植物乳杆菌CCFM8610缓解镉暴露诱导肠道损伤的效果评价及机制探究

论文摘要

镉（Cadmium,Cd）是一种在环境中广泛存在的重金属,近年来工业化进展的不断加速及污水农田灌溉技术的广泛使用,镉污染事件频频发生,严重危害了公共健康。过往研究表明,植物乳杆菌CCFM8610是一株对重金属镉具有良好的吸附能力的乳酸菌,可有效缓解机体内炎症,预防日常镉暴露。但现阶段,关于植物乳杆菌CCFM8610缓解镉暴露的研究主要集中在肝、肾方面。而肠道作为镉吸收的直接器官,植物乳杆菌CCFM8610对肠道镉暴露损伤的恢复效果及机制却并未有靶向研究。因此,本课题通过体内外实验,对植物乳杆菌CCFM8610恢复镉暴露诱导肠道损伤的效果及其机制进行了探究。首先通过构建慢性镉暴露动物模型,探究植物乳杆菌CCFM8610对慢性镉暴露小鼠肠道损伤的恢复能力。结果表明植物乳杆菌CCFM8610能有效降低小鼠脏器内约20%的镉蓄积,同时加快慢性镉暴露小鼠排便速度,缩短镉暴露小鼠排便时间近2小时,增强小鼠结肠肌条张力。检测小鼠肠道中神经递质,并对小鼠结肠c-kit蛋白进行免疫标记后发现,植物乳杆菌CCFM8610显著调节了镉暴露紊乱的肠道神经递质一氧化氮、5羟色胺、P物质、乙酰胆碱酯酶、血管活性肠肽和降钙素基因相关肽的含量,保护了肠道Cajal细胞,并对肠道运动能力有一定恢复效果。证明植物乳杆菌CCFM8610干预后,能有效预防镉暴露诱导的肠道便秘症状。进一步通过对肠道中JNK、ERK、bcl-2以及膜蛋白的分析发现,植物乳杆菌CCFM8610抑制了肠道ERK和JNK的表达,提高了bcl-2相对表达,促进了肠道细胞的抗凋亡活动,缓解了镉暴露造成的肠道应激与细胞凋亡。同时植物乳杆菌CCFM8610也显著提高了肠道上皮细胞中Claudin、DMT-1和E-cadherin蛋白的相对表达,保护了肠道上皮细胞膜蛋白和肠道屏障。此外,对小鼠肠道菌群的16S测序发现,植物乳杆菌CCFM8610也具有调节肠道菌群,保护肠道微环境的作用。证明植物乳杆菌CCFM8610能通过保护肠道屏障、抑制肠道内炎症和保护肠道菌群稳态这三个途径来保护肠道免受镉暴露造成的损伤。通过构建镉暴露肠上皮（Human colon tumor cell line,HT-29）细胞模型,以蛋白组学手段检测到了4089个可信蛋白,筛选得到168个差异蛋白。基于Gene Ontology数据库、KEGG蛋白注释及蛋白互作分析发现,重金属镉引起了细胞内的压力应激,产生了大量丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）、核因子-κB（Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB）通路相关蛋白,并扰乱了上皮细胞膜上FLAN等蛋白的含量,导致细胞膜结构损坏。使用植物乳杆菌CCFM8610干预细胞后发现,植物乳杆菌CCFM8610有效抑制了镉暴露激活的Ras-Raf-MEK-ERK、NF-κB信号通路,从而缓解了细胞内压力应激和细胞内炎症。此外,植物乳杆菌CCFM8610也降低了镉暴露细胞内蛋白AKR1B10相对表达量,提高了蛋白DDX21和蛋白FLNA的相对表达,从而调节了细胞内能量代谢、RNA和蛋白合成,并通过保护细胞膜蛋白Claudin-1和E-cadherin,维持细胞结构,保护细胞屏障。通过与该实验中其他菌株的对比发现,植物乳杆菌CCFM8610可以通过特意性调节蛋白AKR1B10、DDX21和FLNA的相对表达,从而抑制细胞内炎症保护细胞屏障。与植物乳杆菌CCFM175、CCFM408相比对有一定的菌株特异性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中英文缩略词表
• 1 绪论
•   1.1 重金属镉污染现状及危害
•     1.1.1 重金属镉及其污染现状
•     1.1.2 镉的致毒性效应及致毒机理
•   1.2 镉对肠道造成的损伤
•     1.2.1 镉暴露损伤肠道屏障
•     1.2.2 镉暴露损伤肠道免疫
•     1.2.3 镉暴露破坏肠稳态系统
•   1.3 益生菌缓解有害化学物质诱导肠道损伤的潜力
•     1.3.1 益生菌与重金属吸附结合
•     1.3.2 维护肠道屏障的能力
•     1.3.3 调节免疫的能力
•     1.3.4 调节肠道微生态功能
•   1.4 肠道动力
•   1.5 植物乳杆菌CCFM8610对镉毒性的缓解作用
•   1.6 立题意义
•   1.7 主要研究内容
• 2 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株
•     2.1.2 实验动物
•     2.1.3 主要试剂
•     2.1.4 主要设备
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 菌株的活化与培养
•     2.2.2 灌胃菌株菌粉制作
•     2.2.3 小鼠排出首粒黑便时间
•     2.2.4 小鼠粪便含水量的测定
•     2.2.5 小鼠肝脏、肾脏和血液中镉含量
•     2.2.6 小鼠结肠张力检测
•     2.2.7 小鼠结肠、空肠和血清中细胞因子测定
•     2.2.8 小鼠血液生理生化指标检测
•     2.2.9 小鼠结肠c-Kit蛋白检测
•     2.2.10 小鼠粪便菌群组成的测定
•     2.2.11 人结肠癌HT-29 细胞的培养
•     2.2.12 细胞实验设计
•     2.2.13 镉暴露细胞总蛋白提取
•     2.2.14 镉暴露细胞蛋白iTRAQ标记
•     2.2.15 液相色谱质谱分析细胞镉暴露蛋白
•     2.2.16 细胞镉暴露差异蛋白筛选
•     2.2.17 转录水平RT-qPCR验证
•     2.2.18 数据处理及分析方法
• 3 结果与讨论
•   3.1 植物乳杆菌CCFM8610缓解镉暴露诱导肠道损伤的效果评价
•     3.1.1 植物乳杆菌CCFM8610对小鼠血液、肾脏、肝脏中的镉含量的影响
•     3.1.2 植物乳杆菌CCFM8610对小鼠慢性镉暴露期间粪便含水量的影响
•     3.1.3 植物乳杆菌CCFM8610对小鼠慢性镉暴露后排出首粒黑便时间的影响
•     3.1.4 植物乳杆菌CCFM8610对慢性镉暴露小鼠肠道动力的影响
•   3.2 植物乳杆菌CCFM8610缓解镉暴露造成的小鼠肠道损伤途径分析
•     3.2.1 植物乳杆菌CCFM8610缓解镉暴露损伤的肠道屏障
•     3.2.2 植物乳杆菌CCFM8610缓解镉暴露造成的肠道炎症
•     3.2.3 植物乳杆菌CCFM8610能缓解镉暴露损伤的肠道菌群
•   3.3 探寻植物乳杆菌CCFM8610缓解镉暴露损伤的肠道的蛋白组学分析
•     3.3.1 HT-29细胞自然状态与镉暴露状态下差异蛋白筛选
•     3.3.2 差异蛋白GO通路分析
•     3.3.3 差异蛋白KEGG通路分析
•     3.3.4 差异蛋白互作（PPI）分析
•     3.3.5 基于细胞蛋白组学探寻植物乳杆菌CCFM8610缓解镉暴露肠道损伤的机制
• 主要结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的文章

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 吴江萍

导师: 张灏

关键词: 植物乳杆菌,镉暴露,丝裂原活化蛋白激酶,肠道

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 江南大学

分类号: TS201.3

总页数: 65

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