利用CRISPR/Cas9全基因组文库筛选HCT 116细胞增殖和辐射相关基因

论文摘要

目的:基因编辑技术的不断发展为基因功能和基因治疗等研究提供了强大的技术支持。CRISPR/Cas9作为新兴的基因编辑技术,具有更高效的编辑能力。2013年张锋课题组首次使用CRISPR/Cas9技术在哺乳动物细胞中进行基因改造,利用sgRNA文库实现对多个基因的敲除,极大的提高了基因编辑效率,同时降低了脱靶效应。目前大规模CRISPR/Cas9文库筛选被应用到多个领域,可进行筛选药靶基因、耐药基因及肿瘤增殖基因等。本研究一方面通过在HCT 116细胞内大规模感染GeCKO慢病毒文库,在全基因组范围筛选与HCT 116细胞增殖相关的基因。另一方面,通过在HCT 116细胞内大规模感染GeCKO慢病毒文库后,对细胞进行辐射损伤处理,以筛选出与细胞抗辐射相关的基因。方法:HCT 116细胞增殖相关基因筛选:1)将HCT 116细胞培养至约3 108个,使用GeCKO慢病毒文库进行大规模感染;感染1天后,更换为含有2 g/l嘌呤霉素的完全培养基继续培养6天,收取部分细胞作为6天样品组,剩余细胞继续培养至16天,并收取细胞。2)提取各组样品基因组DNA,采用巢式PCR法扩增sgRNA,连接T载体,琼脂糖凝胶电泳检测基因组插入sgRNA序列。3)将各样品基因组DNA使用Illumina测序平台进行高通量测序,并进行数据分析,使用MAGeCK软件分析筛选得到的与细胞增殖相关的基因。HCT 116细胞辐射相关基因筛选:1)将HCT 116细胞培养至约3 108个,使用GeCKO慢病毒文库进行大规模感染;感染1天后,更换为含有2 g/l嘌呤霉素的完全培养基继续培养6天,收取部分细胞作为6天样品组,剩余细胞分为两组即NC组和辐射组（IR组）,对辐射组细胞使用钴60（Co）进行辐射处理,辐射剂量为6Gy,对NC组不作处理。2)继续培养细胞至13天,分别收取两组样品部分细胞,剩余细胞继续传代培养至20天,收取细胞。3)提取各组样品基因组DNA,将各样品基因组DNA使用Illumina测序平台进行高通量测序,并进行数据分析,使用MAGeCK软件分析筛选得到的与细胞抗辐射相关的基因。结果:1)在筛选与细胞增殖相关基因的实验中共获得has-mir-8086、FOXD4L4、ACTR1B等3299个阳性筛选基因,及POC1B-GALNT4、PLGLB2、has-mir-2054等2919个阴性筛选基因;从具有统计学显著性的阴性筛选的基因中选取评分阈值大于0.5（log2>0.5）的472个基因使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8（https://david.ncifcrf.gov）进行GO富集分析（Gene Ontology Analysis）发现这些基因主要富集在RNA代谢和翻译等基本生物过程,表明其对细胞增殖是必需的。同时对阳性筛选的基因中评分阈值大于0.5（log2>0.5）的387个基因进行GO富集分析发现主要富集在补体触发、炎症反应调节、自然杀伤细胞趋化性等途径,这些基因有利于细胞增殖;2)成功对阳性筛选和阴性筛选得到的排名前十的miRNA进行了靶基因预测。3)在筛选与细胞辐射抗性相关基因的实验中筛选得到了与辐射相关的PHYKPL、HAUS1、FGD3等4680个阳性筛选基因,及ZIM2、PCDHGB7、PLN等1511个阴性筛选基因。这些基因涉及多个信号通路。结论:1)成功运用CRISPR/Cas9技术对HCT116细胞进行全基因组文库敲除;2)筛选得到与细胞增殖及抗辐射相关的基因,为细胞增殖及抗辐射研究提供了新的方向和思路。

论文目录

• 中文摘要
• abstract
• 第一章 利用CRISPR/Cas9 全基因组文库筛选HCT116 细胞增殖相关基因
•   1 前言
•   2 材料与方法
•     2.1 实验材料
•       2.1.1 细胞系
•       2.1.2 主要试剂与材料
•       2.1.3 主要仪器
•       2.1.4 主要溶液的配制
•     2.2 实验方法
•       2.2.1 细胞培养
•       2.2.2 GeCKO文库大规模感染细胞
•       2.2.3 细胞基因组DNA提取
•       2.2.4 巢式PCR扩增sgRNA序列
•       2.2.5 琼脂糖凝胶电泳
•       2.2.6 琼脂糖凝胶DNA回收
•       2.2.7 T载体连接
•       2.2.8 Illumina测序平台高通量测序与生物信息学分析
•       2.2.9 miRNA靶基因预测
•   3 结果
•     3.1 基因组插入sg RNA序列验证
•     3.2 基因组插入sg RNA大规模测序及分析
•     3.3 增殖相关阴性筛选基因GO富集分析
•     3.4 增殖相关阳性筛选基因GO富集分析
•     3.5 增殖相关mi RNA靶基因网络分析
•   4 讨论
•   5 小结
• 第二章 利用CRISPR/Cas9 全基因组文库筛选HCT116 细胞辐射相关基因
•   1 前言
•   2.材料与方法
•     2.1 实验材料
•       2.1.1 细胞系
•       2.1.2 主要试剂与材料
•       2.1.3 主要仪器
•     2.2 实验方法
•       2.2.1 细胞培养
•       2.2.2 GeCKO文库大规模感染细胞
•       2.2.3 细胞辐射处理
•       2.2.4 细胞基因组DNA提取
•       2.2.5 Illumina测序平台高通量测序
•       2.2.6 生物信息学分析
•       2.2.7 细胞内干涉RPL12、MESP1 基因
•       2.2.8 qPCR检测基因表达水平
•       2.2.9 CCK8 法检测细胞增殖
•   3 结果
•     3.1 测序数据产出与质量统计
•     3.2 数据比对与Screen Read count分析
•     3.3 gRNA和基因计数
•     3.4 丢失gRNA与丢失基因数目统计
•     3.5 样本聚类分析
•     3.6 MAGeCK软件beta score算法筛选与辐射相关的基因
•     3.7 辐射相关阴性筛选基因GO富集分析
•     3.8 辐射相关阳性筛选基因GO富集分析
•     3.9 辐射相关mi RNA靶基因网络分析
•     3.10 辐射相关基因RPL12、MESP1 的初步功能验证
•   4 讨论
•   5 小结
• 总结
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 致谢
• 综述
•   参考文献

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 潘冰心

导师: 郑晓飞

关键词: 全基因组文库,细胞增殖,辐射损伤

来源: 安徽医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 安徽医科大学

分类号: Q78

总页数: 79

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