（1云南省中医医院检验科云南昆明650021）
（2昆明医科大学第二附属医院检验科云南昆明650021）
【摘要】耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌是临床治疗和医院感染控制中的困难所在，在世界范围广泛流行。大量研究表明CRKP的耐药机制是多因素联合作用的结果。最主要机制有以下几种：产碳青霉烯酶、β内酰胺酶或AmpC酶联合孔膜蛋白缺失或低表达、主动外排机制以及生物被膜形成等多因素联合的耐药机制。而产碳青霉烯酶是最主要的机制。本文针对CRKP的病死率、感染相关因素、耐药机制进行综述，为CRKP耐药机制研究提供相关参考。
【关键词】碳青霉烯酶；耐药机制；克雷伯菌
【中图分类号】R563【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2019）26-0011-03
Advancesinresearchonresistancemechanismofcarbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae
LiuXiaomin1,TaiWenlin2
1DepartmentofClinicalLaboratory,YunnanProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Kunming,Yunnan650021,China
2DepartmentofClinicalLaboratory,NO.2AffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650021,China
【Abstract】Carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniaeisadifficultprobleminclinicaltreatmentandhospitalinfectioncontrol,andiswidelyprevalentthroughouttheworld.NumerousstudieshaveshownthattheresistancemechanismofCRKPistheresultofacombinationofmultiplefactors.Themainmechanismsareasfollows:carbapenemase,betalactamaseorAmpCenzymecombinedwithporemembraneproteindeletionorlowexpression,activeeffluxmechanism,andbiofilmformationandothermulti-factorresistancemechanisms.Carbapenemaseisthemostimportantmechanism.Thisarticlereviewsthemortalityandinfection-relatedfactorsofCRKPandthedevelopmentofdrug-resistantmachines,andprovidesreferenceforthestudyofCRKPresistancemechanism.
【Keywords】Carbapenemase;Drugresistancemechanism;Klebsiella
肺炎克雷伯菌(klebsiellapeneumoniae，Kpn)属于革兰阴性肠杆菌科细菌，广泛存在于自然界和人类上呼吸道，也是常见的条件致病菌，可引起支气管炎、尿道感染、菌血症、腹膜炎、肝脓肿、甚至脑膜炎等严重疾病。碳青霉烯类抗生素是一种结构与青霉素类似的抗生素，抗菌谱广泛、活性最强的非典型β-内酰胺抗生素，被称为对抗革兰阴性细菌的最后一条防线。我国上市的碳青霉烯类抗生素有5个品种：亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、比阿培南和厄他培南。碳青霉烯抗生素耐药的肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)：专指对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌。CRKP分离率逐年增多，根据《2015—2016年CHINET的检测报告》CRKP在肠杆菌科中的检出率增加至15%左右[1]。这种超级细菌通常只对少数抗生素敏感，给临床治疗和医院感染控制带来了极大的困难。感染这种超级细菌的患者死亡率很高，在美国一项关于针对CRKP测序研究中发现，可归责于CRKP感染的死亡率竟高达33%[2]。根据XuL等人的调查，2462名感染CRKP的患者的总死亡率为42.14%，而在世界范围内，北美、南美、欧洲和亚洲的研究报告的死亡率分别为33.24、46.71、50.06和44.82%[3]。根据TianX等人的调查，大多数的CRKP来自下呼吸道和泌尿道感染，并且大多数感染者住院，尤其是ICU患者，大部分合并有其他疾病，导致感染主要风险因素包括：碳青霉烯类和第三代头孢菌素的广泛使用、机械通气、鼻胃导管和中央静脉导管等有创性治疗措施导致。2018年国家医政医管局发布了《碳青霉烯类抗菌药物临床应用专家共识》，规范化了碳青霉烯类抗生素的应用原则，包括：严格控制适应症、规范该抗生素在儿童和特殊人群中的应用、以及加大感控力度、专档管理、主动筛查等措施[2]。如能主动进行筛查携带者和感染者，对提高患者治愈率和降低死亡率有着积极的作用。
1.碳青霉烯抗生素耐药的肺炎克雷伯菌菌CRKP的耐药机制
大量研究表明CRKP的耐药机制是多因素联合作用的结果。最主要有：产碳青霉烯酶、超广谱β-内酰胺酶或AmpC酶联合孔膜蛋白缺失或低表达、主动外排机制、以及生物被膜形成等多因素联合的耐药机制。有研究表明产酶是主要导致耐药的机制，而孔膜蛋白缺失联合超广谱-β内酰胺酶或AMC酶导致的耐药能使碳青霉烯类MIC值降低，在耐药机制中起到了重要的辅助性作用[3]。
1.1超广谱-β内酰胺酶（ESBLs）或AMC酶合并孔膜蛋白缺失或低表达导致的耐药机制
超广谱-β内酰胺酶（ESBLs）是一种能够有效水解β内酰胺类抗生素的酶，作用范围广泛，包括第三代头孢菌素（头孢哌酮、头孢曲松等）和单环酰胺类（氨曲南等）抗生素，但此酶可以被加酶抑制剂（如克拉维酸、他唑巴坦等）所抑制。超广谱-β内酰胺酶（ESBLs）的基因型主要包括TEM、SHV、CTX-M、PER和VEB等类型，世界流行以TEM型和SHV型最常见，我国则以CTX-M-15最常见。AmpC酶是一种头孢菌素酶，不被克拉维酸等酶抑制剂所抑制，只对四代头孢和少量抗生素敏感。按照Ambler分子分类法（按氨基酸和核酸序列分类）AmpC酶属于C类，由AmpC基因编码产生。AmpC酶分为由染色体介导，和由质粒介导两种类型。染色体介导的AmpC酶包括诱导型和结构型两种，诱导型可在有诱导性的β-内酰胺类抗生素（头孢西丁、亚胺培南、头孢孟多等）作用下，导致基因ampc的强表达。两种类型的主要机制都是通过ampc基因实现的，主要有拷贝数增加、转录增加、或获得插入序列中含有强启动子等机制。1988年首次发现由质粒介导的AmpC酶ＭIR-1，至今已有40余种基因型。目前世界范围内最流行的基因型是CMY-２，与CMY-2有关的质粒有IncI1，IncF，IncF-IncI，IncA/C和IncR。我国肺炎克雷伯菌产生的AmpC酶主要基因型是DHA基因型。肺炎克雷伯菌的两个主要孔膜蛋白名叫OmpK35、OmpK36，由各自同名的基因编码，MarkG.Wise等人的研究发现，约83.0%对厄他培南不敏感的分离株中存在ompK35和ompK36的基因突变。在厄他培南的MIC值最高(＞4mg)的菌株中，60.5%的两个孔蛋白基因都发生了突变。与厄他培南敏感对照组相比，发现90.4%的菌株存在一种主要OmpK孔膜蛋白的缺乏或低表达。
1.2碳青霉烯酶
碳青霉烯酶是一种能高效水解碳青霉烯类抗生素的酶，它是肺炎克雷伯菌产生耐碳青霉烯类抗生素最主要、最重要的机制。大部分产酶的菌株仍然对粘菌素、替加环素等少数抗生素敏感，但有些细菌甚至对这些药物具有耐药性。根据Ambler分类的碳氢霉烯酶主要是Ａ类、Ｂ类金属β-内酰酶和Ｄ类碳青霉烯酶。A类碳氢霉烯酶主要包括：KPC、SME、NMC-A、IMI、GES、SFC-l等，其中由质粒编码的KPC酶是最常见的酶，该酶的编码基因可位于质粒、整合子等可移动的基因元件上，可在不同菌种（属）间传播。KPC-1酶是最早被发现的碳青霉烯酶，2001年美国亚特兰大乔治亚州CDC中心YigitH，QueenanAM等人报道了一个新型的β-内酰胺酶，这个基因就是等电点pl6.7的KPC-1。随后各国和地区都相继报道了产KPC酶的肺炎克雷伯菌在本地区的流行情况。QiY等人通过分析来自中国5个省9个城市13所医院的95株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌，发现所有的耐碳青霉烯类抗生素的菌株均产生了KPC-2酶。根据FuP等人的研究也证实了肺炎克雷伯菌ST11是产KPC酶的肺炎克雷伯菌的主要克隆类型。而这种耐药基因能够通过质粒等移动元件在同种甚至不同种属的细菌间传播，可能是导致其蔓延原因。也有研究表明KPC酶仅能使菌株对碳青霉烯类抗菌药物的敏感性下降，多表现为低水平耐药，而高水平耐药常有其他耐药机制共同存在。根据IoannisGaldadas等人对A类碳青霉烯酶KPC-2的结构研究可得知，A类酶具有一个空间结构上高度保守的区域，称为“疏水网络”，正是这些结构保持了该酶的稳定性。并用实验验证了如果能破坏这些空间折叠结构就能使酶的功能丧失，从而使耐药性丧失。随着2014年阿维巴坦在美国上市，相继有头孢他啶-阿维巴坦的耐药菌株报道，此研究的新疗法提供了另一个抗耐药菌新思路。B类碳青霉烯酶是金属酶，因其活性部位结合有金属离子锌Zn，金属离子在酶中起到催化作用。包括IMP、VIM、NDM、GIM、SIM、SPM、AIM等型别，其中以IMP、VIM型为主，其中我国产IMP的肺炎克雷伯菌以IMP-4、IMP-8型为主。以世界范围的流行情况来说，产VIM金属酶的肺炎克雷伯菌以VIM-1、4、5、23基因型为主。近年来新金属酶被不断报道，新的金属酶基因型相继被报道，2018年BrinkacLM等在尼日利亚的一所医院儿科分离到了一株NDM-5。
1.3D类碳氢霉烯霉
OXA酶Ambler分子分类法属于D类β-内酰胺酶，由于其对于苯唑西林、氯唑西林有很强的水解能力，且不被克拉维酸所抑制，因此命名为OXA型酶。至今已报道了91种OXA型酶。其中世界范围以OXA-48最为常见，该酶由blaOXA-48基因编码，是地中海地区分布最广泛的碳青霉烯酶。根据西班牙一项研究表明西班牙CRPK中碳青霉烯酶OXA-48型占91.38%。但根据MarianaCastanheira等人的报道欧洲地区近年来OXA-48及其变异体检出呈增长趋势，从4.3%增加到2014-2016年的12.6%。
1.4外排机制的作用
肺炎克雷伯菌目前发现的主要外排系统是AcrAB-TolC外排泵系统，由周质融合蛋白AcrA、外膜通道蛋白TolC和药物质子转运子AcrB构成。该系统存在于肺炎克雷伯菌内膜上，通过主动外机制排消耗能量将抗菌药物、消毒剂等排出细菌外，导致细菌胞内的药物、消毒剂的浓度减低，无法发挥灭菌作用。研究表明肺炎克雷伯菌对β-内酰胺、大环内酯类、氟喹诺酮类、四环素类和酰胺醇类抗生素耐药与主动外排系统AcrAB-TolC的关系密切，是肺炎克雷伯菌产生多重耐药性的重要原因。肺炎克雷伯菌的AcrABTol外排泵基因主要有oqxA.oqxB.emrD.tehA.mdfA及qacE1-△sull等。根据郑轩的研究，约93%的多重耐药的肺炎克雷伯菌同时携带多种外排泵基因。根据马建新、徐燕等的研究，外排基因中qacE1-△sull和mdfA检出最多，分别达到了95%和85%。
1.5生物被膜形成
生物被膜可以在细菌表面生成，可能协同孔膜蛋白和外排系统对抗生素起到抵抗和减少胞内浓度的作用。生物被膜在肺炎克雷伯菌中检出率非常高，达90%以上，多重耐药菌与非多重耐药菌生物膜形成能力并没有明显差异，但生物膜的形成能够促进外排基因AcrA的表达，使得排外作用的增强。根据俊田学斌、刘海洋等的研究表明：肺炎克雷伯菌生物膜形成能力与luxS基因表达量有关，luxS可能是一个高阶调控基因，可调控很多病原菌的生物膜形成，该基因与外排泵基因ramA、孔膜蛋白基因ompK36和调控基因micF等基因构成错综复杂的关系网，共同影响生物膜的形成。
2.总结和展望
综上所述，CRKP耐药主要机制是产碳青霉烯酶，而高水平的耐药和泛耐药是由于多因素的作用而导致的，这个复杂多变的机制导致了临床治疗非常困难，而很多酶基因的编码基因位于可转移基因元件上，易导致耐药基因在同种或不同菌种间传播，造成严重的院内交叉感染和耐药菌爆发扩散，是医院感染和爆发流行的潜在隐患，不容忽视。如果能提前筛查携带者和感染患者，对ICU等提高有合并症患者治愈率和降低死亡率有着十分积极的作用。
【参考文献】
[1]李耘，吕媛.中国细菌耐药监测研究2015-2016革兰氏阴性菌监测报告[J].中国临床药理学杂志，2017，33(23):2521-2542.
[2]国卫办医函〔2018〕822号，碳青霉烯类抗菌药物临床应用专家共识[S].北京:医政医管局，2018.
[3]戴尔宽，史玮炀.108株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的临床分布与耐药基因研究[J].中国抗生素杂志，2017，42(3):218-224.