导读:本文包含了转导肽论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:蛋白,细胞,转染,淋巴细胞,纳米,载体,树突。
转导肽论文文献综述
唐朝颖,韩维举,邓雄威,王方园,袁硕龙[1]（2016）在《CMC-TAT蛋白转导肽纳米载体体外转染效果评估》一文中研究指出目的构建羧甲基壳聚糖-TAT蛋白转导肽纳米载体(CTNs),探究CTNs介导miR96转染293细胞和耳蜗基底膜的效率及安全性,为mi R96在内耳的功能研究奠定基础。方法应用羧甲基化的壳聚糖(CMC)与TAT蛋白转导肽合成CTNs,携带标记花青染料荧光(cy3)的mi R96模拟物(mi R96 mimics),转染293细胞和耳蜗基底膜,利用激光共聚焦荧光显微镜对293细胞和耳蜗基底膜铺片进行荧光阳性细胞计数,以阳离子脂质体作为对照,评价转染效率,采用MTT试验评价CTNs的安全性。结果成功制备了CTNs,纳米颗粒平均直径约186.6nm,粒径分布集中,无明显聚集现象;CTNs-mi R96-cy3转染293细胞的平均阳性细胞率为32.6%,转染耳蜗基底膜毛细胞的平均阳性细胞率为24.4%,均低于阳离子脂质体-mi R96-cy3;MTT试验示CTNs细胞毒性低于阳离子脂质体。结论 CTNs作为一种新型的纳米载体,可携带miR96成功转染耳蜗基底膜,提示了纳米载体作为miRNA载体的可行性,并且安全性较高,但转染效率不足。(本文来源于《中华耳科学杂志》期刊2016年06期）
唐朝颖[2]（2016）在《基于羧甲基壳聚糖-TAT蛋白转导肽纳米载体的miR96内耳递送初步研究》一文中研究指出背景感音神经性耳聋是由于耳蜗毛细胞、听神经或听觉中枢病变,对声音的感受或神经冲动的传导发生障碍引起的听力下降。大部分感音神经性耳聋是由耳蜗感觉神经上皮毛细胞的结构或功能异常引起的,而哺乳动物损伤的毛细胞不可自主再生。最根本的治疗方法是通过干预促进异常毛细胞修复或死亡毛细胞再生。随着基因技术的发展,研究者发现约30424个成熟miRNA参与几乎所有细胞的增殖、分化、生长发育过程,多种miRNA在小鼠耳蜗中高表达，其中miRNA 183家族被证实与耳蜗毛细胞的分化、发育及人类听力损失密切相关。RNA干扰主要是通过miRNA实现特定基因沉默。选择合适的载体将1miRNA递送至内耳是实现RNA干扰的关键。病毒载体和非病毒载体是目前常用的miRNA载体,病毒载体有诱发免疫反应、潜在致癌等风险,使其在体应用中受限。近年来,非病毒载体逐渐成为研究热点,其中,纳米载体以其无免疫原性、可生物降解性及生物相容性等优势,成为较理想的miRNA载体。阳离子脂质体(Lipo)由于其高转染率是目前最常用的非病毒性miRNA载体,但由于其自身带有正电荷,细胞毒性较大,并且无靶向性和缓释特性,因此无法实现应用于临床。羧甲基壳聚糖-TAT蛋白转导肽纳米裁体(CTNs),是由羧甲基化的壳聚糖与TAT蛋白转导肽通过自组装方式合成的纳米颗粒。羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl chitosan,CMC)有良好的生物相容性及几乎无毒性,产物无毒、可被生物体吸收,且可溶于水,是一种具有PH感应性的两性聚合材料。TAT蛋白转导肽是人类免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus-1,HIV-1)编码的带正电荷多肤,可以通过共价结合或静电作用高效稳定的结合核酸,其短肽有破膜作用,能够转导不同的外源生物大分子通过生物膜和生理屏障,达到高转染率。CTNs不但有高效转染的特性,而且在酸性环境中,表面负电荷转变为正电荷,提高内含体逃逸能力,达到高效转染、靶向缓释的目的。目前脂质体是内耳递送miRNA最常用的非病毒载体,尽管CTNs已成功用于miRNA转染肿瘤细胞,并能够实现相应的功能调控,但其用于内耳递送1miRNA研究未见报道。目的构建用于内耳递送miRNA的非病毒纳米载体,以阳离子脂质体作为对照,初步探究羧甲基壳聚糖-TAT蛋白转导肽纳米载体(CTNs)介导miR96转染293细胞和耳蜗基底膜的效率及安全性,为miR96在内耳的功能研究奠定基础。方法1.通过Lipo与cy3标记的miR96混合制得Lipo-miR96-cy3复合物,设浓度为30nM,50nM,100nM的Lipo-miR96-cy3复合物转染293细胞和耳蜗基底膜,并设空白和miRNA96-cy3为对照组,激光共聚焦显微镜下观察cy3红色荧光分布情况、细胞特异性。2.CMC和TAT蛋白转导肽按1.5mg/1mg(1.5:1)质量比制备获得的CTNs,包封miR96-cy3制备羧甲基壳聚糖-TAT蛋白转导肽-miR96-cy3 (M-CTNs)复合物。3.用150nM Lipo-miR96-cy3复合物和M-CTNs复合物分别转染293细胞和耳蜗基底膜8小时,并设空白对照组,以Lipo-miR96-cy3复合物转染效率为对照评估M-CTNs复合物的转染效果及细胞特异性,MTT测定比较两种载体的细胞毒性。结果1.Lipo-miRNA96-cy3复合物与293细胞共同作用8小时后,被成功摄取,并且随Lipo-miRNA96-cy3复合物转染浓度的增大,cy3红色荧光阳性细胞数增多,50nM组荧光阳性细胞数明显高于30nM组(t=-10.801, P=0.000), 100nM组荧光阳性细胞数明显高于50nM组(t=11.754,P=0.000),并且单个细胞内荧光强度增强,对照组未见荧光。Lipo-miRNA96-cy3复合物与耳蜗基底膜共同作用8小时后,内外毛细胞、支持细胞、螺旋神经节细胞内均可见红色荧光,并随浓度增大而增强,无明显细胞特异性。2.本部分实验成功制备了CTNs,纳米颗粒平均直径约186.6nm,粒径分布集中,无明显团聚现象。M-CTNs复合物包封率达90%以上,对PH5.5的酸性环境反应灵敏，zeta电位在1小时内由-30.9mV快速升至20mV,具备将负电荷转变为正电荷的质子化特性,为后续研究打下基础。3. Lipo-miR96-cy3复合物和M-CTNs复合物分别转染293细胞和耳蜗基底膜，均表现为Lipo组荧光较M-CTNs组强，但Lipo组荧光呈聚集点状分布,而M-CTNs组荧光呈均匀分布，MTT实验测定M-CTNs组OD值高于Lipo组(t=-4.436,P=0.013)。结论阳离子脂质体(Lipo)介导的miR96的体外转染效率高,但其细胞毒性较大,体内应用受限,羧甲基壳聚糖-TAT蛋白转导肽-miR96-cy3 (M-CTNs)复合物细胞毒性小,内含体逃逸能力高,其介导的miR96的体外转染效率较阳离子脂质体低,使用其进行miR96的体内外转导,仍需进一步优化。(本文来源于《中国人民解放军医学院》期刊2016-05-24）
叶茂,唐伟,常启跃,罗琦,梁思敏[3]（2015）在《胞浆转导肽介导抑癌基因NPRL2对肾癌细胞凋亡及Bax-Caspase3凋亡通路的影响》一文中研究指出目的:证实胞浆转导肽(cytoplasmic transduction peptide,CTP)介导抑癌基因NPRL2以CTP-NPRL2融合蛋白形式对人肾癌细胞株786-O的作用,检测其诱导的肾癌细胞凋亡及其对Bax-Caspase3凋亡通路的影响。方法:构建重组质粒p ET28aCTP-NPRL2和p ET28a-NPRL2并转染大肠杆菌DH5α,从而得到原核表达体系用于CTP-NPRL2融合蛋白及NPRL2蛋白的表达和提取;Western blot验证CTP-NPRL2蛋白和NPRL2蛋白的表达;将肾癌786-O细胞分为2组,分别与等量的NPRL2蛋白和CTP-NPRL2蛋白共培养,采用免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜检测2种蛋白在肾癌细胞786-O的亚细胞定位情况;将在96孔板培养的786-O细胞分为5组,其中4组分别用1.0μmol/L CTP-NPRL2蛋白、2.0μmol/L CTP-NPRL2蛋白、4.0μmol/L CTP-NPRL2蛋白、4.0μmol/L NRPL2蛋白处理,剩余1组为对照组;MTT法检测各组786-O细胞增殖的情况;流式细胞仪分析各组细胞周期和细胞凋亡情况;real-time PCR、Western blot检测各组786-O细胞中Bax和Caspase-3在m RNA及蛋白水平的表达情况。结果:质粒测序结果显示成功构建所需的原核表达载体;Western blot结果显示CTP-NPRL2融合蛋白在原核表达载体中有表达。激光共聚焦显微镜结果提示CTP-NPRL2蛋白导入786-O细胞后定位于胞浆;MTT发现CTP-NPRL2组细胞增殖较NPRL2组及空白对照组受到明显的抑制(P<0.05);流式细胞分析显示,相对于空白对照组和NPRL2组,CTP-NPRL2组的凋亡率显着增高且处于G0/G1期细胞明显增多(P<0.05)。real-time PCR和Western blot结果提示,与空白对照组和NPRL2组比较,CTP-NPRL2组Bax和Caspase-3在m RNA和蛋白质水平的表达均明显上调(P<0.05)。结论:CTP介导抑癌基因NRPL2以CTP-NPRL2融合蛋白形式导入肾癌786-O细胞中并对其有明显的抑制作用,可能通过影响Bax-Caspase3凋亡通路的活性,抑制786-O细胞的增殖,并诱导其凋亡将细胞周期阻滞于G0/G1期,从而发挥抑癌作用。(本文来源于《重庆医科大学学报》期刊2015年08期）
唐余燕,陈小华,卓萌,宋琳琳,汤正好[4]（2014）在《胞质转导肽-HBcAg18-27-Tapasin通过激活PI3K/Akt通路抑制HBV转基因小鼠特异性CTL凋亡》一文中研究指出目的探讨胞质转导肽(CTP)-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白通过激活PI3K/Akt信号通路抑制HBV转基因小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T cell,CTL)凋亡。方法 HBV转基因小鼠随机分组,100μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin、50μg CTPHBcAg18-27-Tapasin、50μg CTP-HBcAg18-27及生理盐水组经肌肉免疫小鼠,每周一次,共3次。流式细胞仪检测脾细胞中胞内细胞因子水平及细胞凋亡率,Western blotting检测凋亡相关蛋白PI3K、P-Akt及P-mTOR表达的变化。结果 100μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白免疫转基因小鼠后,能有效上调特异性CTL数量(2.74±0.20)%,高于对照组50μg CTP-HBcAg-18-27-Tapasin(2.42±0.53)%及50μg CTP-HBcAg18-27(1.70±0.56)%和空白组(0.66±0.71)%(F=741.45,P=0.000);同时,100μg CTPHBcAg18-27-Tapasin融合蛋白有效抑制特异性CTL凋亡(6.29±0.02)%,低于对照组50μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin(7.72±0.15)%及50μg CTP-HBcAg18-27(26.30±1.13)%和空白组(58.26±0.23)%(F=5313,P=0.000),并伴随凋亡相关蛋白PI3K、P-Akt及P-mTOR上调(F=52.61、18.32和94.18,P<0.05)。结论 CTP-HBcAg18-27-Tapasin能有效诱导HBV转基因小鼠特异性CTL的表达,抑制其凋亡,机制与PI3K/Akt通路的激活有关。(本文来源于《胃肠病学和肝病学杂志》期刊2014年04期）
贾文超,甘鹏,熊亮,潘传英,蓝贤勇[5]（2013）在《跨膜转导肽TAT、9R和牛Sox2融合蛋白原核表达载体的构建与表达研究》一文中研究指出【目的】构建pTAT-bSox2-9R融合表达载体,并对其进行原核表达研究,为利用TAT和多聚精氨酸(9R)的跨膜作用实现转录因子蛋白直接重编程牛体细胞提供科学资料。【方法】以GenBank上公布的牛Sox2基因编码区序列为基础,设计并合成含酶切位点、跨膜转导肽TAT和9R的引物;利用PCR扩增方法获得包括Sox2、TAT和9R的重组DNA序列,并将其克隆到空质粒pTAT-HA上,从而构建pTAT-HA-bSox2-9R重组表达载体;将经酶切鉴定和测序验证后的重组表达载体转化大肠杆菌,在不同IPTG浓度和诱导时间等条件下进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。【结果】成功获得bSox2-9R重组序列,成功构建重组质粒pTATbSox2-9R;pTAT-bSox2-9R在0.6mmo/L的IPTG于37℃诱导4h的条件下表达目的蛋白约36ku,经Western blot验证为目的蛋白。【结论】成功获得了pTAT-bSox2-9R融合蛋白,为多聚精氨酸蛋白转导域(PTD)介导的转录因子蛋白直接重编程黄牛体细胞以获得诱导多潜能干细胞的研究积累了原始资料。(本文来源于《西北农林科技大学学报(自然科学版)》期刊2013年11期）
郭庆国,徐影琪,叶翠[6]（2013）在《正反向Penetratin转导肽细胞穿膜效率的初步比较》一文中研究指出目的:实验致力于研究正反向细胞穿膜肽Penetratin携带工具的穿膜效率,为进一步解决大分子药物的临床应用奠定基础。方法:通过质粒构建重组成融合质粒载体pET-28a-EGFP,pET-28a-Penetratin(+)-EGFP和pET-28a-Penetratin(-)-EGFP,分别在BL21(DE3)中进行表达、经过His标签蛋白纯化柱纯化,得到比较纯的融合蛋白,然后用这些蛋白与HeLa细胞共同孵育,进行蛋白质的穿细胞功能检测。结果:His-Penetratin(+)-EGFP和His-Penetratin(-)-EGFP穿细胞膜能力类似,而His-EGFP不具有细胞穿膜功能。结论:经过研究验证正向和反向序列Penetratin穿膜能力类似,并且两种融合蛋白穿膜机制与膜受体无关,属于被动运输的一种,两种融合蛋白对细胞无创伤作用,为开发新药成功建立了技术平台。(本文来源于《沈阳师范大学学报(自然科学版)》期刊2013年03期）
唐余燕,陈小华,汤正好,臧国庆,余永胜[7]（2013）在《胞质转导肽-HBcAg_(18-27)-Tapasin诱导C57BL/6小鼠T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子及HBV特异性CTL的表达》一文中研究指出目的观察融合蛋白胞质转导肽(CTP)-HBcAg18-27-Tapasin诱导C57BL/6小鼠T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子及HBV特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的表达。方法 C57BL/6小鼠随机分为实验组CTP-HBcAg18-27-Tapasin、对照组CTP-HBcAg18-27、HBcAg18-27-Tapasin及空白组(生理盐水)。经肌肉免疫小鼠,ELISA检测T淋巴细胞分泌细胞因子;流式细胞术(FCM)检测T淋巴细胞内的细胞因子;CCK-8法检测T淋巴细胞增殖活性。结果实验组能有效刺激小鼠T细胞分泌Th1型细胞因子;FCM检测实验组融合蛋白诱导的CTL水平明显高于其他组;且实验组T淋巴细胞增殖活性明显高于对照组及空白组。结论 CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白免疫C57BL/6小鼠后,能提高T淋巴细胞增殖活性,能有效刺激T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子及增加CTLs的表达。(本文来源于《细胞与分子免疫学杂志》期刊2013年03期）
唐余燕,余永胜,卓萌,臧国庆,汤正好[8]（2013）在《胞质转导肽-HBcAg_(18-27)-Tapasin体外诱导HBV转基因小鼠髓源性树突状细胞成熟及在T淋巴细胞增殖中的作用》一文中研究指出目的:观察融合蛋白胞质转导肽(cytoplasmic transduction peptide,CTP)-HBcAg18-27-Tapasin体外诱导HBV转基因小鼠髓源性树突状细胞(dendritic cell,DC)成熟和对T淋巴细胞增殖的作用.方法:体外分离、培养HBV转基因小鼠及近交系C57BL/6小鼠髓源性DC,加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素(interleukin,IL)-4培养5d,再加入实验组10μg/mL CTP-HBcAg18-27-Tapasin、对照组10μg/mL CTP-HBcAg18-27、10μg/mL HBcAg18-27-Tapasin及空白组RPMI1640完全培养液.流式细胞术测定DC表面分子CD80、CD83、MHC-1的表达,ELISA法测定DC培养上清液中的IL-12p70的水平,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测T淋巴细胞增殖反应,流式细胞仪检测增殖的T淋巴细胞内的细胞因子.结果:体外成功诱导小鼠髓源性DC;CTP-HBcAg18-27-Tapasin能明显上调DC表面分子CD80、CD83、MHC-1的表达;并且CTP-HBcAg18-27-Tapasin组诱导DC分泌的IL-12p70水平及诱导DC增殖T淋巴细胞增殖能力明显高于对照组及空白组[IL-12p70转基因小鼠(F=205.85,P=0.000);C57BL/6小鼠(F=406.20,P=0.000)];流式细胞仪检测实验组融合蛋白诱导的CTL水平也高于对照组[转基因小鼠(F=155.45,P=0.000);C57BL/6小鼠(F=392.90,P=0.000)],同时HBV转基因小鼠DC表面分子及在T淋巴细胞增殖中的作用要比C57BL/6小鼠低.结论:分子伴侣Tapasin修饰胞内化抗原肽能促进HBV转基因小鼠髓源性DC的分化、成熟,并能增强DC刺激T淋巴细胞增殖能力及诱导CTL的产生.(本文来源于《世界华人消化杂志》期刊2013年02期）
吴永红,石锦平,何国维,任长虹,高艳[9]（2011）在《TAT蛋白转导肽介导的秀丽线虫体内外源蛋白的跨膜转导研究》一文中研究指出TAT蛋白转导肽是HIV-1病毒编码的一段富含碱性氨基酸序列的多肽,能够高效介导多种外源生物大分子通过多种膜性结构,如细胞质膜和血脑屏障等。为探索TAT蛋白转导肽介导的秀丽线虫体内外源蛋白跨膜转导作用,以EGFP为报告基因结合常规分子克隆技术构建了原核表达载体pET28b-EGFP和pET28-TAT-EGFP,继而利用诱导剂IPTG(终浓度1mmol/L)诱导表达了靶蛋白并结合荧光显微观察、SDS-PAGE和Western blot等鉴定技术获得表达靶蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)细胞,最后将其涂布到含有Kana+的LB固体培养基上直接饲喂野生型N2株系线虫,利用荧光显微镜观察绿色荧光信号在线虫体内的分布。结果证明,TAT-EGFP融合蛋白较之于EGFP可高效、可溶性表达,而且通过直接饲喂秀丽线虫表达靶蛋白的大肠杆菌48小时后,TAT-EGFP荧光信号明显分布于线虫肠壁细胞,而EGFP荧光信号则分布在秀丽线虫肠腔,空载体对照组未见任何荧光信号,说明TAT蛋白转导肽能够高效介导外源蛋白在秀丽线虫体内跨膜转导。同时,通过比较空载体对照组与实验组线虫微分干涉图像,未见线虫出现明显的细胞形态变化,说明TAT蛋白转导肽介导的外源蛋白跨膜转导作用是安全的,为在秀丽线虫体内直接研究外源蛋白的功能以及进行蛋白药物的研发提供了重要参考。(本文来源于《中国生物工程杂志》期刊2011年03期）
吴永红,张成岗[10]（2010）在《HIV-1TAT蛋白转导肽的研究进展》一文中研究指出TAT蛋白转导肽是人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type1,HIV-1)编码的一段富含碱性氨基酸、带正电荷的多肽,属于蛋白转导域家族的一员。长期研究发现其全长及11个碱性氨基酸富集区的核心肽段(YGRKKRRQRRR)不仅能够在包括蛋白质、多肽及核酸等多种外源生物大分子的跨膜转导过程中具有重要作用,而且能够携带这些外源生物大分子通过活体细胞的各种生物膜性结构(如细胞膜和血脑屏障等)并发挥生理功能,但其跨膜转导机制仍不明确。新近研究还发现TAT核心肽段在促进外源蛋白高效表达过程中也具有重要作用,能够显着增加外源蛋白高效、可溶性表达的水平,显示了TAT蛋白转导肽的新功能。以TAT蛋白转导肽跨膜转导作用的长期研究背景为基础,分别从TAT蛋白转导肽的结构特点、其跨膜转导作用的影响因素及其作用机制等方面进行了系统综述,进一步结合TAT蛋白转导肽的最新研究进展分别从药物研发、机制探索及新功能的开发等方面展望了后续研究方向与应用价值,不仅为深入阐述TAT蛋白转导肽的跨膜转导作用的功能意义提供了参考依据,而且为TAT蛋白转导肽在微生物工程及蛋白质工程等领域的潜在应用价值提供了重要参考信息。(本文来源于《中国生物工程杂志》期刊2010年10期）
转导肽论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
背景感音神经性耳聋是由于耳蜗毛细胞、听神经或听觉中枢病变,对声音的感受或神经冲动的传导发生障碍引起的听力下降。大部分感音神经性耳聋是由耳蜗感觉神经上皮毛细胞的结构或功能异常引起的,而哺乳动物损伤的毛细胞不可自主再生。最根本的治疗方法是通过干预促进异常毛细胞修复或死亡毛细胞再生。随着基因技术的发展,研究者发现约30424个成熟miRNA参与几乎所有细胞的增殖、分化、生长发育过程,多种miRNA在小鼠耳蜗中高表达，其中miRNA 183家族被证实与耳蜗毛细胞的分化、发育及人类听力损失密切相关。RNA干扰主要是通过miRNA实现特定基因沉默。选择合适的载体将1miRNA递送至内耳是实现RNA干扰的关键。病毒载体和非病毒载体是目前常用的miRNA载体,病毒载体有诱发免疫反应、潜在致癌等风险,使其在体应用中受限。近年来,非病毒载体逐渐成为研究热点,其中,纳米载体以其无免疫原性、可生物降解性及生物相容性等优势,成为较理想的miRNA载体。阳离子脂质体(Lipo)由于其高转染率是目前最常用的非病毒性miRNA载体,但由于其自身带有正电荷,细胞毒性较大,并且无靶向性和缓释特性,因此无法实现应用于临床。羧甲基壳聚糖-TAT蛋白转导肽纳米裁体(CTNs),是由羧甲基化的壳聚糖与TAT蛋白转导肽通过自组装方式合成的纳米颗粒。羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl chitosan,CMC)有良好的生物相容性及几乎无毒性,产物无毒、可被生物体吸收,且可溶于水,是一种具有PH感应性的两性聚合材料。TAT蛋白转导肽是人类免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus-1,HIV-1)编码的带正电荷多肤,可以通过共价结合或静电作用高效稳定的结合核酸,其短肽有破膜作用,能够转导不同的外源生物大分子通过生物膜和生理屏障,达到高转染率。CTNs不但有高效转染的特性,而且在酸性环境中,表面负电荷转变为正电荷,提高内含体逃逸能力,达到高效转染、靶向缓释的目的。目前脂质体是内耳递送miRNA最常用的非病毒载体,尽管CTNs已成功用于miRNA转染肿瘤细胞,并能够实现相应的功能调控,但其用于内耳递送1miRNA研究未见报道。目的构建用于内耳递送miRNA的非病毒纳米载体,以阳离子脂质体作为对照,初步探究羧甲基壳聚糖-TAT蛋白转导肽纳米载体(CTNs)介导miR96转染293细胞和耳蜗基底膜的效率及安全性,为miR96在内耳的功能研究奠定基础。方法1.通过Lipo与cy3标记的miR96混合制得Lipo-miR96-cy3复合物,设浓度为30nM,50nM,100nM的Lipo-miR96-cy3复合物转染293细胞和耳蜗基底膜,并设空白和miRNA96-cy3为对照组,激光共聚焦显微镜下观察cy3红色荧光分布情况、细胞特异性。2.CMC和TAT蛋白转导肽按1.5mg/1mg(1.5:1)质量比制备获得的CTNs,包封miR96-cy3制备羧甲基壳聚糖-TAT蛋白转导肽-miR96-cy3 (M-CTNs)复合物。3.用150nM Lipo-miR96-cy3复合物和M-CTNs复合物分别转染293细胞和耳蜗基底膜8小时,并设空白对照组,以Lipo-miR96-cy3复合物转染效率为对照评估M-CTNs复合物的转染效果及细胞特异性,MTT测定比较两种载体的细胞毒性。结果1.Lipo-miRNA96-cy3复合物与293细胞共同作用8小时后,被成功摄取,并且随Lipo-miRNA96-cy3复合物转染浓度的增大,cy3红色荧光阳性细胞数增多,50nM组荧光阳性细胞数明显高于30nM组(t=-10.801, P=0.000), 100nM组荧光阳性细胞数明显高于50nM组(t=11.754,P=0.000),并且单个细胞内荧光强度增强,对照组未见荧光。Lipo-miRNA96-cy3复合物与耳蜗基底膜共同作用8小时后,内外毛细胞、支持细胞、螺旋神经节细胞内均可见红色荧光,并随浓度增大而增强,无明显细胞特异性。2.本部分实验成功制备了CTNs,纳米颗粒平均直径约186.6nm,粒径分布集中,无明显团聚现象。M-CTNs复合物包封率达90%以上,对PH5.5的酸性环境反应灵敏，zeta电位在1小时内由-30.9mV快速升至20mV,具备将负电荷转变为正电荷的质子化特性,为后续研究打下基础。3. Lipo-miR96-cy3复合物和M-CTNs复合物分别转染293细胞和耳蜗基底膜，均表现为Lipo组荧光较M-CTNs组强，但Lipo组荧光呈聚集点状分布,而M-CTNs组荧光呈均匀分布，MTT实验测定M-CTNs组OD值高于Lipo组(t=-4.436,P=0.013)。结论阳离子脂质体(Lipo)介导的miR96的体外转染效率高,但其细胞毒性较大,体内应用受限,羧甲基壳聚糖-TAT蛋白转导肽-miR96-cy3 (M-CTNs)复合物细胞毒性小,内含体逃逸能力高,其介导的miR96的体外转染效率较阳离子脂质体低,使用其进行miR96的体内外转导,仍需进一步优化。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
转导肽论文参考文献
[1].唐朝颖,韩维举,邓雄威,王方园,袁硕龙.CMC-TAT蛋白转导肽纳米载体体外转染效果评估[J].中华耳科学杂志.2016
[2].唐朝颖.基于羧甲基壳聚糖-TAT蛋白转导肽纳米载体的miR96内耳递送初步研究[D].中国人民解放军医学院.2016
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