雄激素的调控失衡与PCa发病有着直接的关系,所以在PCa的治疗中经常使用AR拮抗剂和化学去势疗法控制PCa的进展,其中雄激素剥夺疗法（androgen deprivation therapy,ADT）是临床治疗过程当中必不可少的方法。然而,在长期的治疗过程中,绝大多数原发性PCa最终获得ADT耐药性,从而进展为去势抵抗性前列腺癌（castration resistant prostate cancer,CRPC）,这是目前临床上治疗PCa的难点与热点之一。因此,进一步探索PCa的发病机制有助于我们更深入的了解PCa发生发展的机理,有助于我们开发PCa新的诊断标记物和预后指标,有助于我们寻找治疗PCa的新靶点,最终为患者带来更好的获益。随着ENCODE项目的发起和完成以及高通量测序技术的不断发展,科学家们发现了大量长链非编码RNA（Long non-coding RNA,Lnc RNA）,并在研究的过程当中更加的意识到Lnc RNA在生理病理条件下或者在疾病的发生发展过程发挥着无可替代的作用,尤其是最近几年关于Lnc RNA在癌症中的研究最为广泛。肺腺癌转移相关转录本1（metastasis associated in lung denocarcinoma transcript 1,MALAT1）在2003年首次被发现与非小细胞肺癌转移有关,随后大量的研究发现MALAT1也可以在不同系统器官的肿瘤中高表达,如消化系统肿瘤和泌尿系统肿瘤等,虽然MALAT1在PCa的研究中也有报道,但MALAT1在PCa中的作用机制仍然报道较少,并且MALAT1和AR信号通路之间的关系仍尚待阐明。目的意义:（1）通过研究MALAT1在PCa组织和细胞中的表达情况,分析MALAT1与PCa的临床相关性,明晰MALAT1在PCa中发挥的作用和功能。（2）通过体外实验研究MALAT1如何影响PCa的发生发展以及MALAT1是否参与AR信号通路的调节,进一步探索MALAT1在PCa中的作用机制。通过观察MALAT1对裸鼠体内PCa移植瘤的影响,进一步验证MALAT1在体内对PCa的作用。（3）通过研究MALAT1在PCa中的具体作用及内在机制,探讨MALAT1作为PCa新的肿瘤标记物和治疗靶点的可能性,为PCa的诊断和靶向治疗研究提供新的思路。方法:（1）运用生物信息学技术分析MALAT1在PCa组织中的表达情况以及与PCa的临床相关性,ROC曲线分析MALAT1在PCa中的诊断价值,基因富集分析预测MALAT1在PCa中可能发挥的作用。（2）划痕实验和Transwell小室侵袭实验检测沉默MALAT1对PCa细胞迁移和侵袭能力的影响。（3）Western blot实验检测沉默MALAT1对PCa细胞上皮间质转化的影响。（4）CCK8检测在有无雄激素刺激下,沉默MALAT1对PCa细胞增殖的影响。（5）流式细胞术检测在有无雄激素刺激下,沉默MALAT1对PCa细胞周期的影响。（6）Western blot检测在有无雄激素刺激下,沉默MALAT1对PCa细胞周期相关蛋白的影响。（7）查阅文献、查询生信分析数据库预测MALAT1的候选靶基因mi RNA,然后预测mi RNA的种子序列所结合的靶标3’UTR。（8）双荧光素酶报告基因实验和挽救性实验验证MALAT1/mi R-1-3p/CORO1C,MALAT1/mi R-320b/AR信号轴在PCa细胞中的作用机制。（9）裸鼠移植瘤模型验证沉默MALAT1对体内PCa细胞成瘤的影响。结果:（1）MALAT1在PCa组织中的表达明显高于癌旁组织,MALAT1表达的高低与Gleason评分、淋巴结转移和分化程度具有明显相关性,高表达MALAT1的PCa患者的无病生存期和无进展生存期明显低于低表达的患者,ROC曲线分析MALAT1在PCa中具有一定的诊断价值,基因集富集分析方法预测了MALAT1显着富集在侵袭转移和细胞周期调控通路中。（2）MALAT1在PCa细胞系LNCa P和22Rv1中高表达,沉默MALAT1可以抑制LNCa P和22Rv1细胞的迁移侵袭和上皮间质转化的能力。有无雄激素刺激下,沉默MALAT1都可以抑制LNCa P和22Rv1细胞的增殖和细胞周期进程。（3）生信分析和双重荧光素酶报告基因实验表明,mi R-1-3p能够与MALAT1和CORO1C m RNA 3’UTR直接结合,并且MALAT1能够与CORO1C m RNA 3’UTR竞争性结合mi R-1-3p,促进CORO1C表达。挽救性实验验证了抑制mi R-1-3p或过表达CORO1C能够消除沉默MALAT1所诱导的LNCa P和22Rv1细胞的迁移侵袭和上皮间质转化的影响。（4）雄激素能够刺激LNCa P和22Rv1细胞中MALAT1和AR的表达,无论雄激素是否刺激,沉默MALAT1都能够抑制LNCa P和22Rv1细胞中AR的表达。生信分析和双重荧光素酶报告基因实验证明了MALAT1能够与mi R-320b结合,MALAT1与AR m RNA 3’UTR能够竞争mi R-320b的结合位点。挽救性实验验证了抑制mi R-320b或过表达AR能够逆转MALAT1沉默所引起的PCa细胞增殖和细胞周期进程的改变。（5）沉默MALAT1能够抑制裸鼠体内PCa移植瘤的生长,降低肿瘤组织中PSA和AR的表达。结论:（1）MALAT1在PCa组织和细胞中高表达,其可能作为促癌基因影响前列癌的发生发展,该基因的表达水平对PCa患者的诊断和预后判断具有一定的参考价值。（2）体外实验证明了MALAT1可以通过MALAT1/mi R-1-3p/CORO1C调控CORO1C表达以及通过MALAT1/mi R-320b/AR信号轴参与AR信号通路影响PCa的发生发展。（3）体内实验证实了沉默MALAT1可以抑制裸鼠体内PCa移植瘤的生长,该基因有望作为前列腺癌治疗的新靶点。
刘自华[4]（2020）在《硫氧还蛋白还原酶1对帕金森病保护效应的研究》文中研究指明目的:帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是常见的中枢神经系统退行性疾病,神经炎症、神经兴奋性毒性、基因突变和错误的蛋白折叠等多种因素可以引起PD。黑质多巴胺能神经元的减少是其典型的病理特征,然而,多巴胺能神经元数量减少的确切机制尚不清楚。越来越多的研究表明,氧化应激是引发PD的主要因素,因此,抗氧化是治疗PD的重要方法之一。硫氧还蛋白系统是由硫氧还蛋白（thioredoxin,Trx）、硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase,TR）和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）组成,是体内一种重要的抗氧化系统,硫氧还蛋白还原酶1（TR1）是硫氧还蛋白系统的主要成员。因此,本论文过表达TR1,研究其对PD的保护效应。方法:采用PD的动物和细胞模型,构建过表达TR1载体。采用转录组测序、免疫荧光、免疫组化、流式细胞术、抗氧化活性、western blotting、行为学、实时定量PCR检测过表达TR1对PD的保护效应。动物试验:A53T小鼠（3月龄）在黑质致密部每侧注射2μl连接有TR1基因的过表达慢病毒载体,饲养7个月后,通过行为学测试,观察小鼠行为学变化,在麻醉条件下,脱臼处死小鼠,取中脑组织通过转录组测序、实时定量PCR、免疫组化、western blotting、β-gal染色方法检测基因、蛋白表达或水平变化。检测谷胱甘肽（glutathione,GSH）、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase,T-SOD）和丙二醛（malondialdehyde,MDA）活性或含量的变化。C57BL/6小鼠随机分为两组:正常组和MPTP处理组。MPTP组采用腹腔注射MPTP盐酸盐造模（连续注射4次,每次间隔3 h）。对照组腹腔注射相同体积的生理盐水。MPTP诱导的PD小鼠中,测定小鼠行为学的变化,以及黑质、纹状体部位氧化损伤的变化。细胞试验:N2a细胞或者PC12细胞过表达TR1（N2a细胞载体是慢病毒,PC12细胞载体是质粒）24 h后,再用MPP+处理48 h,观察细胞的生存率,用免疫荧光、western blotting、PCR试验检测细胞凋亡、老化、DNA损伤以及信号通路相对应物质的表达变化。结果:根据KEGG富集分析,与WT相比,A53T小鼠抗氧化活性、线粒体相关复合体、细胞损伤、生长、复制、信号传导、酶调节活性、大脑皮层区域、神经元发育和分化调控基因均受到影响。本论文通过转录组测序分析发现,A53T小鼠与A53T-TR1小鼠比较,氧化还原过程、酶活性调节、细胞死亡、细胞增殖、信号通路相关基因表达都有变化。过表达TR1后,小鼠饲养到第10个月,与PD模型A53T小鼠比较,A53T-TR1小鼠抗氧化功能在一定程度上能够减少炎症反应的发生、增加补体水平、增加钙调蛋白数量、减少钙离子在细胞内的蓄积和减少对细胞所造成毒性效应等等,使PD的症状一定程度上有所改善。本论文研究表明,PD模型小鼠中脑部位SNc氧化应激增加,TR1和TH表达减少。PD模型组与WT组（正常组）或者NS组（正常组）比较:小鼠认知能力、嗅觉功能和肌张力下降。TR1在多巴胺能神经元中起着重要的抗氧化作用。因此,在MPP+诱导的细胞模型和A53T转基因小鼠PD动物模型中过表达TR1后,PD小鼠黑质部位神经元细胞凋亡减少,黑质部位细胞生存能力增强;DNA损伤、细胞衰老、ROS和MDA产生减少;T-SOD、GSH的活性或含量增加;TH表达增加,学习记忆能力以及嗅觉能力提高。通过N2a细胞模型的免疫荧光染色和电镜结果发现,在PD的细胞模型中,自噬小体出现,线粒体膜电位受到损伤,过表达TR1后,细胞自噬减少,线粒体膜电位有一定程度恢复。TR1过表达可作为PD治疗过程中的一种新的神经保护物质,通过调节GSK-3β、NF-κB信号通路发挥作用。本研究为PD的治疗提供了新的方向。结论:过表达TR1对PD动物和细胞模型具有保护效应。TR1未来可能成为治疗PD的一种新的靶向蛋白。
李佳林[5]（2020）在《FOXD3与SCF-β-TRCP1对肺癌与结肠癌骨转移等恶性生物学行为影响和机制研究》文中指出第一部分FOXD3蛋白对肺癌骨转移等恶性生物学行为影响及机制研究研究目的:肺癌分别是全球男女性发病率排名第二的恶性肿瘤;骨转移尤其是脊柱转移是导致肺癌不良预后的重要因素。肿瘤干细胞与肿瘤发生发展、侵袭转移密切相关。FOXD3与胚胎发育及恶性瘤发生有相关性,但其对肺癌的作用机制有待进一步探究。同时FOX（forkhead box）蛋白家族是常用临床药物治疗靶点,本研究的目的是探究FOXD3对肺癌干细胞的调控机制及对骨转移相关恶性生物学行为影响,为临床药物开发提供理论支持。研究方法:本研究利用前期实验室构建的特异性脊柱转移肺癌细胞系,评估此细胞系的肿瘤干细胞特性,通过癌球形成和再分化实验、细胞耐药性分析和细胞迁移实验对FOXD3在肺癌肿瘤干细胞内的功能进行分析评价;通过细胞实验及载瘤动物模型进一步将FOXD3对肿瘤恶性生物学行为影响进行探究,同时使用全基因组RNASeq和Ch IP-Seq分析来预测FOXD3在肺癌干细胞中的直接作用靶基因位点,并通过双荧光素酶报告系统及细胞功能实验验证其相互作用及参与调控的信号通路。结果:肺癌脊柱转移细胞具有肿瘤干细胞特征;FOXD3在脊柱转移细胞及肿瘤干细胞内表达下调。同时发现,FOXD3在体外和体内水平均与肿瘤干细胞的扩增和迁移、肿瘤细胞耐药性以及骨转移灶破骨细胞分化呈负相关关系。FOXD3通过对WDR5的转录阻遏,实现对其表达调控的作用,最终达到对肺癌干细胞相关生物学功能调控。结论:本研究揭示了FOXD3作为肺癌肿瘤抑制因子的作用机制,我们证明了FOXD3可以通过抑制WDR5在肺癌中的表达来抑制肿瘤干细胞的积累,从而影响肺癌生物学进程,进而参与肺癌骨转移、骨破坏等恶性生物学行为发生与发展的调控。WDR5做为临床常用药物开发靶点,该研究为进一步探索肺癌治疗,特别针对骨转移相关事件的靶向药物治疗提供了潜在靶点及理论基础。第二部分乙酰化依赖的SCF-β-TRCP1功能调节与其对结直肠癌恶性生物学行为影响及机制研究研究目的:结直肠癌是第三大常见恶性肿瘤性疾病,是全球恶性肿瘤导致死亡的主要原因。SCF-β-TRCP1泛素化系统与结直肠癌关系密切,可通过泛素化降解β-catenin等癌基因实现对结直肠癌调控。本研究主要探讨β-TRCP1的乙酰化调节途径对结直肠癌恶性生物学行为的影响,探索β-TRCP1新的调节途径,为结直肠癌治疗提供可行的靶点与思路。研究方法:我们通过WB实验、免疫共沉淀、泛素化实验、CHX蛋白降解等实验找到参与β-TRCP1乙酰化调控的相关乙酰化/去乙酰化酶,进而通过细胞功能实验探究β-TRCP1乙酰化水平对结直肠癌恶性生物学行为的影响,并通过临床标本免疫组化染色进行验证;最后找到β-TRCP1反向调控乙酰化酶稳定性的具体机制,构建完整反馈调节环路。结果:本研究阐明GCN5-SIRT1系统介导的SCF-β-TRCP1乙酰化修饰路径:乙酰化酶GCN5参与β-TRCP1乙酰化过程,去乙酰化酶SIRT1参与β-TRCP1去乙酰化过程。乙酰化影响β-TRCP1蛋白稳定性的同时增强结肠癌中β-TRCP1的抑癌功能;β-TRCP1可通过CKⅡ磷酸化依赖的泛素化途径降解SIRT1,同时这种效果可以被Pin1蛋白所拮抗。这项研究阐明了控制β-TRCP1稳定性及其E3连接酶功能活性的新上游途径。结论:研究揭示TRCP/GCN5/SIRT1相互作用的新机制,由此GCN5/SIRT1可以以乙酰化依赖性的方式调控β-TRCP1的功能与蛋白稳定性。除充当调节剂外,SIRT1还充当β-TRCP1的底物,进而影响自身乙酰化过程;GCN5/SIRT1活性的启动推动了反馈回路的产生,影响β-TRCP1功能。在β-TRCP1调节过程中,CKⅡ磷酸化通路和SIRT1乙酰化途径之间存在潜在的联系,CKⅡ可以磷酸化SIRT1,介导其被β-TRCP1识别并通过泛素化途径降解从而影响去乙酰化酶活性。该研究确定了乙酰化依赖的β-TRCP1功能调控新机制,并提供了有关乙酰化系统调控E3连接酶活性的新线索。
吴燕莉[6]（2020）在《AD少突胶质细胞改变及抗精神病药物对其作用的研究》文中进行了进一步梳理第一部分APP/PS1转基因AD小鼠海马内少突胶质细胞的改变目的:定量研究APP/PS1转基因AD小鼠海马内少突胶质细胞（OLG）的改变,检测海马内髓鞘形成蛋白、OLG发育相关蛋白以及机制相关蛋白（Lingo1、MAG、MOG、GSK-3β、p-ser9-GSK3β）的表达情况,为后续的研究提供依据,为今后寻找延缓AD的手段提供有效的靶点。方法:随机选取10月龄雄性APP/PS1转基因AD小鼠（AD组）和10月龄雄性同窝生野生型小鼠（WT组）各13只。运用Morris水迷宫测试来评估各组小鼠的空间学习和记忆能力。记录逃避潜伏期作为空间学习记忆能力的评估指标,记录穿台次数和目标象限游泳时间百分比作为空间记忆能力的评估指标。运用免疫组织化学技术及无偏体视学方法定量研究各组小鼠海马CA1、CA2-3和齿状回（DG）内少突胶质细胞系（Olig2+细胞）和成熟OLG（CNPase+细胞）数量的变化。对各组小鼠海马内OLG的总数与其空间学习记忆能力进行相关性分析。运用蛋白质印迹法（Western Blot）检测OLG发育相关蛋白（CNPase、MBP、NG2）以及机制相关蛋白（Lingo1、MAG、MOG、GSK-3β、p-ser9-GSK3β）的蛋白水平。运用免疫组织化学技术定性研究各组小鼠海马内老年斑的含量,运用酶联免疫吸附测定（ELISA）定量可溶性Aβ的水平。运用免疫荧光结合激光共聚焦技术计数各组小鼠海马CA1、CA2-3和DG内表达衰老蛋白P16的少突胶质细胞系（P16+/Olig2+细胞）的比例。结果:1.Morris水迷宫测试结果显示AD组小鼠逃避潜伏期显着性长于WT组小鼠（P<0.05）,穿台次数显着性少于WT组小鼠（P<0.05）,AD组小鼠的目标象限游泳时间百分比与WT组小鼠相比没有显着性差异（P>0.05）。AD组小鼠海马CA1、CA2-3和DG内Olig2+细胞总数均较WT组小鼠显着性增加（P<0.05）,且与逃避潜伏期呈正相关,与穿台次数呈负相关;AD组小鼠海马各区CNPase+细胞总数均较WT组小鼠显着性减少（P<0.05）,且与逃避潜伏期呈负相关。2.Western Blot结果显示AD组小鼠海马内OLG发育相关蛋白MBP（21k Da）、CNPase的蛋白水平显着性低于WT组小鼠（P<0.05）。WT组小鼠和AD组小鼠海马内MBP（17k Da）、NG2的蛋白水平没有显着性差异（P>0.05）。AD组小鼠海马内OLG机制相关蛋白Lingo1的蛋白水平显着性高于WT组小鼠（P<0.05）。WT组小鼠和AD组小鼠海马内MAG、MOG的蛋白水平没有显着性差异（P>0.05）。与WT组小鼠相比,AD组小鼠海马内GSK-3β的蛋白水平显着性增高（P<0.05）、p-ser9-GSK3β的蛋白水平显着性降低（P<0.05）。3.Aβ老年斑定性观察结果显示在WT组小鼠的海马中未发现淀粉样蛋白斑块,在AD组小鼠的海马中观察到许多大的淀粉样蛋白斑块。ELISA结果显示AD组小鼠海马中Aβ40、Aβ42淀粉样蛋白的浓度显着性高于WT组小鼠（P<0.05,P<0.05）。免疫荧光定性结果显示AD组小鼠海马各区（CA1、CA2-3和DG）内的P16+/Olig2+细胞分布较WT组小鼠密集,定量结果显示AD组小鼠海马CA2-3区和DG区内P16+/Olig2+细胞比例显着性大于WT组小鼠（P<0.05,P<0.05）,WT组小鼠和AD组小鼠海马CA1区P16+/Olig2+细胞比例没有显着性差异（P>0.05）。结论:1.10月龄APP/PS1转基因AD小鼠存在空间学习和记忆能力损害。2.AD小鼠海马内少突胶质细胞系（Olig2+细胞）数量增加,成熟OLG（CNPase+细胞）数量减少,提示AD小鼠海马内OLG的增殖、分化或成熟过程可能存在异常,且可能存在成熟OLG的损伤。3.AD小鼠海马内OLG的数量改变与其空间学习和记忆能力相关,且可能是空间学习记忆能力障碍的重要原因之一。4.AD小鼠海马内OLG成熟相关蛋白MBP、CNPase的蛋白水平减少,而增殖相关蛋白NG2没有显着性改变,提示AD小鼠海马内OLG主要存在成熟障碍。在AD小鼠海马内髓鞘抑制因子MAG和MOG的蛋白表达量没有显着性改变,但是Lingo1却存在高表达,提示Lingo1的高表达可能是AD小鼠海马内OLG成熟障碍的原因之一。GSK-3β的表达水平增高以及活性增强,进一步提示高表达的Lingo1可能导致下游GSK-3β的高表达和高活性,进而对OLG的成熟产生抑制作用。5.AD小鼠海马内表达P16的少突胶质细胞系增多,提示AD小鼠海马内OLG存在过多衰老表型,这可能是OLG无法正常成熟的重要原因之一。6.AD小鼠海马内存在Aβ老年斑的大量沉积以及可溶性Aβ水平大量增加,提示Aβ可能是导致OLG损伤的重要原因。成熟OLG的损伤及OLG的发育异常可能是AD海马内OLG/髓鞘改变的启动因子,同时也是AD认知功能改变的重要结构之一。第二部分AD少突胶质细胞改变的体外研究目的:体外探讨OLG是否在AD的超早期就已经存在改变,以及Aβ对AD少突胶质细胞的影响。方法:APP/PS1转基因或C57小鼠新生乳鼠取脑后进行体外原代少突胶质前体细胞（OPCs）培养,以及小鼠来源OPC细胞株（MOPC）的传代培养。APP/PS1转基因AD小鼠新生乳鼠原代OPCs纯化培养,经鼠尾基因型鉴定后,分为APP/PS1（-）组和APP/PS1（+）组,运用流式细胞术（FCM）检测各组原代OPCs的细胞周期与细胞凋亡变化情况,再通过Western Blot检测各组原代OPCs中OLG发育相关蛋白（CNPase、Olig2、NG2）以及机制相关蛋白（MAG、MOG、GSK-3β、p-ser9-GSK3β、P16、P21）的蛋白水平。传代培养的MOPC分为三组:Control组、0.5μM Aβ组、1μM Aβ组,运用FCM检测各组MOPC的细胞周期与细胞凋亡变化情况,然后运用real time RT-PCR检测Control组和0.5μM Aβ组MOPC中OLG发育相关蛋白NG2的m RNA水平,再通过Western Blot检测Control组和0.5μM Aβ组MOPC中OLG发育相关蛋白（NG2、PDGFRα）以及机制相关蛋白（MAG、MOG、P16、P21）的蛋白水平。纯化后的C57小鼠原代OPCs分为三组:C57+Control组、C57+0.5μM Aβ组、C57+1μM Aβ组,运用FCM检测各组原代OPCs的细胞周期与细胞凋亡变化情况。结果:1.APP/PS1转基因AD小鼠脑内原代OPCs的改变。FCM结果显示:与APP/PS1（-）组相比,APP/PS1（+）组小鼠脑内原代OPCs的G1期细胞比例显着性降低（P<0.05）、S期显着性增高（P<0.05）、G2/M期无显着性差异（P>0.05）,总细胞凋亡率显着性降低（P<0.05）、活细胞比例显着性增高（P<0.05）。Western Blot结果显示:APP/PS1（+）组小鼠脑内原代OPCs中发育相关蛋白CNPase的蛋白水平显着性低于APP/PS1（-）组（P<0.05）,Olig2和NG2的蛋白水平显着性高于APP/PS1（-）组（P<0.05,P<0.05）。APP/PS1（+）组小鼠脑内原代OPCs中机制相关蛋白MAG的蛋白水平显着性高于APP/PS1（-）组（P<0.05）,MOG的蛋白水平与APP/PS1（-）组相比无显着性差异（P>0.05）。与APP/PS1（-）组相比,APP/PS1（+）组GSK-3β的蛋白水平显着性增高（P<0.05）、p-ser9-GSK3β的蛋白水平显着性降低（P<0.05）。APP/PS1（+）组衰老蛋白P16的蛋白水平显着性高于APP/PS1（-）组（P<0.05）,APP/PS1（-）组和APP/PS1（+）组P21的蛋白水平无显着性差异（P>0.05）。2.Aβ对MOPC细胞株的影响。FCM结果显示:与Control组相比,0.5μM Aβ组MOPC的G1期细胞比例显着性减少（P<0.05）、S和G2/M期显着性增多（P<0.05,P<0.05）,1μM Aβ组MOPC的G1期细胞比例显着性减少（P<0.05）、S和G2/M期无显着性差异（P>0.05,P>0.05）。与Control组相比,0.5μM Aβ组MOPC的晚期和总细胞凋亡率显着性增高（P<0.05,P<0.05）、早期凋亡率无显着性差异（P>0.05）,1μM Aβ组MOPC的早期、晚期和总细胞凋亡率均无显着性差异（P>0.05,P>0.05,P>0.05）。real time RT-PCR结果显示:0.5μM Aβ组MOPC中NG2的m RNA水平显着性低于Control组（P<0.05）。Western Blot结果显示:与Control组相比,0.5μM Aβ组MOPC中NG2的蛋白水平显着性增高（P<0.05）,PDGFRα的蛋白水平无显着性差异（P>0.05）。Control组和0.5μM Aβ组MOPC中MAG、MOG、P16和P21的蛋白水平无显着性差异（P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05）。3.Aβ对C57小鼠脑内原代OPCs的影响。FCM结果显示:与C57+Control组相比,C57+0.5μM Aβ组小鼠脑内原代OPCs的G1、S和G2/M期细胞比例均无显着性差异（P>0.05,P>0.05,P>0.05）,C57+1μM Aβ组的G1期细胞比例显着性减少（P<0.05）、S期显着性增多（P<0.05）、G2/M期无显着性差异（P>0.05）。与C57+Control组相比,C57+0.5μM Aβ组小鼠脑内原代OPCs的早期、晚期和总细胞凋亡率均无显着性差异（P>0.05,P>0.05,P>0.05）,C57+1μM Aβ组的早期、晚期和总细胞凋亡率也均无显着性差异（P>0.05,P>0.05,P>0.05）。结论:1.APP/PS1转基因AD小鼠脑内原代OPCs的增殖增加、凋亡减少,提示OPCs的异常增殖和凋亡减少可能是AD小鼠少突胶质细胞系异常增加的原因之一。AD小鼠脑内原代OPCs表达少突胶质细胞成熟标记物CNPase减少,然而少突胶质细胞增殖相关蛋白Olig2和NG2的蛋白水平增高,提示AD小鼠脑内原代OPCs可能存在异常增殖和分化成熟障碍。AD小鼠脑内原代OPCs的MAG表达增多,且GSK-3β表达水平增高以及活性增强,提示AD小鼠脑内原代OPCs的成熟可能受到抑制。AD小鼠脑内原代OPCs表达P16增加,与体内结果一致。2.低浓度的Aβ1-42导致MOPC过度增殖、凋亡增加,而高浓度的Aβ1-42对MOPC的增殖和凋亡没有显着影响,提示不同浓度的Aβ对MOPC的影响不同,而低浓度的Aβ对MOPC的损伤更强,在引起MOPC过度激活、增殖增多的同时,也会对MOPC造成损伤。低浓度的Aβ1-42干预后MOPC中PDGFRα蛋白含量无差异,NG2蛋白含量增加且其m RNA水平反应性降低,提示MOPC增殖可能增加。低浓度的Aβ1-42并不影响MOPC表达MAG、MOG、P16和P21。3.低浓度的Aβ1-42对C57小鼠原代OPCs的增殖和凋亡没有显着影响,而高浓度的Aβ1-42导致C57小鼠原代OPCs过度增殖,提示不同浓度的Aβ对原代OPCs的影响不同,而高浓度的Aβ对原代OPCs的损伤更强,同时也表明与原代OPCs相比MOPC对Aβ的损伤作用更敏感。高浓度的Aβ1-42对C57小鼠原代OPCs的凋亡没有影响,提示Aβ对正常小鼠原代OPCs的影响主要是过度激活,而非引起细胞凋亡。第三部分抗精神病药物对AD少突胶质细胞作用的初步探讨目的:在体外初步探讨抗精神病药物（氟西汀和喹硫平）对AD少突胶质细胞的作用,为寻找预防及治疗AD的可能药物提供有效的体外科学依据。方法:MOPC传代培养,待细胞汇合至50%左右,给予两种浓度的Aβ1-42（0.5μmol/L、1μmol/L）作用24 h后,再对每组细胞分别进行氟西汀（FLX,5μmol/L）和喹硫平（QUE,0.5μmol/L）药物干预,共分为九组:Control组、0.5μM Aβ组、1μM Aβ组、MOPC+FLX组、MOPC+0.5μM Aβ+FLX组、MOPC+1μM Aβ+FLX组、MOPC+QUE组、MOPC+0.5μM Aβ+QUE组、MOPC+1μM Aβ+QUE组,24 h后收集各组细胞,通过FCM检测各组MOPC的细胞周期与细胞凋亡变化情况。C57小鼠原代OPCs培养,待细胞汇合至50%左右,给予1μmol/L Aβ1-42作用24 h后,再对每组细胞分别进行FLX（5μmol/L）和QUE（0.5μmol/L）药物干预,共分为六组:C57+Control组、C57+1μM Aβ组、C57+FLX组、C57+1μM Aβ+FLX组、C57+QUE组、C57+1μM Aβ+QUE组,24 h后收集各组细胞,通过FCM检测各组原代OPCs的细胞周期变化情况。结果:1.与Control组相比,MOPC+FLX组MOPC的G1期细胞比例显着性增多（P<0.05）、S和G2/M期显着性减少（P<0.05,P<0.05）,早期、晚期和总细胞凋亡率均显着性降低（P<0.05,P<0.05,P<0.05）。与0.5μM Aβ组相比,MOPC+0.5μM Aβ+FLX组MOPC的G1期细胞比例显着性增多（P<0.05）、S期显着性减少（P<0.05）,G2/M期无显着性差异（P>0.05）,早期、晚期和总细胞凋亡率均显着性降低（P<0.05,P<0.05,P<0.05）。与1μM Aβ组相比,MOPC+1μM Aβ+FLX组MOPC的G1、S和G2/M期细胞比例均无显着性差异（P>0.05,P>0.05,P>0.05）,早期凋亡率显着性增高（P<0.05）,而晚期和总细胞凋亡率均无显着性差异（P>0.05,P>0.05）。2.与C57+Control组相比,C57+FLX组小鼠脑内原代OPCs的G1期细胞比例显着性增多（P<0.05）、G2/M期显着性减少（P<0.05）、S期无显着性差异（P>0.05）。与C57+1μM Aβ组相比,C57+1μM Aβ+FLX组原代OPCs的S期细胞比例显着性减少（P<0.05）、G1和G2/M期无显着性差异（P>0.05,P>0.05）。3.与Control组相比,MOPC+QUE组MOPC的G1和S期细胞比例无显着性差异（P>0.05,P>0.05）、G2/M期显着性增多（P<0.05）,早期凋亡率显着性增高（P<0.05）、晚期凋亡率显着性降低（P<0.05）、总细胞凋亡率无显着性差异（P>0.05）。与0.5μM Aβ组相比,MOPC+0.5μM Aβ+QUE组MOPC的G1期细胞比例显着性增多（P<0.05）、S期显着性减少（P<0.05）、G2/M期无显着性差异（P>0.05）,早期凋亡率显着性增高（P<0.05）、晚期和总细胞凋亡率均显着性降低（P<0.05,P<0.05）。与1μM Aβ组相比,MOPC+1μM Aβ+QUE组MOPC的S期细胞比例显着性减少（P<0.05）、G1和G2/M期无显着性差异（P>0.05,P>0.05）,早期凋亡率显着性增高（P<0.05）、晚期和总细胞凋亡率均显着性降低（P<0.05,P<0.05）。4.与C57+Control组相比,C57+QUE组小鼠脑内原代OPCs的G1、S和G2/M期细胞比例均无显着性差异（P>0.05,P>0.05,P>0.05）。与C57+1μM Aβ组相比,C57+1μM Aβ+QUE组原代OPCs的G1期细胞比例显着性增多（P<0.05）、S期显着性减少（P<0.05）、G2/M期无显着性差异（P>0.05）。结论:FLX和QUE干预后MOPC的增殖减少、凋亡减少,提示FLX和QUE能够减轻Aβ对MOPC的过度刺激,抑制MOPC的增殖,同时也能够在一定程度上减轻Aβ对MOPC的损伤。2.FLX和QUE干预后C57小鼠原代OPCs的增殖减少,提示FLX和QUE能够在一定程度上减轻Aβ对正常小鼠原代OPCs的过度刺激,抑制OPCs的增殖。3.FLX和QUE对AD脑内少突胶质细胞可能具有保护作用。
徐阳春[7]（2020）在《外周血肿瘤相关抗原自身抗体与肝癌发病的关系研究》文中研究指明目的:原发性肝癌（primary liver cancer,PLC）,是全世界最常见的恶性肿瘤之一,是第三位肿瘤致死性病因。我国肝癌患者约占全球病例总数的一半,肝癌的晚期诊断是导致死亡率居高不下的重要原因。肝癌的早期诊断、早期预防是降低死亡率的重要举措。甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein,AFP）是目前临床应用最为广泛的诊断标志物,但有2030%的患者血清中AFP水平并不升髙,仅以其作为诊断标志性数据,可能造成一定比例的遗漏或误判,因此需要新的肿瘤生物标志物共同辅助肝癌的诊断。肿瘤相关抗原（Tumor-associated antigens,TAAs）是临床上肿瘤标志物检测的主要靶标,肿瘤相关自身抗体是机体对肿瘤相关抗原进行体液免疫应答的产物。许多研究发现癌症患者血浆中自身抗体的存在,它们具有许多目前肝癌筛查手段不具备的优势,如结构稳定、不易降解、半衰期长等,而最重要的是自身抗体出现较早,在临床症状出现之前甚至在癌前病变中即检测到其存在。本研究主要通过设计并合成的线性抗原肽检测肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）患者血浆中自身抗体的变化,试图寻找一种或几种能用于HCC诊断或预后评估的生物学标志物。方法:通过查阅文献,本研究纳入CD25、OCT4、p16、BIRC5、c-myc、ANXA-1这6种目标蛋白,根据课题组前期工作基础,优化抗原多肽设计以提高抗原多肽的稳定性及检测抗体的效力,将来源于同一种蛋白的不同抗原表位设计成独立的多条线性抗原肽,以寻找能够触发机体体液免疫应答的关键表位。本研究共纳入首次诊断且未经任何治疗HCC122例及与其性别、年龄相匹配的健康对照231例,运用优化的ELISA法检测HCC组和健康对照组血浆中相应自身抗体的表达水平,应用SPSS22.0进行数据统计和分析,从性别、年龄、巴塞罗那分期（Barcelona clinic liver cancer,BCLC）层面比较两组自身抗体表达水平的差异;在HCC组内根据AFP、肿瘤大小、是否合并血管受累及肝外转移进行亚组分析。运用ROC曲线分析不同抗体对肝癌诊断的价值,同时结合HCC患者的临床随访信息,运用kaplan-Meier曲线及Cox回归探讨自身抗体的水平与HCC患者总生存期（OS）之间的关系及影响患者预后的因素。结果:（1）CD25自身抗体的表达情况。与健康对照相比,HCC患者血浆CD25 IgG水平显着增高（P<0.001）。CD25 IgG在不同性别、年龄HCC患者中表达均较健康对照增加。B期、C+D期患者血浆中CD25 IgG的表达较健康对照显着增加（P<0.001;P<0.001）,并且随着肿瘤的进展表达逐渐增加。CD25 IgG水平在AFP高表达组中较AFP正常或低表达组显着增高（P=0.004）。肿瘤<3cm组CD25 IgG水平明显低于3-5cm和≥5cm组CD25 IgG水平（P=0.025）。ROC分析结果显示,当特异度为95.0%时,CD25 IgG诊断HCC的敏感度为14.8%。（2）OCT4自身抗体的表达情况。与健康对照相比,HCC患者血浆OCT4 IgG水平显着增高（P<0.001）。OCT4 IgG在男性、女性HCC患者中表达均较健康对照增加,但无性别差异。与同年龄层健康人群相比,年龄≥50岁的HCC患者中血浆OCT4 IgG水平明显升高（P<0.001）;亚组分析显示,OCT4 IgG表达在血管受累阳性组明显高于血管受累阴性组（P=0.019）。0+A期、B期、C+D期患者血浆中OCT4 IgG的表达较健康对照均显着增加（P=0.031;P=0.002;P<0.001）,并且随着肿瘤的进展表达逐渐增加。ROC分析结果显示,当特异度为95.0%时,OCT4 IgG诊断HCC的敏感度为18.9%。OCT4 IgG对C+D期HCC诊断的敏感度达到了26.9%。Kaplan-Meier生存分析发现HCC患者血浆中OCT4 IgG的表达与预后呈负相关。多因素Cox回归分析发现BCLC分期、肝外转移、血管受累及OCT4 IgG水平是影响肝癌患者预后的重要的因素。（3）p16自身抗体的表达情况。与健康对照相比,HCC患者血浆p16a IgG水平显着增高（P<0.001）。p16a IgG在不同性别、年龄HCC患者中表达均较健康对照增加。B期、C+D期患者血浆中p16a IgG的表达较健康对照显着增加（P<0.001;P<0.001）,并且随着肿瘤的进展表达逐渐增加。ROC分析结果显示,当特异度为95.0%时,p16a IgG诊断HCC的敏感度为17.2%。尝试用改良方法检测p16a,得到相近的结果,诊断HCC的敏感度为11.4%。并且来源于同一蛋白的抗原多肽在HCC患者中的表达趋势也不尽相同。与健康对照相比,HCC患者血浆p16b IgG水平差异无显着统计学意义（P=0.981）。（4）BIRC5、c-myc、ANXA-1自身抗体的表达情况。与健康对照相比,HCC患者血浆BIRC5a、BIRC5b、c-myc、ANXA-1 IgG水平差异无显着统计学意义（P=0.376;P=0.529;P=0.301;P=0.062）。结论:（1）CD25、p16a自身抗体水平在中、晚期HCC患者血浆中显着增高,对HCC具有一定的诊断价值。CD25自身抗体水平在AFP高表达组中较AFP正常或低表达组显着增高。CD25自身抗体检测可以与AFP联合,共同辅助肝癌的诊断。（2）OCT4自身抗体在HCC患者中表达水平随BCLC分期明显升高,OCT4自身抗体水平与预后呈负相关,OCT4自身抗体可能是HCC的潜在生物学标志物,对HCC预后评估有进一步开发的价值。（3）p16b、BIRC5、c-myc、ANXA-1自身抗体的表达水平在两组之间均未见差异,课题组既往发表研究结果显示这些自身抗体水平在其它肿瘤中异常表达,这说明不同组织类型中自身抗体表达水平不同,其具有较高的器官特异性。（4）抗原多肽设计方法及优化的ELISA检测方法显示出了良好的抗体检测效力;通过设计多条同源抗原多肽的方法,筛选出了p16蛋白结构中触发机体免疫应答的关键表位,为今后优化抗体检测及临床应用奠定了基础。
黄天璐[8]（2020）在《细胞周期蛋白依赖激酶7抑制剂的抗胆管癌作用机制和联合用药研究》文中研究指明背景和目的胆管癌是一种预后极差的肿瘤,主要原因是现有的临床治疗方案疗效有限。目前胆管癌常用的治疗方案是根治性手术切除、肝移植和化疗,由于缺乏早期临床症状,许多患者在确诊时已经处于进展期,而胆管癌对化疗并不敏感,导致这些失去根治性手术或肝移植机会的病人的中位生存期不足48个月。因此,亟需寻找有效的新的抗胆管癌靶点及药物并制定有效的治疗方案。2016年的一项研究,通过对现有胆管癌的基因表达综合数据库进行整合分析,发现胆管癌与正常组织相比存在48个差异表达的转录因子,并且细胞周期相关基因在胆管癌中富集程度最高。因此,为了寻找新的抗胆管癌的有效靶点,我们在三株胆管癌细胞中,对一个靶向细胞周期基因的小分子抑制剂库进行了抗肿瘤活性药物筛选,结果发现胆管癌细胞对细胞周期蛋白依赖激酶7（CDK7）抑制剂普遍敏感。CDK7是CDK家族的成员之一,控制转录起始和延伸,并参与细胞周期的调控。近年来有研究显示,CDK7参与介导调控了一些重要的基因簇的转录,这些基因簇常与超级增强子相关。此外,CDK7在肿瘤组织中的表达常常升高,因此CDK7在肿瘤中可能是一个重要的潜在治疗靶点。本研究的目的是评估CDK7在胆管癌细胞中的作用,探究CDK7抑制剂的抗胆管癌作用机制,并探究与其他抑制剂的协同抗胆管癌方案,为临床治疗胆管癌提供新的思路与策略。方法利用TCGA数据及GEO中的数据分析CDK7的m RNA在胆管癌中的表达,并利用组织芯片进行免疫组化,验证CDK7在胆管癌组织中的蛋白表达水平及CDK7与MCL1表达的相关性。使用药物处理或小干扰RNA（si RNA）沉默目的基因的表达后,使用CCK-8检测细胞活性,使用Compu Syn软件计算药物之间的联合指数（CI）。利用流式细胞术检测细胞凋亡、Caspase3/7试剂盒检测细胞内caspase3/7活性、Brd U ELISA增殖试剂盒检测细胞增殖。通过Real-time q PCR检测目的基因的m RNA水平、Western blot检测目的基因的蛋白表达。通过构建裸鼠皮下移植瘤并进行体内给药实验,探究CDK7抑制剂THZ1对胆管癌移植瘤生长的影响,并观察对裸鼠是否存在明显的毒副反应。THZ1处理胆管癌细胞后,进行RNA测序,对测序结果进行分析,寻找下游靶点,探究分子机制。结果对TCGA数据及GEO中的数据集的分析结果以及免疫组化结果显示,CDK7在胆管癌组织中的表达明显高于癌旁组织及正常组织。使用小分子抑制剂抑制CDK7活性或使用si RNA沉默CDK7表达可以抑制胆管癌细胞的活性,抑制胆管癌细胞增殖并促进凋亡发生。THZ1可以抑制胆管癌皮下移植瘤的生长,且对裸鼠体重及活力没有明显的抑制作用。THZ1可以下调CDK7介导的RNP2的磷酸化,抑制转录进程。对RNA测序结果进行GO分析显示,THZ1对DNA转录相关的基因影响较大。在被THZ1显着下调的基因中包含许多致癌转录因子和存活蛋白如FOSL1、RUNX1和MCL1。MCL1是胆管癌重要的抗凋亡蛋白,免疫组化显示CDK7的表达与MCL1具有明显相关性。利用si RNA干扰MCL1的表达或使用MCL1抑制剂可增强BCL2/BCL-XL抑制剂ABT-263的抗胆管癌作用,联合使用CDK7抑制剂或si RNA与ABT-263可发挥协同抗胆管癌作用,显着增加细胞凋亡。结论CDK7抑制剂THZ1可以抑制胆管癌细胞存活,促进胆管癌细胞凋亡,并显着抑制基因转录。同时,THZ1可通过抑制抗凋亡蛋白MCL1的表达,与ABT-263发挥协同抗胆管癌作用。因此,CDK7可能是治疗胆管癌的有效靶点,同时抑制CDK7与BCL2/BCL-XL可能成为胆管癌治疗新策略。
沈珺珺[9]（2020）在《δ-生育三烯酚抗炎抗癌的生理功能及其分子机理研究》文中研究说明δ-生育三烯酚（δ-tocotrienol）是维生素E的重要组成成分,然而在关于维生素E的研究中大部分是研究生育酚,尤其是α-生育酚,然而最近研究表明δ-生育三烯酚（δ-tocotrienol）在抗炎和抗部分种类的癌症效果比生育酚更显着,并且δ-生育三烯酚比γ-生育三烯酚在多种肿瘤的抗癌效果方面甚至优于γ-生育三烯酚和维生素E的其他组份,然而对δ-生育三烯酚（δ-tocotrienol）抗炎以及抗鼻咽癌的分子机理并未有深入地研究。鼻咽癌是一种在中国南方、东南亚、非洲北部、中东和北极地区发病率比较高的癌症,所以在我们的日常饮食中能到找到有肿瘤化学预防的物质对于鼻咽癌高发区的人的健康有十分重要的意义。本课题采用超声法提取米糠油以及CO2超临界提取δ-生育三烯酚,并对δ-生育三烯酚用HPLC进行了检测,然后以RAW264.7和CNE1细胞为模型,评估δ-生育三烯酚对炎症的巨噬细胞RAW264.7体外模型和鼻咽癌的细胞模型的抗炎和抗癌的功效,在此基础上,探讨δ-生育三烯酚抗炎以及抗癌的分子机理,为进一步深入研究δ-生育三烯酚和开发δ-生育三烯酚的各种功能性食品、保健品提供科学的理论依据。1.δ-生育三烯酚的提取与检测将米糠干燥并粉碎,装入高压容器中。接下来在CO2超临界萃取装置上萃取米糠油并用分析天平定时称重。用高效液相色谱（HPLC）对米糠油进行分离和检测,得到的实验结果为δ-生育三烯酚在米糠油中的含量是132.7μg/kg.与标准品相对照,则分离的δ-生育三烯酚的纯度为96.2%。2.δ-生育三烯酚的抗炎功能及其分子机理研究为了从细胞层面的体外模型观察δ-生育三烯酚的抗炎作用,本研究利用RAW264.7细胞,观察δ-生育三烯酚对经过脂多糖（LPS）诱导后的RAW264.7细胞活性的抑制效果。首先,光学显微镜观察和MTS分析发现0-80μM浓度下δ-生育三烯酚对RAW264.7细胞的存活无显着毒性。脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞RAW264.7结果表明20、40、80μMδ-生育三烯酚能显着抑制RAW264.7的促炎因子的表达。LPS诱导组对比对照组,促炎因子TNFα、IL-6、IL-1β、i NOS的m RNA表达量和蛋白表达明显上升,对比LPS组,δ-生育三烯酚组能够降低这些m RNA和蛋白质表达,且结果呈现出一定剂量依赖关系。研究发现,ERK1/2、JNK、p38蛋白磷酸化水平受到明显抑制,且呈剂量依赖性,说明δ-生育三烯酚在炎症反应中能抑制MAPK信号通路的活化,从而抑制转录因子AP-1、NF-κB活化和炎症因子的表达。结果表明,δ-生育三烯酚通过JNK和ERK1/2的磷酸化调节PPARα的磷酸化,通过调节由JNK和ERK1/2和p38来调节PPARγ,从而抑制炎症因子的表达。3.δ-生育三烯酚对鼻咽癌细胞CNE1的促使凋亡和抑制增殖作用及其分子机理研究本研究立足于评估δ-生育三烯酚对鼻咽癌细胞CNE1的促使凋亡和增殖的影响,发现在δ-生育三烯酚处理鼻咽癌CNE1细胞后,在光学显微镜和Hoechst33258荧光染色的细胞形态学方面在0-72 h间有明显的有促使凋亡的作用,并且连同MTS检测的结果表明δ-生育三烯酚对CNE1细胞增殖抑制率在0-80μM明显地呈剂量依赖特征。用细胞流式仪分别对δ-生育三烯酚处理的CNE1细胞的凋亡过程和增殖周期进行检测。在诱导凋亡方面通过Western blotδ-生育三烯酚明显地下调Bcl-2,而Bax,Caspase-3,Caspase-9等调控细胞凋亡的关键靶基因的转录和表达则上调并呈剂量依赖的特点,Caspase-8无明显变化。而在抑制增殖方面则明显地下调Cyclin D1,CDK2,CDK4,提示δ-生育三烯酚能下调细胞周期素的表达和抑制CDK的活性。通过实时荧光定量聚合酶链式反应和蛋白印迹发现,不同浓度的δ-生育三烯酚处理后,CDKI中p16、p18、p21、p27和p53表达明显上调,且呈剂量依赖性,但p15、p18和p19表达则无明显改变。说明δ-生育三烯酚可能通过下调细胞周期素的表达、抑制CDK的活性和上调一些CDKI表达阻滞细胞周期,从而抑制癌细胞的增殖。结果显示,δ-生育三烯酚通过p16/CDK4/cyclin D1引起CNE1细胞周期的阻滞。本研究运用了基因芯片来分析δ-生育三烯酚对CNE1细胞周期和细胞增殖的影响,发现有169个基因上调,167个基因下调。研究发现δ-生育三烯除了干预MAPK信号通路外,还能通过干预多条信号通路和多靶点抑制鼻咽癌的增殖。因此,δ-生育三烯酚通过Caspase-3信号通路触发CNE1细胞凋亡。这两个信号通路都受NF-κB调控。总的来说,我们认为δ-生育三烯醇在CNE1细胞中发挥抗癌作用的通路是NF-κB信号通路。
秦琼[10]（2020）在《CDK4/6抑制剂在非小细胞肺癌细胞系的抗肿瘤作用研究及逆转三代EGFR-TKI耐药的机制探索》文中认为目的:细胞周期依赖激酶（Cyclin Dependent Kinase,CDK）4/6抑制剂是特异性的细胞周期激酶4/6的抑制剂。细胞周期调控异常是恶性肿瘤的基本特征之一。探讨CDK4/6抑制剂哌柏西利在NSCLC细胞系中的作用以及KRAS突变、LKB1突和KRAS/LKB1共突变能否成为预测CDK4/6抑制剂疗效的生物标志物。探讨CDK4/6抑制剂能否逆转三代EGFR-TKI奥希替尼的耐药,CDK4/6抑制剂和奥希替尼是否具有协同作用,逆转耐药可能的机制,进而为CDK4/6抑制剂在非小细胞肺癌未来治疗中找到获益人群并提供合理的治疗策略。方法:应用CCK8（Cell Counting Kit 8）探索多种NSCLC细胞系对CDK4/6抑制剂哌柏西利的敏感性。用Western Blot检测LKB1是否敲降成功,探索KRAS突变、LKB1突变和KRAS/LKB1共突变是否和CDK4/6抑制剂哌柏西利的敏感性相关。用Western Blot、Real-Time PCR探索奥希替尼耐药细胞系H1975OR的耐药机制是否和细胞周期调控异常相关,评估细胞周期相关基因和蛋白如CDK4、CDK6、Cyclin D1、RB、CDKN2A以及EMT相关基因Snail等在敏感细胞系H1975S和耐药细胞系H1975OR之间是否存在差异;流式细胞仪检测H1975S和H1975OR在细胞周期分布方面是否存在差异。在药物应用方面,首先评估哌柏西利在H1975S和H1975OR敏感性是否存在差异;其次用药物协同指数评估,哌柏西利和奥希替尼是否存在协同和叠加效应;最后用Western Blot、Real-Time PCR评估单药哌柏西利、单药奥希替尼以及联合治疗细胞周期相关蛋白及Snail蛋白的变化,探讨CDK4/6抑制剂哌柏西利联合奥希替尼逆转三代EGFR-TKI耐药的机制。结果:（1）、Western Blot验证H1299-sh LKB1#408和H1299-sh LKB1#411细胞系,LKB1敲降成功,H1299-sh LKB1#407细胞系LKB1未敲降成功。进一步对多种肺癌细胞系进行CDK4/6抑制剂敏感性实验。在KRAS/LKB1野生型细胞系H1975、H1299细胞系,KRAS突变细胞系Calu-1,LKB1敲降细胞系H1299-sh LKB1#408、H1299-sh LKB1#411,LKB1未敲降成功细胞系H1299-sh LKB1#407以及LKB1/KRAS共突变细胞系A549和H460对CDK4/6抑制剂哌柏西利IC50分别为12.93μM、13.01μM、29.22μM、9.478μM、12.84μM、11.44μM、6.604μM和10.46μM。和H1975S细胞系相比,Cula-1对CDK4/6抑制剂敏感性降低（P=0.001）、A549敏感性增加（P=0.005）、H460细胞系敏感性没有统计学差异（P=0.140）。和H1299相比,H1299-sh LKB1#407、H1299-sh LKB1#408和H1299-sh LKB1#411细胞系哌柏西利IC50无统计学差异（P值分别为0.459,0.158和0.967）。整体上KRAS/LKB1共突变可能会导致对CDK4/6抑制剂敏感性增加,但是没有达到10倍以上的差异。（2）和H1975S细胞系相比,H1975OR耐药细胞系对CDK4/6抑制剂哌柏西利的敏感性增加,IC50分别为12.94μM和4.776μM,具有统计学差异（P<0.05）。在细胞周期方面,敏感细胞系H1975S G1期细胞占38.70%（±3.51%）,耐药细胞系H1975OR G1期细胞占25.5%（±1.15%）,具有统计学差异（P=0.023）。在H1975OR细胞系中,和DMSO相比,单用哌柏西利明显增加G1期阻滞细胞比例58.79%（±0.80%）,联合奥希替尼G1期阻滞细胞比例进一步增高71.33%（±3.55%）,具有统计学差异（P<0.001）。在H1975OR细胞系中,单用CDK4/6抑制剂哌柏西利（1.25μM）细胞存活率81.67%（±1.29%）,单用奥希替尼（2.5μM）细胞存活率为73.80%（±5.41%）,联合治疗细胞存活率为40.67%（±1.13%）,联合治疗和任何单药相比,均具有统计学差异（P<0.05）。在机制方面,和H1975S细胞系相比,H1975OR细胞系RT-PCR显示:促进细胞周期的相关基因CDK4、CDK6、CCND1 m RNA水平明显上调,分别增加敏感细胞的1.43倍、1.81倍和1.96倍（具体P值为0.065、0.052,0.049）,而抑制细胞周期的相关基因CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B m RNA明显下调,分别为敏感细胞的34.40%、15.63%、32.17%和24.95%（具体P值为0.041、0.0.12、0.003和0.001）。Western Blot证实CDK4、p-RB在耐药细胞系H1975OR中明显增强;H1975S细胞系,随着奥希替尼作用时间延长,CDK4、p-RB在增强,细胞周期异常参与耐药机制。CDK4/6抑制剂哌柏西利联合奥希替尼能够抑制CDK4/6-Cyclin D1的功能活化,抑制p-RB的初始磷酸化,下调p-RB磷酸化,进而阻滞细胞通过R限制点,进入细胞合成S期,控制肿瘤增殖。（3）在H1975OR细胞系中,Western Blot证实Snail中表达增强,但是RT-PCR Snail m RNA在敏感细胞H1975S和耐药细胞H1975OR无明显增加,没有统计学差异。进一步验证,Snail蛋白表达增加主要是由于调控Snail去泛素化酶DUB3增加,RT-PCR证实在耐药细胞H1975OR细胞系DUB3 m RNA明显增加。CDK4/6抑制剂可能调控DUB3基因的表达来调控Snail,参与逆转耐药。结论:KRAS突变、LKB1突变和KRAS/LKB1共突变不能作为单药CDK4/6抑制剂哌柏西利在NSCLC细胞系疗效相关的生物标记物。细胞周期调控异常参与三代EGFR-TKI奥希替尼耐药机制,CDK4/6抑制剂哌柏西利联合奥希替尼通过调控细胞周期、EMT等多种通路逆转耐药,有进一步在临床验证的研究价值。
二、细胞周期素依赖激酶抑制因子p16表达与神经母细胞瘤发生发展的相关性研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞周期素依赖激酶抑制因子p16表达与神经母细胞瘤发生发展的相关性研究（论文提纲范文）
（1）Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 神经母细胞瘤概述 |
| 1.1.1 神经母细胞瘤的现状 |
| 1.1.2 神经母细胞瘤发病机制 |
| 1.1.3 神经母细胞瘤危险因素 |
| 1.2 DEHP与神经母细胞瘤 |
| 1.2.1 DEHP概述 |
| 1.2.2 DEHP对神经母细胞瘤的影响 |
| 1.3 Notch信号通路与神经母细胞瘤 |
| 1.4 DEHP对 Notch信号通路的影响 |
| 第2章 MEHP对 SH-SY5Y细胞增殖的影响及其机制 |
| 2.1 主要仪器和试剂 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要材料 |
| 2.1.3 主要试剂配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 SH-SY5Y细胞株的体外培养 |
| 2.2.2 MEHP染毒剂量的确定和实验分组 |
| 2.2.3 SH-SY5Y细胞周期检测 |
| 2.2.4 SH-SY5Y细胞凋亡情况检测 |
| 2.2.5 SH-SY5Y细胞周期和凋亡相关基因m RNA表达水平检测 |
| 2.2.6 SH-SY5Y细胞增殖相关蛋白表达水平检测 |
| 2.2.7 数据处理与分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞增殖的影响 |
| 2.3.2 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞增殖相关基因m RNA表达水平的影响 |
| 2.3.3 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞增殖相关蛋白表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞增殖的影响 |
| 2.4.2 细胞周期关键基因在MEHP暴露影响SH-SY5Y细胞增殖中的作用 |
| 2.4.3 细胞凋亡关键基因在MEHP暴露影响SH-SY5Y细胞增殖中的作用 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 MEHP对 SH-SY5Y细胞迁移的影响及其机制 |
| 3.1 主要仪器和材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞迁移距离测定 |
| 3.2.2 细胞侵袭能力测定 |
| 3.2.3 细胞趋化因子测定 |
| 3.2.4 细胞迁移相关基因m RNA表达水平检测 |
| 3.2.5 细胞迁移相关蛋白表达水平检测 |
| 3.2.6 数据处理与分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞迁移的影响 |
| 3.3.2 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞迁移相关基因m RNA表达的影响 |
| 3.3.3 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞迁移相关蛋白表达的影响 |
| 3.3.4 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞趋化因子的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞迁移的影响 |
| 3.4.2 迁移关键基因在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中的作用 |
| 3.4.3 肿瘤微环境关键基因在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中的作用 |
| 3.4.4 趋化因子在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中的作用 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路的影响 |
| 4.1 主要仪器和材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路基因m RNA表达的影响检测 |
| 4.2.2 MEHP对 SH-SY5Y细胞Notch信号通路蛋白表达的影响检测 |
| 4.2.3 数据处理与分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路基因m RNA表达水平的影响 |
| 4.3.2 MEHP对 SH-SY5Y细胞Notch信号通路蛋白表达水平的影响 |
| 4.3.3 Notch信号通路蛋白表达水平与SH-SY5Y细胞增殖的关系 |
| 4.3.4 Notch信号通路蛋白表达水平与SH-SY5Y细胞迁移的关系 |
| 4.3.5 Notch信号通路蛋白表达水平与SH-SY5Y细胞趋化因子的关系 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 MEHP对 Notch信号通路的影响 |
| 4.4.2 Notch信号通路与细胞增殖的关联性 |
| 4.4.3 Notch信号通路与细胞迁移的关联性 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制 |
| 5.1 主要仪器和材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 DAPT对 SH-SY5Y细胞存活率的影响 |
| 5.2.2 Notch信号通路抑制效率检测 |
| 5.2.3 实验分组 |
| 5.2.4 指标检测 |
| 5.2.5 数据处理与分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 DAPT剂量确定 |
| 5.3.2 Notch信号通路在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖中的作用 |
| 5.3.3 Notch信号通路在MEHP促进SH-SY5Y细胞迁移中的作用 |
| 5.3.4 Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞趋化因子中的作用 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 Notch信号通路在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖中的作用及机制 |
| 5.4.2 Notch信号通路在MEHP促进SH-SY5Y细胞迁移中的作用及机制 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 环境内分泌干扰物与儿童神经系统疾病 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）阳离子PCL-b-P（GMA-EA）载体递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 基因治疗载体的研究进展 |
| 1.1.1 病毒载体 |
| 1.1.2 细菌载体 |
| 1.1.3 人工合成载体 |
| 1.1.4 结语与展望 |
| 1.2 神经母细胞瘤 |
| 1.2.1 神经母细胞瘤的发生及流行病学 |
| 1.2.2 神经母细胞瘤分子生物学特征及动物研究模型 |
| 1.2.3 神经母细胞瘤的临床表现及分期分层 |
| 1.2.4 神经母细胞瘤的治疗 |
| 1.2.5 结语与展望 |
| 1.3 GRIM-19的研究进展 |
| 1.3.1 GRIM-19的发现、结构及分布 |
| 1.3.2 GRIM-19的突变及下调与恶性肿瘤的关系 |
| 1.3.3 GRIM-19的功能 |
| 1.3.4 结语与展望 |
| 第2章 实验部分 |
| 2.1 PCG阳离子聚合物的合成及转染肿瘤细胞的检测 |
| 2.1.1 前言 |
| 2.1.2 材料和方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 GRIM-19蛋白在神经母细胞瘤组织中的表达 |
| 2.2.1 前言 |
| 2.2.2 材料和方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 阳离子聚合物递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的作用及机制研究 |
| 2.3.1 前言 |
| 2.3.2 材料和方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 小结 |
| 第3章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）长链非编码RNA MALAT1在前列腺癌中的功能和作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 背景回顾 |
| 1.2.1 MALAT1的结构和生成 |
| 1.2.2 MALAT1的定位 |
| 1.2.3 调控MALAT1的机制 |
| 1.2.4 MALAT1的调控机制 |
| 1.2.5 MALAT1与肿瘤的关系 |
| 第2章 MALAT1在前列腺癌中的表达及功能的研究 |
| 前言 |
| 第一节 MALAT1在前列腺癌组织中的表达及作用 |
| 1、材料与方法 |
| 1.1 数据资料收集 |
| 1.2 数据整理和临床病理特征相关性分析 |
| 1.3 生存分析 |
| 1.4 ROC曲线分析 |
| 1.5 基因集富集分析 |
| 1.6 统计分析 |
| 2、实验结果 |
| 2.1 MALAT1在PCa组织中的表达情况 |
| 2.2 MALAT1在不同临床特征的PCa患者中的表达情况 |
| 2.3 MALAT1表达与预后的关系 |
| 2.4 MALAT1对PCa的诊断价值 |
| 2.5 MALAT1的功能富集分析 |
| 第二节 MALAT1在前列腺癌细胞中的表达和功能 |
| 1、材料与方法 |
| 1.1 细胞来源 |
| 1.2 实验材料和仪器 |
| 1.3 试剂配置 |
| 1.4 细胞处理 |
| 1.4.1 细胞复苏 |
| 1.4.2 细胞传代 |
| 1.4.3 细胞计数 |
| 1.4.4 细胞冻存 |
| 1.4.5 细胞转染 |
| 1.4.6 单克隆细胞株的筛选和培养 |
| 1.4.7 细胞加药 |
| 1.5 质粒构建 |
| 1.5.1 引物退火 |
| 1.5.2 质粒提取 |
| 1.5.3 基因重组 |
| 1.6 荧光定量PCR |
| 1.6.1 总RNA提取 |
| 1.6.2 RNA浓度检测 |
| 1.6.3 反转录 |
| 1.6.4 实时荧光定量分析 |
| 1.7 western blot |
| 1.7.1 蛋白质抽提 |
| 1.7.2 蛋白质定量 |
| 1.7.3 SDS-PAGE |
| 1.7.4 转印 |
| 1.7.5 封闭 |
| 1.7.6 孵育一抗 |
| 1.7.7 孵育二抗 |
| 1.7.8 ECL底物发光 |
| 1.7.9 结果分析 |
| 1.8 划痕实验检测细胞迁移能力 |
| 1.9 Transwell小室实验检测细胞侵袭能力 |
| 1.9.1 Transwell侵袭实验小室模型建立 |
| 1.9.2 Transwell小室侵袭实验 |
| 1.10 流式细胞仪检测有丝分裂 |
| 1.10.1 细胞接种培养 |
| 1.10.2 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 1.11 CCK8检测细胞增殖能力 |
| 1.12 统计学分析 |
| 2、实验结果 |
| 2.1 MALAT1在PCa细胞中的表达情况 |
| 2.2 验证sh MALAT1在LNCa P和22Rv1 细胞中的转染效力 |
| 2.3 沉默MALAT1对PCa细胞的迁移侵袭能力的影响 |
| 2.4 沉默MALAT1对PCa细胞上皮间质转化的影响 |
| 2.5 在有无雄激素刺激下,沉默MALAT1对PCa细胞增殖的影响 |
| 2.6 在有无雄激素刺激下,沉默MALAT1对PCa细胞周期的影响 |
| 2.7 在有无雄激素刺激下,沉默MALAT1对PCa细胞周期进程中相关蛋白的影响 |
| 讨论 |
| 第3章 MALAT1在前列腺癌中作用的机制研究 |
| 前言 |
| 第一节 MALAT1的沉默通过竞争性结合miR-1-3p抑制前列腺癌细胞迁移侵袭和上皮间质转化 |
| 1、材料与方法 |
| 1.1 细胞选择 |
| 1.2 实验材料和仪器 |
| 1.3 细胞处理 |
| 1.4 质粒的构建 |
| 1.5 RNA提取和实时定量PCR |
| 1.6 双荧光素酶报告基因实验 |
| 1.6.1 细胞接种和培养 |
| 1.6.2 细胞转染1 |
| 1.6.3 细胞转染2 |
| 1.6.4 荧光素酶活性的检测 |
| 1.7 划痕实验检测细胞迁移能力 |
| 1.8 Transwell小室实验检测细胞侵袭能力 |
| 1.9 western blot检测上皮间质转化的相关蛋白 |
| 1.10 统计学方法 |
| 2、实验结果 |
| 2.1 MALAT1/miR-1-3p/CORO1C信号轴假说的建立 |
| 2.2 miR-1-3p在 PCa细胞中表达情况 |
| 2.3 沉默MALAT1 后,PCa细胞中miR-1-3p、CORO1C的表达水平 |
| 2.4 双荧光素酶报告基因验证MALAT1/miR-1-3p/CORO1C信号轴 |
| 2.5 miR-1-3p在 PCa细胞中对MALAT1和CORO1C表达的影响 |
| 2.6 挽救性实验验证MALAT1/miR-1-3p/CORO1C信号轴 |
| 2.7 沉默MALAT1的PCa细胞中抑制miR-1-3p对细胞表型的影响 |
| 2.8 沉默MALAT1的PCa细胞中过表达CORO1C对细胞表型的影响 |
| 第二节 沉默MALAT1抑制雄激素受体信号传导阻止前列腺癌细胞的增殖和细胞周期进程 |
| 1、材料和方法 |
| 1.1 实验材料和仪器 |
| 1.2 细胞的处理 |
| 1.3 质粒的构建 |
| 1.4 RNA提取和实时定量PCR |
| 1.5 双荧光素酶报告实验 |
| 1.6 CCK8实验检测细胞增殖能力 |
| 1.7 流式细胞仪检测细胞有丝分裂 |
| 1.8 western blot检测细胞周期相关蛋白 |
| 1.9 统计学方法 |
| 2、实验结果 |
| 2.1 DHT刺激PCa细胞对MALAT1表达的影响 |
| 2.2 雄激素刺激PCa细胞对AR表达的影响 |
| 2.3 沉默MALAT1对AR表达的影响 |
| 2.4 MALAT1与AR mRNA共享的miRNA |
| 2.5 雄激素刺激或沉默MALAT1对PCa细胞中miR-320b表达的影响 |
| 2.6 miR-320b对 AR的影响 |
| 2.7 沉默MALAT1的PCa细胞中抑制miR-320b对细胞表型的影响 |
| 2.8 沉默MALAT1的PCa细胞中过表达AR对细胞表型的影响 |
| 讨论 |
| 第4章 MALAT1对裸鼠体内前列腺癌移植瘤生长的影响 |
| 前言 |
| 1、材料和方法 |
| 1.1 动物来源 |
| 1.2 实验材料和仪器 |
| 1.3 动物模型 |
| 1.4 免疫组化 |
| 1.4.1 包埋切片 |
| 1.4.2 切片脱蜡至水 |
| 1.4.3 抗原修复 |
| 1.4.4 过氧化氢孵育 |
| 1.4.5 山羊血清封闭 |
| 1.4.6 一抗孵育 |
| 1.4.7 二抗孵育 |
| 1.4.8 辣根酶标记 |
| 1.4.9 DAB显色 |
| 1.4.10 苏木素复染 |
| 1.4.11 脱水、透明、封片 |
| 1.4.12 镜检 |
| 1.5 免疫荧光 |
| 1.5.1包埋切片同1.4.1 |
| 1.5.2 免疫荧光双染 |
| 1.5.3 镜检 |
| 2、实验结果 |
| 2.1 沉默MALAT1 对体内PCa细胞形成肿瘤的影响 |
| 2.2 沉默MALAT1 对肿瘤组织内的PSA及 AR的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取的的科研成果 |
| 致谢 |
（4）硫氧还蛋白还原酶1对帕金森病保护效应的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 PD的临床症状 |
| 1.2 PD的患病机制 |
| 1.3 PD的模型 |
| 1.4 PD的治疗 |
| 1.5 PD伴随症状 |
| 1.6 硫氧还蛋白系统 |
| 1.7 TR1与PD关系 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器与设备 |
| 2.3 试剂配制 |
| 2.4 方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 基因型鉴定 |
| 3.2 转录组测序质控和结果 |
| 3.3 转录组结果分析(A53T组与WT组比较) |
| 3.4 PD 小鼠模型和细胞模型中 TR1 表达的下调和氧化应激的增加 |
| 3.5 体内外PD模型中TR1 成功过表达 |
| 3.6 转录组结果分析(A53T组与A53T-TR1 组比较) |
| 3.7 过表达TR1 对PD模型氧化损伤、内质网应激、线粒体自噬和膜电位影响 |
| 3.8 过表达TR1 对多巴胺能神经元的保护作用 |
| 3.9 过表达TR1 对PD动物模型的行为学保护效应 |
| 3.10 过表达TR1对PD模型DNA损伤的保护效应 |
| 3.11 过表达TR1 对PD模型老化的影响 |
| 3.12 过表达TR1 通过GSK-3β、NF-κB和 AKT信号通路对PD的保护效应 |
| 3.13 过表达TR1对A53T小鼠和N2a细胞在MPP~+的作用下导致的炎症因子变化的保护效应 |
| 3.14 过表达TR1 对A53T小鼠免疫反应的保护效应 |
| 3.15 过表达TR1对A53T小鼠和N2a细胞在MPP~+的作用下ATP变化的保护效应 |
| 3.16 过表达TR1 对A53T小鼠导致L-钙通道变化的保护效应 |
| 3.17 过表达TR1 对A53T小鼠己糖激酶变化的保护效应 |
| 3.18 转录组分析:PD的动物模型与过表达TR1 比较,UBCH7/8 基因表达增加 |
| 3.19 转录组分析:PD小鼠模型与A53T-TR1 模型比较NADPH表达量下降 |
| 3.20 转录组分析:PD的动物模型与过表达TR1 比较,PLA基因表达降低. |
| 3.21 N2a细胞过表达TR1 后,蛋白PRM试验部分结果 |
| 3.22 PD的体内外模型中,过表达TR1 前后作用的网络图 |
| 第四章 讨论与结论 |
| 4.1 过表达TR1对PD模型氧化损伤的影响 |
| 4.2 过表达TR1对PD模型DNA损伤的影响 |
| 4.3 过表达TR1 对PD模型行为变化的影响 |
| 4.4 过表达TR1 对PD模型老化的影响 |
| 4.5 过表达TR1 对PD模型凋亡的影响 |
| 4.6 过表达TR1 对PD模型炎症和补体相关因子影响 |
| 4.7 过表达TR1对PD模型ATP合成和NADPH的影响 |
| 4.8 过表达TR1 对PD模型糖代谢的影响 |
| 4.9 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）FOXD3与SCF-β-TRCP1对肺癌与结肠癌骨转移等恶性生物学行为影响和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 FOXD3 蛋白对肺癌骨转移等恶性生物学行为影响及机制研究 |
| 前言 |
| 第一章:FOXD3在肺癌骨转移细胞及肿瘤干细胞中表达状况研究 |
| 一、材料与试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二章:FOXD3对肺癌相关恶性生物学行为的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第三章:FOXD3调控肺癌干细胞的机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第一部分 小结 |
| 第二部分 乙酰化依赖的 SCF-β-TRCP1 功能调节与其对结直肠癌恶性生物学行为影响的相关机制研究 |
| 前言 |
| 第一章:乙酰化修饰系统参与β-TRCP1功能调节相关研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二章 β-TRCP1乙酰化修饰对结直肠癌恶性生物学功能影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三章 β-TRCP1 对去乙酰化酶SIRT1 反馈调节机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 小结 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述一 FOX 蛋白家族在恶性肿瘤调控中的作用 |
| 综述二 SKP1-cullin-1-F-box-protein(SCF)E3 泛素连接酶复合体中 F-box 蛋白在肿瘤发生过程中作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（6）AD少突胶质细胞改变及抗精神病药物对其作用的研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 APP/PS1 转基因AD小鼠海马内少突胶质细胞的改变 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 AD少突胶质细胞改变的体外研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 抗精神病药物对AD少突胶质细胞作用的初步探讨 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
（7）外周血肿瘤相关抗原自身抗体与肝癌发病的关系研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肝癌概述 |
| 1.1.1 肝癌的流行病学 |
| 1.1.2 肝癌的病因 |
| 1.1.3 肝癌的病理类型 |
| 1.1.4 肝癌的诊断与分期 |
| 1.1.5 肝癌的治疗 |
| 1.1.6 早期肝癌的筛查方法 |
| 1.2 肿瘤免疫 |
| 1.2.1 抗肿瘤免疫监视 |
| 1.2.2 肿瘤免疫耐受 |
| 1.2.3 肿瘤免疫逃逸 |
| 1.3 自身抗体 |
| 1.3.1 自身抗体的概述 |
| 1.3.2 自身抗体产生的机制 |
| 1.3.3 自身抗体与自身免疫性疾病 |
| 1.3.4 肿瘤相关抗体 |
| 1.3.5 抗体的检测技术 |
| 1.4 肿瘤相关抗原 |
| 1.4.1 CD25 |
| 1.4.2 OCT4 |
| 1.4.3 p16 |
| 1.4.4 BIRC5 |
| 1.4.5 Myc |
| 1.4.6 ANXA-1 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 实验样本 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验设备及型号 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 抗原的选择、设计与合成 |
| 2.2.2 实验相关试剂和溶液体系的配制 |
| 2.2.3 实验原理 |
| 2.2.4 实验流程 |
| 2.2.5 质量控制 |
| 2.3 数据分析 |
| 2.3.1 特异性结合指数 |
| 2.3.2 正态性检验及组间比较 |
| 2.3.3 ROC曲线分析 |
| 2.3.4 相关性分析 |
| 2.3.5 Kaplan-Meier生存曲线 |
| 2.3.6 Cox比例风险回归模型 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 抗原的设计 |
| 3.2 肝癌组和健康对照组的基本信息 |
| 3.3 肝癌组的随访信息 |
| 3.4 自身抗体的检测结果 |
| 3.4.1 CD25 抗体检测结果 |
| 3.4.2 OCT4 抗体检测结果 |
| 3.4.3 p16 抗体检测结果 |
| 3.4.4 BIRC5 抗体检测结果 |
| 3.4.5 c-myc抗体检测结果 |
| 3.4.6 ANXA-1 抗体检测结果 |
| 3.4.7 肝癌患者的预后多因素Cox回归分析 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 抗原多肽设计的创新点 |
| 4.1.1 抗原多肽设计与检测体系优化 |
| 4.1.2 多条同源抗原多肽的设计 |
| 4.2 肝癌患者外周血中各抗体水平变化的意义 |
| 4.2.1 CD25 IgG水平变化的意义 |
| 4.2.2 OCT4 IgG水平变化的意义 |
| 4.2.3 p16 IgG水平变化的意义 |
| 4.2.4 BIRC5 IgG水平变化的意义 |
| 4.2.5 c-myc IgG水平变化的意义 |
| 4.2.6 ANXA-1 IgG水平变化的意义 |
| 4.3 研究的局限性 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）细胞周期蛋白依赖激酶7抑制剂的抗胆管癌作用机制和联合用药研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 参考文献 |
| 第二章 CDK7抑制剂的抗胆管癌作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 THZ1抗胆管癌作用的分子机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 CDK7 抑制和ABT-263 协同抗胆管癌作用的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
| 附录 |
（9）δ-生育三烯酚抗炎抗癌的生理功能及其分子机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写注解 |
| 1 引言 |
| 1.1 米糠油成分 |
| 1.2 米糠油的提取与纯化 |
| 1.2.1 直接压榨法 |
| 1.2.2 溶剂提取法 |
| 1.2.3 水酶辅助提取法 |
| 1.2.4 微波辅助提取法 |
| 1.2.5 超声波辅助提取法 |
| 1.2.6 CO_2超临界提取法 |
| 1.2.7 亚临界丙烷辅助提取法 |
| 1.2.8 其他提取方法 |
| 1.3 米糠油的生理活性功能 |
| 1.3.1 米糠中的γ-谷维素的生理功能 |
| 1.3.2 米糠油中普利醇(高级烷醇)的生理功能 |
| 1.3.3 米糠油中维生素E的生理功能 |
| 1.4 δ-生育三烯酚的生理功能 |
| 1.4.1 δ-生育三烯酚的降血脂的功能 |
| 1.4.2 δ-生育三烯酚的抗癌作用 |
| 1.4.3 δ-生育三烯酚的抗炎功能 |
| 1.4.4 δ-生育三烯酚缓解心脏病和动脉硬化的作用 |
| 1.4.5 δ-生育三烯酚对骨质增生的作用 |
| 1.4.6 δ-生育三烯酚对神经性退行疾病的影响 |
| 1.4.7 小结 |
| 2 δ-生育三烯酚的提取与检测 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验器材 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 米糠油中的维生素E成分 |
| 2.3.2 米糠油的纯化和富集 |
| 2.4 讨论 |
| 3 δ-生育三烯酚抗炎作用及其分子机理研究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验器材及用品 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 δ-生育三烯酚对巨噬细胞的毒性 |
| 3.3.2 δ-生育三烯酚对巨噬细胞炎症因子mRNA表达的影响 |
| 3.3.3 δ-生育三烯酚对巨噬细胞炎症因子蛋白表达水平的影响 |
| 3.3.4 δ-生育三烯酚对巨噬细胞NF-κB和 AP-1 核移位的影响 |
| 3.3.5 δ-生育三烯酚对巨噬细胞AP-1/NF-κB转录活性的影响 |
| 3.3.6 δ-生育三烯酚对巨噬细胞MAPK磷酸化的影响 |
| 3.3.7 δ-生育三烯酚对LPS诱导的巨噬细胞PPARs活化的影响 |
| 3.3.8 阻断MAPK通路对巨噬细胞PPAR活性的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 4 δ-生育三烯酚抑制鼻咽癌细胞CNE1的增殖 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验器材 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.0 MTS筛选δ-生育三烯酚处理最敏感的癌细胞类型 |
| 4.3.1 MTS分析δ-生育三烯酚对鼻咽癌细胞增殖的影响 |
| 4.3.2 δ-生育三烯酚对鼻咽癌细胞CNE1细胞周期的影响 |
| 4.3.3 δ-生育三烯酚对CNE1细胞CDKI mRNA表达水平的影响 |
| 4.3.4 δ-生育三烯酚对CNE1细胞Cyclin表达和CDK活性的影响 |
| 4.3.5 δ-生育三烯酚对CNE1细胞AP-1和NF-κB转录活性的影响 |
| 4.3.6 δ-生育三烯酚对CNE1细胞MAPK通路的影响 |
| 4.3.7 基因芯片系统检测δ-生育三烯酚调控的靶基因 |
| 4.3.8 基因芯片数据的IPA分析 |
| 4.4 讨论 |
| 5 δ-生育三烯酚对CNE1细胞凋亡的作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 实验器材 |
| 5.2.3 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 δ-生育三烯酚诱导鼻咽癌细胞CNE1凋亡 |
| 5.3.2 δ-生育三烯酚促使鼻咽癌细胞Caspase活化 |
| 5.3.3 δ-生育三烯酚影响鼻咽癌细胞Bax和 Bcl-2 的表达 |
| 5.4 讨论 |
| 6 结论与创新点 |
| 6.1 主要研究结论 |
| 6.2 论文创新性 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间科研成果 |
（10）CDK4/6抑制剂在非小细胞肺癌细胞系的抗肿瘤作用研究及逆转三代EGFR-TKI耐药的机制探索（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、CDK4/6 抑制剂哌柏西利在不同非小细胞肺癌细胞系中抗肿瘤作用的研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.3 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 H1975S、H1299 细胞系 IC50 的检测 |
| 1.2.2 Calu-1 细胞系 CDK4/6 抑制剂哌柏西利 IC50 |
| 1.2.3 H460 和 A549 对 CDK4/6 抑制剂哌柏西利的 IC50 |
| 1.2.4 H1299 细胞系 LKB1 敲降验证 |
| 1.2.5 H1299sh LKB1 细胞系 CDK4/6 抑制剂哌柏西利的 IC50 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 KRAS 突变和 CDK4/6 抑制剂疗效关系 |
| 1.3.2 LKB1 和 CDK4/6 抑制剂相互关系 |
| 1.3.3 KRAS 突变合并 LKB1 突变与 CDK4/6 抑制剂相互关系 |
| 1.4 小结 |
| 二、CDK4/6 抑制剂哌柏西利逆转三代 EGFR TKI 奥希替尼耐药相关机制的探索 |
| 2.1 实验对象和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1、耐药细胞系 H1975OR 增加对 CDK4/6 抑制剂派伯西利的敏感性 |
| 2.2.2、CDK4/6 抑制剂哌柏西利联合三代 TKI 奥希替尼能部分逆转耐药 |
| 2.2.3、药物应用对 H1975 S 和 H1975OR 细胞周期影响存在差异 |
| 2.2.4、H1975S 和 H1975OR 细胞周期相关分子 m RNA 存在差异 |
| 2.2.5、细胞周期相关蛋白过度活化、视网膜母细胞瘤蛋白过度磷酸化参与H1975S 细胞系奥希替尼耐药的产生 |
| 2.2.6、奥希替尼联合 CDK4/6 抑制剂哌柏西利降低 p-RB,增加细胞阻滞在 G1 期 |
| 2.2.7、CDK4/6 抑制剂可能通过下调 Snail 逆转耐药 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 奥希替尼联合哌柏西利提高对H1975的生长抑制 |
| 2.3.2 CDK4/6抑制剂调控RB磷酸化逆转耐药 |
| 2.3.3 CDK4/6抑制剂通过调控Snail来逆转耐药 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 CDK4/6抑制剂在非小细胞肺癌治疗中研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、细胞周期素依赖激酶抑制因子p16表达与神经母细胞瘤发生发展的相关性研究（论文参考文献）
- [1]Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制[D]. 张波. 吉林大学, 2021(01)
- [2]阳离子PCL-b-P（GMA-EA）载体递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的研究[D]. 徐阳. 吉林大学, 2020(03)
- [3]长链非编码RNA MALAT1在前列腺癌中的功能和作用机制[D]. 戴小凡. 吉林大学, 2020(03)
- [4]硫氧还蛋白还原酶1对帕金森病保护效应的研究[D]. 刘自华. 兰州大学, 2020(09)
- [5]FOXD3与SCF-β-TRCP1对肺癌与结肠癌骨转移等恶性生物学行为影响和机制研究[D]. 李佳林. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [6]AD少突胶质细胞改变及抗精神病药物对其作用的研究[D]. 吴燕莉. 重庆医科大学, 2020(12)
- [7]外周血肿瘤相关抗原自身抗体与肝癌发病的关系研究[D]. 徐阳春. 吉林大学, 2020(08)
- [8]细胞周期蛋白依赖激酶7抑制剂的抗胆管癌作用机制和联合用药研究[D]. 黄天璐. 南京大学, 2020(04)
- [9]δ-生育三烯酚抗炎抗癌的生理功能及其分子机理研究[D]. 沈珺珺. 中南林业科技大学, 2020(05)
- [10]CDK4/6抑制剂在非小细胞肺癌细胞系的抗肿瘤作用研究及逆转三代EGFR-TKI耐药的机制探索[D]. 秦琼. 天津医科大学, 2020(06)