猪传染性胃肠炎病毒M蛋白诱导IFN-β表达分子机制及功能域研究

论文摘要

猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）是一种有囊膜的单股正链RNA病毒,可引起猪急性、高度接触性、传染性肠道疾病——猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis,TGE）。自2010年以来,TGE在我国多个省市的暴发,给养猪业造成了巨大的经济损失,制约了我国规模化猪场的健康高速发展。TGEV致病机制的研究有助于对TGE的防控。有研究报道TGEV感染可以诱导I型干扰素（IFN）的产生。IFN及其下游的干扰素刺激因子（ISGs）能够有效的抑制病毒感染和病毒在体内的增殖,是宿主抗病毒感染的重要环节。多数病毒感染是拮抗IFN产生的,而TGEV感染细胞后可以诱导I型IFN的产生,目前对其具体分子机制的相关研究报道较少。本研究使用TGEV HE-1株在IPEC-J2细胞上传代适应,盲传至第八代时,细胞开始出现典型的细胞病变（cytopathic effect,CPE）,经RT-PCR验证TGEV HE-1株可以在IPEC-J2细胞上适应,荧光显微镜下可观察到随着感染病毒滴度的增加,绿色荧光信号逐渐增强。TGEV HE-1株感染IPEC-J2模型可以用来研究TGEV诱导细胞IFN-β产生的分子机制。实时荧光定量RT-PCR和双荧光素酶分析系统检测结果表明TGEV感染IPEC-J2细胞呈时间和剂量依赖性上调IFN-β表达。同时,TGEV感染可激活IRF-3和NF-κB启动子活性,且IRF-3启动子的表达量变化明显高于NF-κB,Western blot和激光共聚焦结果表明TGEV感染可诱导IRF-3磷酸化和核转移,说明TGEV感染上调IFN-β的表达可能主要依赖于IRF-3转录因子调控。通过RT-PCR扩增了TGEV的S、E、M、N基因,并与pCMV-HA-N真核表达载体连接构建重组质粒,通过Western blot验证各结构蛋白在IPEC-J2细胞内均成功表达。双荧光素酶分析系统检测显示S、N、E蛋白虽也能诱导IFN-β少量表达,但M蛋白作为关键蛋白激活作用最显著。TGEV M基因siRNA转染细胞后,IFN-β表达量显著下调,进一步证明TGEV M蛋白可以诱导IFN-β产生。Western blot和激光共聚焦检测表明,M蛋白通过诱导IRF-3的磷酸化和核转移激活IFN-β。通过截短表达TGEV M基因,构建5个重组质粒,双荧光素酶分析确定M蛋白激活IFN-β的关键功能域位于第1-88位氨基酸。综上,本研究证明了TGEV分离株HE-1株可以在IPEC-J2细胞上生长繁殖;TGEV感染IPEC-J2细胞诱导IFN-β产生依赖于IRF-3转录因子调控,且呈时间和剂量依赖性;TGEV M蛋白是诱导IFN-β产生的关键结构蛋白,通过诱导IRF-3的磷酸化和核转移激活IFN-β信号通路,TGEV M蛋白激活IFN-β信号通路的关键功能域位于第188位氨基酸。本研究为阐明TGEV的致病机理奠定基础,为靶向药物的研究及对TGE的有效防控提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 1 前言
•   1.1 猪传染性胃肠炎概述
•   1.2 TGEV病原学
•     1.2.1 TGEV生物学分类及形态学特征
•     1.2.2 TGEV理化性质及体外培养特性
•   1.3 TGEV分子生物学特征
•     1.3.1 TGEV基因组结构
•     1.3.2 TGEV结构蛋白及生物学功能
•   1.4 猪小肠黏膜上皮细胞（IPEC-J2）
•   1.5 天然免疫概述
•     1.5.1 天然免疫简介
•     1.5.2 I型IFN概述
•     1.5.3 IFN-β转录激活机制
•     1.5.4 干扰素调节因子IRF-
•   1.6 研究目的与意义
• 2 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 细胞、病毒、菌种和质粒
•     2.1.2 主要试剂、工具酶和抗体
•     2.1.3 实验试剂的配制
•     2.1.4 实验仪器
•     2.1.5 引物设计
•     2.1.6 siRNA的合成
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 TGEV感染IPEC-J2细胞及RT-PCR检测
•     2.2.2 Real-time RT-PCR检测TGEV在IPEC-J2细胞上盲传病毒的增殖
•     2.2.3 TGEV在IPEC-J2细胞上的病毒滴度和生长曲线测定
•     2.2.4 TGEV间接免疫荧光（IFA）检测
•     2.2.5 TGEV结构蛋白真核重组质粒的构建和鉴定
•     2.2.6 TGEV重组质粒和siRNA的转染
•     2.2.7 IPEC-J2细胞的细胞核和细胞质蛋白提取
•     2.2.8 Western blot检测蛋白表达情况
•     2.2.9 双荧光素酶检测启动子活性
•     2.2.10 激光共聚焦显微镜观察
•     2.2.11 数据统计
• 3 结果
•   3.1 TGEV感染IPEC-J2细胞
•     3.1.1 TGEV在IPEC-J2细胞上增殖的RT-PCR检测
•     3.1.2 TGEV在IPEC-J2细胞上增殖的Real-time RT-PCR检测方法建立
•     3.1.3 TGEV在IPEC-J2细胞上的病毒滴度和生长曲线
•     3.1.4 TGEV感染IPEC-J2细胞的IFA检测
•   3.2 TGEV感染IPEC-J2细胞诱导IFN-β产生的分子机制研究
•     3.2.1 TGEV感染激活IFN-β的转录
•     3.2.2 TGEV感染依赖于IRF-3激活IFN-β信号通路
•     3.2.3 TGEV感染对IRF-3的影响
•   3.3 TGEV M蛋白激活IFN-β产生
•     3.3.1 TGEV各结构蛋白基因真核表达质粒的构建
•     3.3.2 TGEV各结构蛋白基因真核表达质粒的鉴定
•     3.3.3 TGEV激活IFN-β表达的结构蛋白确定
•     3.3.4 TGEV M蛋白激活IFN-β表达的分子机制
•   3.4 TGEV M蛋白激活IFN-β表达功能域的确定
•     3.4.1 TGEV M蛋白截短基因的真核表达质粒构建和鉴定
•     3.4.2 TGEV M蛋白激活IFN-β表达功能域的确定
• 4 讨论
•   4.1 TGEV HE-1 株在IPEC-J2细胞上传代适应
•   4.2 提高TGEV各蛋白在IPEC-J2细胞中表达方法的优化
•   4.3 TGEV感染IPEC-J2细胞诱导IFN-β表达上调的分子机制
•   4.4 TGEV M蛋白激活IFN-β表达的功能域确定
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王洪微

导师: 李广兴

关键词: 猪传染性胃肠炎病毒,蛋白,功能域

来源: 东北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 东北农业大学

分类号: S852.651

总页数: 68

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