一、Wortmannin对离体肝星状细胞增殖的影响（论文文献综述）
翟诗翔[1]（2020）在《螺旋藻藻蓝蛋白体内外抗肝纤维化机理研究》文中指出肝脏疾病在我国有很高的发病率,肝纤维化是肝脏疾病加重的一个必经过程,防治肝纤维化是防止肝脏疾病加重的有效手段。肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSC）激活后,产生Ⅰ型胶原（collagen type Ⅰ,Co-Ⅰ）等胞外基质是肝纤维化发生的关键,此外,肠道中的微生物及微生物相关分子模式（microbial-associated molecular patterns,MAMPs）也能通过肝肠循环到达肝脏,引 起肝脏炎症,促进肝纤维化的发展。藻蓝蛋白（phycocyanin,PC）因为具有抗氧化、抗炎和增强免疫等特性,在食品领域有着广泛的应用,也具有潜在的药用价值。之前的很多研究表明PC具有保肝作用,但PC缓解肝纤维化的机理尚不明确,为了揭示PC缓解肝纤维化的具体机制,推动PC的精准应用,我们通过体内和体外实验,探究了 PC对肝纤维化的具体影响,以及肠道微生物在PC缓解肝纤维化过程中所起的作用。在体外实验中,我们用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）活化大鼠肝星状细胞HSC-T6,探究了不同浓度的PC对HSC-T6细胞增殖与凋亡的影响。结果显示10、100和1000 μg/mL的PC作用48 h后显示了对HSC-T6较好的抑制率,1000μg/mLPC对细胞的抑制率能达到60%以上,且呈剂量依赖性。使用激光共聚焦显微镜观察到PC能进入到HSC-T6的细胞质中。普通光学显微镜下观察到PC干预后能使细胞变圆、皱缩。qRT-PCR的结果显示PC干预能促进凋亡相关蛋白Caspase3的表达,抑制肝纤维化标志物Co-Ⅰ的表达。结果表明PC能够抑制HSC的增殖,促进HSC的凋亡,从而减少了 Co-Ⅰ等胞外基质的产生,缓解了肝纤维化。在体内实验中,我们利用CC14腹腔注射诱导了大鼠肝纤维化,探究了 PC干预后肝脏的纤维化状态及肠道微生物的变化。结果显示每天灌胃100 mg/kg的PC显着改善了 CC14诱导大鼠的肝纤维化程度,降低了肝脏中纤维化标志物Co-Ⅰ和α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin,α-SMA）等胞外基质的表达,降低了肝脏组织中的炎性浸润和纤维交联。16S rRNA高通量测序结果显示CC14诱导使大鼠肠道微生物发生了紊乱,增加了厚壁菌门的（Firmicutes）丰度,降低了拟杆菌门（Bacteroidetes）的丰度,而PC干预抑制了 CC14造成的Firmicutes的丰度升高和Bacteroidetes的丰度降低,改善了肠道微生物的组成和结构。此外,CC14还降低了具有抗炎活性的益生菌拟杆菌属（Bacteroides）、副拟杆菌属（Parabacteroides）、布劳特氏菌属（Blautia）的丰度,PC干预显着增加了具有抗炎活性的益生菌布劳特氏菌属（Blautia）和具有肠屏障保护作用的益生菌别样棒菌属（Allobaculum）的丰度,说明PC能够通过调节肠道微生物的组成和结构降低机体的炎症水平,从而缓解肝纤维化。综上,我们的结果表明PC在体内外均具有缓解肝纤维化的能力。一方面,PC能够通过促进HSC的凋亡,减少纤维化标志物Co-Ⅰ等胞外基质的产生,发挥抗肝纤维化作用;另一方面,PC通过增加肠道中具有抗炎活性的益生菌的丰度,降低了机体炎症水平,从而阻遏了肝纤维化的发展。
张楚焌[2]（2019）在《从抑制肝星状细胞活化角度探讨甘参复方抗肝纤维化的作用机制》文中提出目的:在体与离体实验相结合,探索甘参复方对胆汁淤积型肝纤维化大鼠肝纤维化程度的影响。同时,通过观察甘参复方对肝星状细胞（Hepatic stellate cell,HSC）活化程度、磷酸化细胞外调节蛋白激酶（phospho-extracellular regulated protein kinases,p-ERK）和核转录因子κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）表达的影响,揭示甘参复方抗肝纤维化的机制。方法:1.体内实验:大鼠随机分为假手术组、模型组、甘参复方组,采用胆总管结扎法（bile duct ligation,BDL）制备胆汁性肝纤维化大鼠模型,在2周、4周两个时间点取材。甘参复方组按前期实验确定给药剂量(25mg·kg-1)。通过HE染色观察肝组织形态学变化,Masson染色观察肝脏纤维组织再生情况,酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immuno sorbent assay,ELISA）检测肝组织肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor,TNF-α）、白介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）表达,免疫印迹法（Western blot）检测肝组织内Ⅰ型胶原蛋白（collagenⅠ,Col.Ⅰ）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）磷酸化水平的变化。2.体外实验:离体培养永生化大鼠肝星状细胞株HSC-T6（表现为活化型）,观察甘参复方对HSC-T6活化的影响及其机制:（1）将甘参复方稀释成6个不同的浓度梯度,采用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况,筛选出甘参复方对HSC-T6的最佳作用浓度。（2）将细胞分为正常对照组,甘参复方低、中、高浓度组,采用ELISA法检测各组细胞上清液中的Col.I含量。为了进一步验证甘参复方对HSC-T6的活化影响,应用2ng·ml-1转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）刺激HSC-T6,将细胞分为5组,即正常对照组、TGF-β1组和TGF-β1+甘参复方低、中、高浓度组,应用CCK-8法检测甘参复方对HSC-T6增殖的影响。用用免疫荧光法检测HSC-T6中的α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）的表达;Western Blot法检测各组HSC-T6中p-ERK和NF-κB的表达。并且用ERK抑制剂PD98059和激动剂血小板衍生生长因子BB（Platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB）作用于HSC-T6,从不同角度观察甘参复方对p-ERK表达的影响。结果:1.甘参复方显着抑制胆汁性肝纤维化大鼠肝组织的纤维组织生成:（1）HE染色显示,胆总管结扎2周后,肝细胞变性坏死,胆小管显着增生,门管区伴随大量炎症细胞浸润。4周后,肝细胞广泛变性坏死,胆小管增生更加显着,门管区周围和坏死区域大量纤维组织增生。增生的纤维组织相互连接,形成“假小叶”。甘参复方能够在2周、4周明显抑制肝组织纤维增生,缓解肝脏结构紊乱以及炎症细胞浸润。（2）Masson染色显示,假手术组大鼠,仅在肝中央静脉和汇管区周围有少量纤维组织。胆总管结扎2周后,纤维组织显着增生。胆总管结扎4周后,增生的纤维组织相互连接,形成“假小叶”。甘参复方在2周和4周可以显着抑制纤维组织再生。（3）ELISA结果显示,胆总管结扎2周和4周以后,肝组织TNF-α和IL-1β含量显着增加,与假手术组比较有显着统计学差异（P<0.01,P<0.001）。与模型组比较,甘参复方组肝组织TNF-α和IL-1β合成减少,有显着统计学差异（P<0.001）。（4）Western blot结果显示,2周和4周以后,模型组肝组织Col.Ⅰ和P-ERK合成显着增加,与假手术组比较有显着统计学差异（P<0.001）。甘参复方在2周和4周能够显着抑制Col.Ⅰ和p-ERK合成,与模型组比较有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。2.甘参复方可抑制HSC-T6活化以及ERK通路的磷酸化:（1）甘参复方作用24h后,0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1μmol·L-16个浓度药物对细胞生长有抑制作用,与正常对照组相比,具有统计学意义（P<0.05）。于此基础上筛选甘参复方低(0.125μmol·L-1)、中(0.25μmol·L-1)、高(0.5μmol·L-1)三个浓度组。（2）ELISA结果显示,0.125、0.25、0.5μmol·L-1的甘参复方能够抑制HSC-T6分泌Col.Ⅰ,其中0.5μmol·L-1与对照组相比有统计学差异（P<0.05）。（3）TGF-β1显着诱导HSC-T6细胞增殖,与正常对照组相比,有显着统计学意义（P<0.001）,甘参复方中、高浓度能明显抑制TGF-β1诱导的细胞增殖（P<0.05）。（4）经TGF-β1刺激后的细胞上清Col.Ⅰ含量以及胞内α-SMA生成显着增加,与对照组比较,有显着统计学差异（P<0.01）。与TGF-β1组对比,3个浓度甘参复方均能减少胶原合成和α-SMA生成（P<0.05,P<0.01）。（5）甘参复方对活化肝星状细胞NF-κB/ERK信号通路活化有下调作用:与正常对照组比较,甘参复方低、中、高浓度组的细胞磷酸化ERK和NF-κB表达均显着减少,有明显统计学差异（P<0.05,P<0.01,P<0.001）。PDGF-BB刺激后细胞p-ERK蛋白的表达升高（P<0.05）,PD98059可抑制PDGF-BB诱导的ERK磷酸化。低、中、高3个浓度甘参复方组均可下调PDGF-BB诱导的ERK磷酸化,与PDGF-BB刺激组比较,有显着统计学意义（P<0.001）。结论:1.甘参复方能够改善肝脏组织形态结构,抑制胶原纤维增生,减轻肝脏炎症反应,从而达到抗纤维化作用,其机制可能是通过抑制ERK磷酸化,从而抑制HSC增殖。2.甘参复方能够抑制HSC-T6增殖、α-SMA和Col.Ⅰ的表达,提示甘参复方抗纤维化的内在机制之一可能是抑制肝星状细胞的活化。3.甘参复方能够抑制NF-κB的表达,且能够下调HSC-T6中ERK磷酸化水平,提示甘参复方通过抑制NF-κB表达,从而抑制炎症反应以及由炎症激活的ERK通路,继而抑制HSC活化和增殖。
孙静[3]（2019）在《蛇床子素促成骨作用及代谢多态性研究》文中研究说明目的:目前临床应用的抗骨质疏松药物带来治疗作用的同时副作用不容忽视,有效低毒的新药研发仍在进行中。文献报道传统中草药蛇床子及其活性成分蛇床子素具有用于骨质疏松的治疗作用,本论文通过研究蛇床子素与骨调节靶点的结合情况,对成骨细胞调节的机制以及代谢酶多态性相关作用的研究,明确蛇床子素作为新型治疗骨质疏松药物的特点及可能性。方法:1.计算机模拟蛇床子素和多靶点骨调节信号因子的分子对接。2.应用细胞增殖实验观察蛇床子素对人成骨样MG-63细胞增殖能力的影响。应用磷酸苯二钠实验法测定蛇床子素对人成骨样MG-63细胞分化功能的影响。应用DAPI染色法观察蛇床子素对凋亡诱导剂诱导的人成骨样MG-63细胞凋亡的影响。应用半定量RT-PCR和Western Blot技术观察蛇床子素对人成骨样MG-63细胞OPG、RANKL、Osterix表达的影响。测定蛇床子素对P-ERK/ERK,P-AKT/AKT,β-catenin蛋白时间表达的影响。3.应用雌激素受体阻断剂ICI 182780,MEK抑制剂PD 98059,PI3K抑制剂Wortmannin和Wnt抑制剂DKK-1检测其对蛇床子素调节作用的阻断。检测阻断剂对蛇床子素对OPG、RANKL和Osterix调节的阻断。测定阻断剂对蛇床子素P-ERK/ERK,P-AKT/AKT,β-catenin蛋白调节作用的阻断。4.建立LC-MS/MS的CYP2C9经典探针底物双氯芬酸、CYP2D6经典探针底物右美沙芬代谢物测定方法并进行方法学验证,测定蛇床子素对不同代谢酶基因型药物代谢的影响。结果:1.对接结果表明,蛇床子素和骨代谢调节相关的多个靶点具有不同程度的结合能力,从微观机制展示了多靶标作用的可能性。2.蛇床子素的促成骨作用主要表现为促分化,小剂量蛇床子素能够促进MG-63细胞增殖,抑制细胞凋亡,提高细胞中OPG/RANKL的mRNA及蛋白比率,上调Osterix mRNA和蛋白的表达,促使细胞内P-ERK、P-AKT表达增多,细胞浆内β-catenin蛋白降低,细胞核内β-catenin蛋白升高。3.ICI 182780、PD98059、Wortmannin和DKK-1均可部分阻断蛇床子素的促增殖分化作用,部分阻断蛇床子素对OPG、RANKL、Osterix的mRNA及蛋白表达的调节。提示该四种信号通路在蛇床子素调节成骨细胞中均参与发挥作用。4.蛇床子素对3种CYP2C9、4种CYP2D6基因型药物代谢酶的半数抑制浓度分别为:CYP2C9*1,91.51μM;CYP2C9*2,104.5μM;CYP2C9*3,120.4μM;CYP2D6*1,61.86μM;CYP2D6*2,74.09μM;CYP2D6*10,47.95μM;CYP2D6*39,56.99μM。结论:蛇床子素的促成骨作用涉及多靶点、多条信号通路,对常见存在多态性的代谢酶作用弱。由于骨质疏松需要长期用药,蛇床子素具有多靶点、相互作用少的特点,和现有的抗骨质疏松药物相比,具有作为一个新型治疗骨质疏松药物的良好前景。
钱宝鑫[4]（2018）在《SND1延缓CCl4诱导的转基因小鼠的肝纤维化进程但促进肝癌的发生及发展》文中研究说明目的:多功能蛋白SND1可以影响肝脏代谢、肝癌发生、肝癌血管生成以及肝癌细胞增殖等过程,但其在肝纤维化过程中发挥的作用仍不得而知。本课题主要旨在探讨SND1蛋白在肝纤维化的发生和发展中所起的作用,以及相关的分子机制,次要在于探究同一种蛋白在肝病不同病变阶段及肝脏不同细胞成分中的作用差异。方法:首先,通过生物信息学的方法对于Oncomine数据库中收录的人正常肝组织、肝纤维化组织、肝癌组织的芯片数据进行分析,分析不同组别肝组织中SND1蛋白的表达差异。利用SND1全身过表达的转基因小鼠,以野生型小鼠作为对照,通过CCl4腹腔注射来诱导肝纤维化模型,从大体观察、形态染色、免疫组化、免疫印迹、血清生化、肝组织胶原含量测定多种角度,评价SND1转基因小鼠与野生型小鼠肝纤维化表型之间的差异。通过密度梯度离心法分离得到小鼠原代肝星状细胞,利用qPCR及免疫荧光检测TG组原代肝星状细胞的过表达状态及肝纤维化相关蛋白及细胞因子与WT组之间的表达差异;通过体外增殖、趋化、细胞表面超微结构的变化来反映WT组与TG组原代HSC活化状态的差异。利用qPCR及荧光共聚焦显微镜观察CTGF上游Hippo通路的转录复合物元件YAP、TAZ的表达情况以及WT/TG组间细胞内定位差异。延长造模时间后观察WT/TG组肝癌发生之间的差异、肝癌内细胞组分与正常对照及癌旁组织的差异、肝癌及癌旁组织内部SND1表达的差异,观察经历不同的造模时间后,肝组织SND1表达的差异。结果:1.Oncomine数据库的临床样本,SND1的表达水平与肝纤维化呈负相关,与肝癌呈正相关;2.给予CCl4腹腔注射后,全身过表达SND1的转基因小鼠与WT对照组相比,肝组织内的纤维化面积更小、胶原含量更少、肝星状细胞活化的标志蛋白表达更低、转氨酶水平下降;3.相同造模条件下,TG组原代肝星状细胞的增殖、趋化、分泌细胞因子及细胞外基质蛋白的能力弱于WT对照,HSC活化标志蛋白α-SMA表达下降,细胞表面超微结构更“松垮”,倾向于停留在静息的“星状”表型;4.小鼠原代HSC中过表达的SND1可以使Hippo通路的YAP/TAZ蛋白倾向于定位在细胞浆中,抑制下游基因CTGF的表达;5.随着CCl4造模时间的延长,TG组肝细胞中的SND1过表达水平逐渐减弱,直至与WT对照没有明显差别,肝星状细胞的SND1过表达水平不受CCl4造模的影响;6.SND1全身过表达的转基因小鼠在长时间CCl4刺激后会被诱导产生肝癌,癌组织内肝细胞SND1表达水平升高,Kupffer细胞群体数量增多。结论:1.SND1可以延缓肝纤维化的发生发展及肝星状细胞的活化;2.SND1可能通过改变肝脏免疫微环境诱导肝癌发生,肝细胞癌变后SND1表达升高。
仝艳艳[5]（2016）在《氧化苯砷抗肝纤维化作用及机制研究》文中提出背景:肝纤维化是各种慢性肝病进展至肝硬化的必经阶段,也是肝硬化逆转治疗的关键阶段,主要与HSC激活及活化HSC的转归密切相关,目前尚无有效防治药物。尽管肝纤维化时肝内活化HSC的来源尚有争议,但HSC无疑仍是抗肝纤维化治疗的重要靶点。HSC激活是一个渐进的过程,因此,抑制HSC激活或逆转HSC活化状态的策略都具有治疗肝纤维化的潜能。我们的合作者—中国科学院上海高等研究院黄福德教授课题组发现PAO能显着抑制体外培养间充质干细胞α-SMA和Calponin1表达,抑制间充质干细胞向肌成纤维细胞方向分化（尚未发表的资料）,提示PAO可能具有抗肝纤维化潜力。目的:（1）探讨PAO对HSC-T6（大鼠肝星状细胞系）活化状态的影响;（2）探讨PAO对大鼠原代HSC体外激活的影响及机制。综合评估PAO的抗肝纤维化作用及机制。方法:（1）以不同浓度（25、50、100、150及200nmol/L）PAO处理HSC-T6细胞24h,观察PAO对HSC-T6活力的影响;应用MTT法检测PAO对HSC-T6细胞增殖的影响,以评估PAO的细胞毒性;抽提PAO处理细胞及对照组细胞RNA及总蛋白质;应用Real-Time PCR及Western-blot检测各组细胞α-SMA、COLI、COLIII mRNA及α-SMA蛋白表达。（2）SD大鼠原代HSC的分离及培养;应用Western-blot检测培养第1d,3d,4d,7d原代HSCα-SMA蛋白表达并观察细胞形态学变化,评估原代HSC体外激活过程的动态变化规律;以不同浓度PAO处理分离培养第4d的原代HSC,应用Real-Time PCR及Western-blot检测PAO处理后HSCα-SMA、COLI、COLIII mRNA及α-SMA和磷酸化Akt蛋白的表达。结果:（1）MTT结果显示,随PAO浓度增高,HSC的存活率明显下降,当PAO浓度增高至150nmol/L时,HSC细胞存活率下降为为对照组的82%（P<0.05）,当PAO浓度增加至200nmol/L时,细胞存活率降低为对照组72%以下（P<0.01）,结果表明25-100nmol/L浓度的PAO对HSC毒性小,细胞存活率均在90%以上,确定为有效工作浓度;Western-blot结果显示,与对照组相比,PAO能降低HSC-T6细胞α-SMA的表达,差异具有统计学意义;荧光实时定量PCR结果显示,与对照组相比,PAO可以降低α-SMA及COLImRNA的表达,差异具有统计学意义,但是对COLIII的表达没有影响。（2）密度梯度离心法提取SD大鼠原代HSC,发现随着培养时间的延长,HSC的活化程度逐渐增强,养1d时多数细胞已贴壁,呈扁圆形或椭圆形,离体培养4d时原代HSC呈初始活化状态,培养7d时呈完全活化状态;Western blot结果显示,随着培养时间延长,HSC的α-SMA表达量逐渐升高,离体培养4d时表达量为（1.51±0.045）较对照（0.762±0.062）明显增高（P<0.05）,离体培养7d时α-SMA表达量进一步升高（1.752±0.053）。PAO可以剂量依赖性下调离体培养4d的HSCα-SMA蛋白表达,在50、100nmol/L浓度时,α-SMA表达量分别为（0.63±0.078）、（0.41±0.09）显着低于对照组（1.53±0.039）,P<0.05);Real-time PCR结果显示:与对照相比,各浓度PAO对HSC表达α-SMA、CollegneI mRNA表达均有显着抑制作用,且呈浓度依赖性增强（P<0.01）;Western blot结果显示,与对照组相比,PAO可明显下调离体培养4d的HSC PI4K及p-Akt蛋白表达。结论:PAO在25-100nmol/L浓度范围内对HSC-T6无明显细胞毒性,但可明显逆转HSC的活化程度及抑制原代HSC的自发激活,其机制可能与阻断PI3K-Akt信号通路有关,提示PAO可能具有抗肝纤维化潜力。
杨岩[6]（2016）在《EPAC对乙醛诱导的大鼠肝星状细胞增殖和激活的作用》文中提出酒精性肝病（alcoholic liver disease, ALD）是由于长期大量饮酒而导致的肝脏损害性病变。酒精性肝纤维化（alcoholic liver fibrosis, ALF）是ALD进展为酒精性肝硬化或肝癌的中间阶段和必经病理过程。在ALF的发生过程中,乙醇可通过其直接代谢产物乙醛激活肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）,活化的HSC是肝纤维化过程中细胞外基质（Extra cellular matrix,ECM）的主要来源,也是各种因素所致肝纤维化发生的核心和关键环节。cAMP信号通路是细胞内非常重要的信号传递途径之一,最初认为蛋白激酶A（PKA）是其唯一的下游效应因子。cAMP/PKA通过磷酸化cAMP反应序列结合蛋白（CREB）的Ser-133位点使之活化,然后作用于cAMP反应序列影响基因表达,进而调控细胞的生长、分化。课题组前期研究已经探讨了cAMP/PKA/CREB信号通路在大鼠酒精性肝纤维化模型和乙醛刺激的大鼠肝星状细胞中的作用。EPAC（exchange protein directly activated by cAMP）是一种由cAMP激活的鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factors,GEFs）,又称为cAMP-GEF,是1998年de Rooij等新发现的独立于PKA的cAMP下游效应因子,在许多重要的细胞生理病理进程中都发挥重要的调控作用。这提示了cAMP细胞中的效应可能不只是由以前鉴定的靶蛋白所介导。cAMP通过EPAC活化Rapl, Rapl是Ras样的小分子G蛋白,通过与EPAC结合而被活化,EPAC能增加这类小分子G蛋白对GTP的摄取并使之形成有活性的GTP结合构象。目前为止已发现了两种EPAC亚型：EPAC1 （RapGEF3）和EPAC2 （RapGEF4）,由不同的基因编码。那么,EPAC基因是否在大鼠肝星状细胞中表达呢?如果表达又起到什么样的作用呢?是否和PKA作用相同?因此,本课题的研究内容是在采用乙醛诱导HSC-T6细胞建立离体大鼠酒精性肝纤维化HSC模型的基础上,运用RNA干扰技术和EPAC激动剂,观察EPAC1和EPAC2的表达对α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表达的影响,为酒精性肝纤维化的防治提供新的靶点。主要内容概括如下：1.EPAC在大鼠肝星状细胞中的表达情况实验采用大鼠HSC-T6细胞系为研究对象,用浓度为200μM乙醛处理细胞48 h,实时荧光定量PCR （qRT-PCR）、Western blot分别检测EPAC1和EPAC2的mRNA与蛋白的表达水平。结果显示,EPAC1和EPAC2在正常HSC均有表达,与正常组比较,经200μM乙醛作用48 h后,HSC模型组EPAC2表达水平明显增高,而EPAC1表达水平显着下降。提示EPAC1和EPAC2在乙醛诱导的HSC中可能起到不同的作用。2. EPAC对乙醛刺激的HSC—T6增殖和激活的作用实验设正常对照组（常规培养）, 模型组,EPAC激动剂（8-（4-Chlorophenylthio）-2’-O-methyladenosine 3’,5’-cyclic monophosphate monosodium hydrate, Me-cAMP）组。除正常对照组外其余各组均以200μM乙醛作用48 h,制备大鼠酒精性肝纤维化HSC模型。Me-cAMP组在乙醛作用24 h后再加入Me-cAMP继续共同作用24 h。利用MTT法检测Me-cAMP对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测Me-cAMP对细胞周期的影响。qRT-PCR及Westernblot法分别检测HSC-T6的α-SMA、Ⅰ型和III胶原mRNA和蛋白表达以及Rapl的蛋白表达。与模型组比较,Me-cAMP明显增加了EPAC1和2的表达,使EPAC1的表达升高了约三倍,并且使细胞增殖活力明显下降。流式细胞分析表明Me-cAMP使S期和G2/M期细胞数目比例显着下降。qRT-PCR及Western blot实验表明α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ胶原的表达与模型组比较,均呈现出显着下降。当EPAC被激活之后,EPAC的下游分子Rap1活性形式Rap1-GTP的蛋白表达也同样上升。以上结果提示,在HSC存在EPAC/Rap1信号通路,并且EPAC激活后,乙醛诱导的的HSC-T6的激活和增殖均受到抑制。3、EPAC siRNA在乙醛刺激的HSC—T6中的作用建立上述HSC模型,设计并合成EPAC1和EPAC2小干扰RNA （small interfering RNA,siRNA）,通过脂质体Lipofectamine TM 2000瞬时转染至HSC-T6细胞内,荧光倒置显微镜观察细胞的转染效率,同样利用MTT法检测EPAC siRNA对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测其对细胞周期的影响；qRT-PCR及Western blot法分别检测HSC-T6的a-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ mRNA及蛋白表达。将EPAC1和EPAC2 siRNA转染至HSC-T6细胞内,与阴性对照组相比EPAC1和2表达水平明显降低。MTT实验结果说明单独应用EPAC1 siRNA和同时应用EPAC1和2 siRNA均使乙醛诱导的HSC-T6细胞增殖活力增强,而单独应用EPAC2 siRNA可使乙醛诱导的HSC-T6细胞增殖活力减弱。细胞周期结果也表明只有单独应用EPAC2 siRNA使S期和G2/M期的细胞数目比例显着下降。当靶向封闭EPAC1和EPAC2基因的表达时,α-SMA、I型和III胶原mRNA及蛋白表达亦明显降低。将EPAC1 siRNA转染至HSC-T6细胞内,α-SMA、型和III胶原mRNA及蛋白表达升高;将EPAC2 siRNA转染至HSC-T6细胞内,α-SMA、I型和III胶原mRNA及蛋白表达降低。上述结果说明,EPAC2沉默可抑制乙醛诱导的HSC-T6活化与增殖,而EPAC1沉默进一步加强了乙醛诱导的HSC-T6活化与增殖。4、EPAC和PKA激活对乙醛刺激的HSC—T6表达I型和III胶原及α-SMA的作用不同实验设正常对照组（常规培养）,模型组,Me-cAMP组,PKA激动剂（N6-phenyladenosine-3,5-cyclic monophosphate, Phe-cAMP）组,除正常对照组外其余各组均以200 μM乙醛作用48 h,制备大鼠酒精性肝纤维化HSC模型。Me-cAMP和Phe-cAMP组在乙醛作用24 h后再加入继续共同作用24 h。qRT-PCR及Western blot法分别检测HSC-T6的α-SMA、I型和Ⅲ胶原mRNA和蛋白表达以及Rap1的蛋白表达。与模型组相比,Me-cAMP抑制了细胞中α-SMA,I型和Ⅲ胶原的蛋白的表达；而PKA激动剂Phe-cAMP促进了α-SMA, collagen I和Ⅲ的蛋白的表达,与课题组前期研究结果一致。EPAC激动剂可使小G蛋白Rap1活性形式Rap1-GTP表达增多,而PKA激动剂Phe-cAMP却对Rap1和GTP结合影响不大。这些数据表明,在乙醛诱导的HSC-T6中EPAC和PKA的激活对α-SMA,I型和Ⅲ胶原表达可能起到不同的作用；而EPAC可能通过Rap1发挥作用。综上所述,在大鼠酒精肝纤维化HSC模型中,EPAC2表达较正常组升高,而EPAC1的表达降低。 使用EPAC激动剂Me-cAMP和沉默EPAC2基因的表达均可明显抑制HSC-T6细胞的活化增殖。EPAC激动剂Me-cAMP不仅较大程度的增加了EPAC1的表达,而且增加了EPAC下游Rap1活性形式Rap 1-GDP的表达。运用EPAC激动剂Me-cAMP和PKA激动剂Phe-cAMP发现在乙醛诱导的HSC-T6中EPAC和PKA的激活对α-SMA,Ⅰ型和Ⅲ胶原表达可能起到不同的作用;而EPAC可能通过Rap1发挥作用。以上结果说明EPAC/Rap1信号通路激活可以抑制乙醛诱导的大鼠肝星状细胞激活和增殖。
付晓烨,康泰,吴景东[7]（2015）在《桃红四物汤含药血清对离体细胞影响研究概况》文中进行了进一步梳理血清药理学方法能在细胞水平揭示桃红四物汤含药血清对离体的骨细胞（骨髓间充质干细胞、巨噬细胞、成骨-破骨细胞）、血管内皮细胞、平滑肌细胞、肝星状细胞、角质形成细胞、大肠癌细胞等有不同程度影响。探索桃红四物汤有效成分对人体各细胞的干预作用及机制,对解释桃红四物汤治疗相关疾病具有重要深远的意义,也是有待解决的重要课题。
徐士勋[8]（2014）在《基于鳖甲功效的先导化合物的研究（Ⅲ）-络合法分离鳖甲寡肽探讨及鳖甲七肽抗酒精性肝损伤活性研究》文中认为研究背景：鳖甲具有潜阳滋阴,散结软坚,除蒸退热的功用,研究表明该药及其复方在保护肝脏、增强机体免疫力、抗癌等方面有普遍的应用；临床实践和现代药理学研究表明其有效成分为寡肽类；前期实验结合文献调研发现寡肽分离有较大难度,常规分离的工作量大、重复性差；药理研究发现鳖甲寡肽体外可以抑制单胺氧化酶活性,与肝组织有一定结合率,同时文献调研发现寡肽类具有抑制肝星状细胞、肿瘤细胞及提高机体免疫力等作用；前期研究发现分离得到的鳖甲七肽对四氯化碳导致的急慢性肝损伤、猪血清引起的肝纤维化具有较为良好的治疗作用,而酒精性肝病目前已经成为一个普遍性的问题,开发抗酒精性肝病药物需求较大,尚未对鳖甲七肽对酒精性肝损伤作用进行研究。综上本课题对鳖甲寡肽的研究分为化学分离和药理研究两个方面,化学方面对寡肽的分离方法学从丹磺酰氯衍生化分离、HPLC-MS/MS对混合物中寡肽进行指认、铜离子络合分离三方面进行了探究,以期得到更适用于分离鳖甲寡肽的方法；药理方面从鳖甲寡肽对4种肝相关细胞和2种免疫相关细胞增殖影响及鳖甲七肽对酒精引起的正常肝细胞损伤和小鼠急慢性肝损伤治疗作用方面进行了研究,以期进一步确认鳖甲寡肽的药效。该项目由国家自然科学基金（81073017）和北京中医药大学科研创新团队立项（2011-CXT D-15）支持。研究方法：化学分离,衍生分离利用丹磺酰氯对寡肽的氨基端进行衍生,以HPLC对衍生结果进行分析；二级质谱以HPLC-MS/MS对鳖甲中混合寡肽质谱碎片进行阐明,结合氨基酸裂解规律对寡肽一级结构进行鉴定；络合分离以硫酸铜溶液对硅胶、聚酰胺树脂、AB-8大孔吸附、凝胶G10树脂进行处理,比较各洗脱部位差别及回收率,筛选出硅胶进一步优化络合条件,制备硫酸铜络合硅胶柱层析填料和薄层板；药理方面,细胞实验用MTT法考察鳖甲寡肽对肝星状细胞（HSC-T6）、正常肝细胞（L02）、成纤维细胞（L929）、肝癌细胞（Be17402）、嗜碱性粒细胞（rbl-2h3）、巨噬细胞（RAW264.7）增殖影响及对酒精损伤的L02细胞的治疗及预防功效；动物实验方面以不同浓度酒精分别用雌性和雄性小鼠造酒精性急慢性肝损伤模型,考察鳖甲七肽对它们的保护作用。研究结果：分离部分发现丹磺酰氯衍生反应复杂,样品及标准品液相分析没有出现新峰；应用HPLC-MS/MS联用方法从60%醇沉-酶解经3500透析膜透析后,分子量小于3500的部位指认了一个寡肽,初步确认一级结构为H-Trp-Pro-Gly-Leu/Ile;络合研究发现硅胶和硫酸铜硅胶寡肽回收率分别为（22.85±0.30）%和（86.95±0.87）%；凝胶G10和硫酸铜凝胶G10寡肽回收率分别为（34.56±0.50）%和（45.77±0.49）%；聚酰胺和硫酸铜-聚酰胺寡肽回收率分别为：（32.68±0.26）%和（16.09±+0.28）%；AB-8大孔树脂和硫酸铜AB-8大孔树脂寡肽回收率分别为：（87.02±2.17）%和（49.71±0.48）%。硫酸铜络合薄层板可使半胱氨酸和其它氨基酸分开；精氨酸和组氨酸相互分离；谷胱甘肽和二甘肽分离；药理实验中,细胞实验结果发现鳖甲寡肽对免疫细胞抑制率为-40%左右；酶解产生的寡肽对HSC-T6的增殖抑制率为40%左右,而原生寡肽为10%以下；动物实验结果发现鳖甲寡肽I-C-f-6可以使急慢性酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST活性和肝匀浆MDA含量均明显减少（O<0.05）,显着提高肝匀浆SOD活性（P<0.05）,同时减轻肝组织病理损伤；慢性酒精性小鼠肝损伤血清AKP活性和肝组织匀浆MAO亦显着降低（P<0.05）。研究结论：分离部分发现衍生化方法及普通方法无法对鳖甲寡肽进行有效分离,而通过HPLC-MS/MS可以对混合物中肽类一级结构进行测定；络合实验说明AB-8大孔树脂可用于对鳖甲寡肽粗分,并有较好分离效果；硫酸铜处理后硅胶和凝胶G10分离性能有较大改变,起到了一定分离改善作用；络合薄层可对某些寡肽和氨基酸之间进行分离；药理实验提示鳖甲作用的物质基础可能是进入体内后经酶解以后产生的寡肽,机理可能在于抑制肝星状细胞增殖和增强免疫力；酒精性损伤模型实验提示鳖甲寡肽I-C-F-6对酒精导致的正常肝细胞损伤及小鼠急慢性酒精性肝损伤具备一定的治疗作用,其机制可能与SOD活力升高使得机体清除自由基的能力增强,从而抑制脂质过氧化相关。
林珈好[9]（2014）在《丹参酮ⅡA、丹酚酸B与甘草次酸复方脂质体构建及体内外评价研究》文中认为目的：1、以不同极性的中药多组分药物为研究对象,以丹参酮IIA（TSN）、丹酚酸B（SalB）以及甘草次酸（GA）复方脂质体（GTS-lip）的包封率、表观形态、Zeta电位、粒径及其分布等质量评价参数为指标,探索三组分同时被包封于脂质体的制备工艺,考察本给药系统构建的合理性。2、以GTS-lip体外释药行为及细胞药效、动物体内药代动力学及组织分布为研究内容,考察丹参-甘草不同极性组分复方脂质体配方的合理性,并为探讨构建评价该脂质体方法的可行性提供实验依据。方法：本课题共包含四部分内容。第一部分,GTS-lip处方前研究。建立TSN、Sal B、GA同时测定HPLC方法,并对方法学进行验证；考察水溶性药物Sal B在不同pH条件下的油水分配系数；恒温震荡法测定2个脂溶性药物TSN和GA在PBS （pH=6.8）缓冲液、0.2%吐温、0.5%吐温、0.2%SDS、0.5%SDS中的平衡溶解度；分别建立脂溶性成分、水溶性成分的包封率测定方法,考察葡聚糖凝胶过滤法、低速离心法测定GTS-lip中2个脂溶性成分包封率的最优条件,以回收率为指标考察2种方法的准确性；考察高速离心法、高速离心-超滤法对水溶性成分SalB包封率的测定,对最优方法进行优化和验证。第二部分,GTS-lip的制备及其药剂学性质研究。分两步优化GTS-lip工艺,首先制备2个脂溶性成分的复方脂质体GT-lip,以包封率和粒径为指标筛选薄膜分散法、乙醇注入法、逆向薄膜分散法3种制备方法；以TSN、GA包封率为双指标,进行单因素考察,包括磷脂类型、SPC与CH比例、SPC与TSN比例、SPC与GA比例、水合温度、探头超声功率等,并在此基础上进行正交优化筛选最优工艺。进一步,在GT-lip的基础上,以三种药物包封率、粒径为指标筛选Sal B最佳载入方法,并逐一对缓冲液pH、孵育时间、孵育温度、SPC与Sal B比例、SPC与GA比例等影响其载入的主要因素进行单因素考察,同时研究丹酚酸B的载入对丹参酮ⅡA、甘草次酸包封率的影响；在单因素基础上,以Sal B和TSN包封率为指标,采用Box-Behnken法筛选Sal B最优载入工艺,并进一步考察脂质体的冻干工艺；两步制备过程中,均对脂质体外观、粒径、电位等进行监测。最终分别采用反透析法和透析法考察脂质体中脂溶性成分和水溶性成分的体外释药情况并进行相关方程拟合。第三部分,GTS-lip对肝星状细胞的增殖抑制研究。考察GTS-lip对肝纤维化发病的中心环节-肝星状细胞（HSC）增殖的抑制作用。以HSC增殖抑制率为指标,考察不同给药剂量和不同作用时间点GTS-lip的细胞药效,并与TSN、GA、Sal B物理混合溶液组比较,电镜监控细胞形态。第四部分,GTS-lip小鼠体内药代动力学与组织分布研究。建立小鼠血浆及心、肝、脾、肺、肾、脑各组织匀浆的前处理方法和Sal B.TSN.GA同时测定的UPLC-PDA检测方法,并对各方法学进行验证；小鼠尾静脉给药,于0.083、0.17、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6h取血和各脏器,测定相应药物浓度,采用WinNonlin5.2药代动力学软件对各时间点血浆及各组织中三个药物的浓度进行处理,分别计算药动学参数,绘制三个药物的血浆药物浓度-时间曲线和各组织分布条形图,并与普通混合溶液组对应药物进行对比,考察药物载入脂质体后药动学参数的变化及在血液及各组织中分布行为的改变。进一步,以肝脏相对摄取率Re和峰浓度之比Ce为指标,评价脂质体中三个药物的肝靶向性。结果：第一部分,建立同时测定Sal B.TSN.GA的HPLC方法,结果表明：Sal B在60～600μg·mL-1高浓度范围、8～120pg·mL-1低浓度范围,TSN在16～400μg·mL-1高浓度范围、0.4～30μg·mL-1低浓度范围,GA在30～600μg·mL-1高浓度范围、0.4～30μg·mL-1低浓度范围,均呈良好线性关系。加样回收率、精密度、稳定性均符合要求,证明该方法准确、灵敏。油水分配系数结果表明,酸性条件下Sal B的表观油水分配系数随pH降低有增大的趋势,pH=3.32时,Sal B体现一定的亲脂性。溶解度测定结果表明TSN和GA在PBS中溶解度均较低,属于难溶性药物。加入一定量表面活性剂后,溶解度有一定程度改善,其中0.5%SDS对二者增溶效果较明显。脂溶性药物包封率方法考察结果发现葡聚糖凝胶G-50（M）对脂质体有一定吸附,不适合GT-Lip包封率的测定,采用2000 r·min-1,离心5 min的低速离心法能使GT-Lip脂质体与游离药物有效分离,水溶性药物包封率测定选用高速离心.超滤法,该方法准确、方便、快捷。第二部分,第一步GT-lip处方和工艺优化部分最终选用天然大豆磷脂和胆固醇为膜材,薄膜分散法为制备方法,正交试验确定最优处方为SPC-CH质量比为6:1,SPC-TSN物质的量之比为30:1,SPC-GA物质的量之比为24：1。第二步将Sal B载入GT-lip选用主动载药法,Box-Behnken优化得到理论最优处方为：甘草次酸与磷脂质量比=0.08,丹酚酸B与磷脂质量比=0.12,缓冲液pH=3.3,最终制备得GTS-lip中Sal B.TSN.GA包封率分别为96.03+0.28%,80.63±0.91%,88.56±0.17%,粒径n=191.3±6.31 nm, Zata=11.6±0.35 mv,总体载药量为（13.48±0.69）%。冻干条件筛选结果显示选用9%蔗糖作为冻干保护剂对GTS一lip的冻干保护效果较好,可有效提高脂质体的稳定性,该冻干条件下脂质体复溶后分布均匀、粒度圆整,包封率较冻干前变化不大。体外释药结果表明GTS—lip中三个药物均体现出一定的缓释效果,且均符合Hixon-crowell方程模型。第三部分,体外细胞药效结果表明在一定浓度范围内,GTS-lip具有明显的HSC增殖抑制作用,该作用在24h处与脂质体给药浓度呈现一定的剂量依赖关系。与Mix组相比,脂质体组C1和C2两个浓度组48h抑制作用较同组24h分别提升了2.3倍和1.9倍。而Mix组24h和48h抑制作用变化不大,提示该现象可能与GTS-lip的缓释作用有关。第四部分,血浆和各组织匀浆样品均采用乙酸乙酯2次萃取法结合UPLC-PDA检测,能准确提取各样品中三个药物,并在5min之内出峰,该方法准确、快捷、高效。静注给药的药代动力学结果显示,与溶液组相比,脂质体组中Sal B的AUC由20.37±1.58 μgh/mL增至636.06±27.73μg·h/mL,MRT由0.28±0.01 h延长至1.97±0.09 h,TSN的AUC也有一定程度增加；组织分布结果显示相比于混合溶液,脂质体中三个药物在体内各脏器组织的分布行为均有所改变,尤其在肝脏中的分布均有不同程度增加。Sal B总体血药浓度和组织分布量大于Mix组,提示GTs-lip能有效增加Sal B的体内稳定性。GTs-lip组中TSN在肝、脾、脑组织中的分布均有较明显增加,以肝脏中分布量增加最为明显；肝脏组织分布曲线显示脂质体组各药物曲线下面积均明显高于混合溶液组,肝组织分布药动学参数显示Sal B、TSN、GA在肝组织中的AUC分别是普通溶液的2.11、9.07、2.59倍,Cmax分别是普通溶液的1.76、2.08、1.73倍,提示脂质体能够同时提高三种药物的肝靶向性。结论：本课题结合药物性质和疗效诉求,优选逆向薄膜分散法结合pH梯度法同时包载肝纤维化治疗药对丹参-甘草中不同极性的三个成分Sal B.TSN和GA,经过系统优化和验证,制备得到的复方脂质体工艺稳定、重现性好,三种药物包封率均达80%以上,粒径控制在100-200nm,实现了不同极性三组分共同包载于脂质体的工艺,且该工艺稳定可控。体外细胞药效研究表明GTS一lip能有效抑制人肝星状细胞增殖,且与混合溶液组相比呈现一定的缓释效果,该结果与其体外缓释释药特征结果呼应。药代动力学和组织分布结果显示相比于混合溶液,脂质体中水溶性成分丹酚酸B的稳定性有所提高,三个药物在体内各脏器组织的分布行为有所改变,尤其在肝脏中的分布均有不同程度增加,提示脂质体能够同时提高三种药物的肝靶向性。为GTS-lip靶向治疗肝纤维化提供了实验依据。
徐霞[10]（2014）在《硫化氢在SB203580影响肝星状细胞凋亡中的作用》文中认为目的：探讨硫化氢（H2S）、SB203580对大鼠肝星状细胞（HSC）增殖、凋亡的影响，研究P38MAPK信号通路在H2S影响大鼠肝星状细胞（HSC）增殖、凋亡中的作用，探讨H2S是否通过P38MAPK信号通路起到抗肝纤维化作用。方法：（1） HSC-T6细胞的培养：以10%胎牛血清DMEM（高糖）培养基培养，接种后6-8h细胞贴壁，24h-48h换液，72h增殖达生长面积90%消化传代，细胞传代周期稳定用于实验。（2） MTT法检测HSC-T6细胞的增殖：分对照组与实验组，实验组按照加药浓度梯度分组：NaHS组分别按照25umol/L、50umol/L、75umol/L、100μmol/L、200μmol/L浓度梯度给药，SB203580组分别按照10umol/L、25umol/L、50umol/L、75umol/L、100umol/L的浓度梯度给药，均干预48h，加入MTT20μl暗处反应4h，加入DMSO150μl终止反应，使用酶标仪于570nm波长处检测各孔吸光度（A）值。（3）流式细胞术检测H2S与SB203580对HSC-T6细胞凋亡的影响：分5组，正常对照组、DMSO组、NaHS50μmol/L组、SB20358075μmol/L组（SB组）、SB20358075umol/L+NaHS50umol/L组（SB+NaHS组），采用流式细胞仪经Annexin V-FITC/PI双染检测各组细胞HSC-T6细胞的凋亡率；同等实验条件，Hoechst33342染色，倒置荧光显微镜下观察并计算HSC-T6细胞的凋亡率。（4）逆转录PCR法检测HSC-T6细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达：实验分对照组、DMSO组、NaHS组、SB组、SB+NaHS组，提取HSC-T6细胞中总RNA，逆转录PCR法检测细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达。（5）Western blot法检测HSC-T6细胞中P-P38、Caspase-3蛋白的表达：实验分对照组、DMSO组、NaHS组、SB组、SB+NaHS组，Westernblot法检测细胞中P-P38、Caspase-3蛋白的表达。结果：（1）HSC生长良好，总体死亡率<5%，倒置显微镜下观察细胞形态，可见NaHS组细胞密度增大，SB组细胞增殖不明显，可见凋亡细胞。（2）按实验组干预HSC-T6细胞培养48h后，与对照组相比，低浓度NaHS （25umol/L、50umol/L、75umol/L）促进HSC-T6细胞增殖，NaHS50umol/L促细胞增殖显着，差异有统计学意义（P<0.05）；SB203580抑制HSC-T6细胞增殖，并促进细胞凋亡，差异有统计学意义（P<0.05）。（3）低浓度NaHS对细胞凋亡无影响，SB203580可显着诱导HSC细胞凋亡，与NaHS联合促细胞凋亡增强，差异有统计学意义（P<0.05）。（4）NaHS使HSC-T6细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达增强，SB203580促使HSC-T6细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达含量减少，二者联合使细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达量明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。（5）NaHS使HSC-T6细胞中P-P38、Caspase-3蛋白表达增强，二者联合P-P38蛋白表达减少、Caspase-3蛋白表达增强。结论：（1） H2S通过激活P38MAPK信号通路促进肝星状细胞的增殖。（2） P38MAPK信号通路被阻断后通过调节肝星状细胞的凋亡，进而延缓肝纤维化的发展。（3） H2S在P38MAPK信号通路被抑制后使刺激的肝星状细胞增殖受到抑制，凋亡得到促进。通过参与调节肝星状细胞中Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA及P-P38、Caspase-3蛋白的表达，从而起到抗肝纤维化的作用。
二、Wortmannin对离体肝星状细胞增殖的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Wortmannin对离体肝星状细胞增殖的影响（论文提纲范文）
（1）螺旋藻藻蓝蛋白体内外抗肝纤维化机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 肝脏疾病的研究进展 |
| 1.1.1 肝脏疾病的流行现状 |
| 1.1.2 慢性肝病的发生及发展过程 |
| 1.1.3 肝星状细胞与肝纤维化 |
| 1.1.4 肝脏疾病与肠道微生物 |
| 1.1.5 藻类活性物质与肝损伤 |
| 1.2 藻蓝蛋白的生理活性及其在医药方面的应用 |
| 1.2.1 藻蓝蛋白的结构 |
| 1.2.2 藻蓝蛋白的安全性及生物利用度 |
| 1.2.3 藻蓝蛋白的生理活性 |
| 1.2.4 藻蓝蛋白的保肝效果 |
| 1.2.5 藻蓝蛋白的调节肠道微生物效果 |
| 1.3 本论文研究内容及意义 |
| 第2章 藻蓝蛋白对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖与凋亡的影响 |
| 2.1 实验材料与仪器试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂与耗材 |
| 2.1.3 仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞的培养方法 |
| 2.2.2 藻蓝蛋白对细胞的渗透性观察 |
| 2.2.3 细胞内荧光强度的观察 |
| 2.2.4 细胞增殖的检测 |
| 2.2.5 细胞总RNA的提取 |
| 2.2.6 细胞内凋亡相关蛋白和纤维化标志物的检测 |
| 2.2.7 统计学方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 藻蓝蛋白进入HSC-T6细胞的观察 |
| 2.3.2 藻蓝蛋白对肝星状细胞增殖的影响 |
| 2.3.3 藻蓝蛋白对肝星状细胞影响的形态学观察 |
| 2.3.4 藻蓝蛋白对肝星状细胞纤维化标志物及凋亡标志物表达的影响 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 藻蓝蛋白缓解CCl_4致大鼠肝纤维化的研究 |
| 3.1 实验材料与仪器试剂 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.0 实验动物伦理 |
| 3.2.1 实验动物分组及干预 |
| 3.2.2 样本采集 |
| 3.2.3 HE和Masson染色 |
| 3.2.4 大鼠肝脏总RNA的提取 |
| 3.2.5 大鼠肝脏组织中纤维化标志物的检测 |
| 3.2.6 肠道微生物的高通量测序 |
| 3.2.7 统计学方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 大鼠体重变化 |
| 3.3.2 大鼠肝脏病理分析 |
| 3.3.3 PC对CCl_4诱导大鼠肝纤维化标志物的影响 |
| 3.3.4 PC对大鼠肠道微生物的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 主要创新点 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 常用缩略词表 |
| 附录2 动物实验福利伦理审查申请表 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（2）从抑制肝星状细胞活化角度探讨甘参复方抗肝纤维化的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 肝纤维化发病机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药治疗肝纤维化的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 技术路线图 |
| 实验一 甘参复方对胆汁淤积型肝纤维化大鼠肝组织肝纤维化程度及ERK磷酸化的影响 |
| 材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验二 甘参复方对肝星状细胞活化的影响 |
| 材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验三 甘参复方对肝星状细胞NF-ΚB/ERK通路的影响 |
| 材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（3）蛇床子素促成骨作用及代谢多态性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、蛇床子素与骨调节靶点相互作用的分子模拟研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 分子对接 |
| 1.1.2 治疗靶点数据库 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.2 结果及讨论 |
| 1.3 小结 |
| 二、蛇床子素对人成骨样MG-63 细胞的作用 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验相关试剂制备 |
| 2.1.3 细胞培养 |
| 2.1.4 细胞体外增殖能力的测定 |
| 2.1.5 蛇床子素对细胞碱性磷酸酶活性影响的测定 |
| 2.1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.1.7 RT-PCR |
| 2.1.8 免疫印迹细胞实验 |
| 2.1.9 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 蛇床子素对MG-63 细胞增殖能力的影响 |
| 2.2.2 蛇床子素对MG-63 细胞分化能力的影响 |
| 2.2.3 蛇床子素对细胞凋亡的影响 |
| 2.2.4 蛇床子素对OPG,RANKL,Osterix表达的影响 |
| 2.2.5 蛇床子素对P-ERK/ERK,P-AKT/AKT,β-catenin蛋白表达的调节 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、阻断剂对蛇床子素调节作用的阻断 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂的配制 |
| 3.1.3 细胞培养 |
| 3.1.4 细胞体外增殖能力的测定 |
| 3.1.5 碱性磷酸酶活性的测定 |
| 3.1.6 RT-PCR |
| 3.1.7 免疫印迹细胞实验 |
| 3.1.8 统计分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 阻断剂对蛇床子素增殖分化作用的阻断 |
| 3.2.2 阻断剂对蛇床子素调节OPG,RANKL,Osterix表达的阻断 |
| 3.2.3 阻断剂对蛇床子素调节的信号蛋白表达的阻断 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、蛇床子素对3种CYP2C9 基因型及4种CYP2D6 基因型药物代谢的影响 |
| 前言 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 样品配制 |
| 4.1.4 探针底物的LC-MS/MS方法测定 |
| 4.1.5 酶反应研究 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 探针药物的LC-MS/MS方法测定及验证 |
| 4.2.2 酶反应条件确定 |
| 4.2.3 代谢物标准曲线 |
| 4.2.4 蛇床子素对底物酶代谢的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 总结和展望 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 蛇床子素药理作用研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）SND1延缓CCl4诱导的转基因小鼠的肝纤维化进程但促进肝癌的发生及发展（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 对象和方法 |
| 1.1 生物信息学数据库及实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液、缓冲液及培养基 |
| 1.4 主要仪器、设备 |
| 1.5 实验方法及流程 |
| 结果 |
| 2.1 人正常肝/肝纤维化/肝癌临床样本中的基因表达差异分析 |
| 2.2 SND1缓解CCl_4诱导的小鼠肝功能损伤并延缓肝纤维化进程 |
| 2.3 SND1抑制肝星状细胞的活化 |
| 2.4 SND1通过Hippo通路影响CTGF的表达 |
| 2.5 SND1可能通过调控Kupffer细胞促进肝癌的发生 |
| 讨论 |
| 3.1 SND1在肝病中的研究现状 |
| 3.2 SND1蛋白在肝纤维化中的作用 |
| 3.3 四氯化碳造模后 SND1 蛋白在肝实质细胞中的表达变化 |
| 3.4 SND1可能通过调控Kupffer细胞促进肝癌的发生 |
| 3.5 SND1在肝脏不同细胞成分及肝病不同病变阶段中的作用 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 肝星状细胞活化的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）氧化苯砷抗肝纤维化作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略语 |
| 绪论 |
| 第一部分 PAO对HSC-T6活化状态的影响 |
| 引言 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验细胞 |
| 1.1.2 实验所用化合物 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 试剂配制 |
| 1.1.5 实验耗材及仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养、传代及冻存 |
| 1.2.2 细胞处理及分组 |
| 1.2.3 MTT法检测细胞毒性 |
| 1.2.4 Western blot检测PAO处理后α-SMA的表达变化 |
| 1.2.5 Realtime PCR检测α-SMA及Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达变化 |
| 1.2.6 统计学处理 |
| 2.结果 |
| 2.1 PAO的毒性评估(即PAO对HSC-T6细胞存活率的影响) |
| 2.2 PAO对HSC-T6活化状态的影响 |
| 2.2.1 PAO对HSC-T6细胞α-SMA表达的影响 |
| 2.2.2 PAO对HSC-T6细胞α-SMA及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达的影响 |
| 3.讨论 |
| 第二部分 PAO对原代HSC培养激活的影响及机制研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验所用化合物 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 试剂配制 |
| 1.1.5 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 大鼠原代HSC的分离培养及形态鉴定 |
| 1.2.2 Western-blot检测培养过程中原代HSC的α-SMA表达变化 |
| 1.2.3 Western-blot检测PAO处理后原代HSC中α-SMA的表达变化 |
| 1.2.4 Realtime-PCR检测α-SMA及COLI mRNA表达 |
| 1.2.5 Western-blot检测PAO对HSC中PI4KⅢ及p-Akt表达影响 |
| 1.2.6 统计学处理 |
| 2.结果 |
| 2.1 大鼠原代HSC活化状态的评估及鉴定 |
| 2.1.1 原代HSC的得率及形态学鉴定 |
| 2.1.2 原代HSC培养过程中α-SMA表达变化 |
| 2.2 PAO对原代HSC体外激活的抑制作用 |
| 2.2.1 Western-blot检测PAO处理后α-SMA的表达变化 |
| 2.2.2 Realtime-PCR检测α-SMA、COLI mRNA表达变化 |
| 2.3 PAO作用的分子机制研究 |
| 2.3.1 Western blot检测PI4KⅢα的表达 |
| 2.3.2 Western blot检测Akt及p-Akt的表达 |
| 3.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（6）EPAC对乙醛诱导的大鼠肝星状细胞增殖和激活的作用（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（7）桃红四物汤含药血清对离体细胞影响研究概况（论文提纲范文）
| 1骨细胞 |
| 2血管内皮细胞及平滑肌细胞 |
| 3其它细胞 |
| 4小结与展望 |
（8）基于鳖甲功效的先导化合物的研究（Ⅲ）-络合法分离鳖甲寡肽探讨及鳖甲七肽抗酒精性肝损伤活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 衍生化技术在药学研究方面的应用 |
| 1 衍生化的定义 |
| 2 衍生化目的 |
| 3 衍生化反应类型 |
| 4 衍生反应要求 |
| 5 衍生化的形式 |
| 6 衍生化试剂分类 |
| 7 应用 |
| 8 展望 |
| 第二节 HPLC-MS-MS分析蛋白类一级结构研究进展 |
| 1 前言 |
| 2 样品电离方式 |
| 3 接口形式 |
| 4 应用 |
| 5 展望 |
| 第三节 金属离子络合法分离化合物研究进展 |
| 1 作用原理 |
| 2 载体 |
| 3 配体 |
| 4 金属离子 |
| 5 吸附与解吸 |
| 6 优点及影响条件 |
| 7 应用 |
| 8 展望 |
| 第四节 鳖甲复方治疗肝纤维化机理及临床治疗肝病概述 |
| 1 肝纤维化机理 |
| 2 治疗肝病鳖甲复方 |
| 3 讨论 |
| 4 展望 |
| 第五节 肽类细胞实验研究进展 |
| 1 神经细胞 |
| 2 免疫细胞 |
| 3 肿瘤细胞 |
| 4 肝星状细胞 |
| 5 总结 |
| 前言 |
| 第二章 鳖甲寡肽的分离研究 |
| 第一节 HPLC-丹磺酰氯衍生化联用分离鳖甲寡肽 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节 HPLC-MS/MS对混合样品中寡肽的指认 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三节 硫酸铜—硅胶络合分离方法用于鳖甲寡肽分离探究 |
| (一) 硫酸铜溶液处理的4种填料对鳖甲寡肽的分离效果比较 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 总结 |
| (二) 改性硅胶分离鳖甲寡肽方法与结果 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 总结 |
| (三) 硫酸铜络合薄层分离鉴定21种氨基酸探究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| (四) 硫酸铜硅胶薄层板分离寡肽类效果探究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 鳖甲寡肽类的活性研究 |
| 第一节 鳖甲寡肽对4种肝脏和2种免疫相关细胞增殖及酒精损伤L02的治疗作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节 鳖甲七肽对急性酒精性肝损伤保护作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三节 鳖甲七肽对酒精诱导的小鼠慢性肝损伤的实验研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）丹参酮ⅡA、丹酚酸B与甘草次酸复方脂质体构建及体内外评价研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 文献综述 |
| 第一篇 丹参、甘草配伍治疗肝纤维化研究进展 |
| 第二篇 丹参酮ⅡA、丹酚酸B、甘草次酸及其抗肝纤维化研究概况 |
| 第三篇 肝靶向复方脂质体设计思路的研究进展 |
| 前言 |
| 实验部分 |
| 第一篇 GTS-lip处方前研究 |
| 1 药物HPLC同时检测方法学考察 |
| 1.1 仪器与材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 2 不同pH条件下Sal B表观油水分配系数测定 |
| 2.1 方法 |
| 2.2 结果 |
| 3 TSN与GA在不同介质中的溶解度测定 |
| 3.1 方法 |
| 3.2 结果 |
| 4 脂质体包封率测定方法建立 |
| 4.1 方法 |
| 4.2 结果 |
| 5 讨论 |
| 5.1 油水分配系数 |
| 5.2 GA和TSN包封率测定方法 |
| 5.3 高速离心-超滤法测定Sal B包封率 |
| 5.4 超滤膜对药物的吸附 |
| 6 小结 |
| 第二篇 GTS-lip的制备及其药剂学性质研究 |
| 1 脂溶性药物丹参酮ⅡA、甘草次酸包载工艺优化 |
| 1.1 仪器与材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 2 水溶性药物丹酚酸B包载工艺优化 |
| 2.1 方法 |
| 2.2 结果 |
| 3 Box-Behnken法优化GTS-lip处方 |
| 3.1 方法 |
| 3.2 结果 |
| 4 GTS-lip冻干工艺考察 |
| 4.1 方法 |
| 4.2 结果 |
| 5 GTS-lip药剂学性质研究 |
| 5.1 方法 |
| 5.2 结果 |
| 6 讨论 |
| 6.1 薄膜分散法包封脂溶性药物 |
| 6.2 Sal B的主动载药 |
| 6.3 Box-Behnken效应面优化法 |
| 6.4 脂质体冻干 |
| 7 小结 |
| 第三篇 GTS-lip对肝星状细胞的增殖抑制研究 |
| 1 仪器与材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 药品 |
| 1.3 细胞 |
| 1.4 试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 试剂与药液配制 |
| 2.2 HSC细胞复苏 |
| 2.3 给药 |
| 3 结果 |
| 3.1 GTS-Lip对人肝星状细胞增殖的影响 |
| 3.2 HSC形态监测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四篇 GTS-lip小鼠体内药代动力学与组织分布研究 |
| 1 GTS-lip小鼠体内药代动力学研究 |
| 1.1 仪器与材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 2 GTS-lip小鼠体内组织分布研究 |
| 2.1 仪器与材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 分析方法的建立 |
| 3.2 样品前处理 |
| 3.3 GTS-lip中三种药物的药动学及组织分布特征 |
| 4 小结 |
| 全文总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 博士期间发表文章情况 |
| 附图 |
（10）硫化氢在SB203580影响肝星状细胞凋亡中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词中英文对照 |
| 前言 |
| 第一部分 硫化氢在 SB203580 影响肝星状细胞（HSC-T6）增殖、凋亡中的作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 硫化氢在 P38MAPK 信号通路对大鼠肝星状细胞（HSC-T6）凋亡中的作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、Wortmannin对离体肝星状细胞增殖的影响（论文参考文献）
- [1]螺旋藻藻蓝蛋白体内外抗肝纤维化机理研究[D]. 翟诗翔. 中国科学院大学(中国科学院烟台海岸带研究所), 2020(02)
- [2]从抑制肝星状细胞活化角度探讨甘参复方抗肝纤维化的作用机制[D]. 张楚焌. 北京中医药大学, 2019(04)
- [3]蛇床子素促成骨作用及代谢多态性研究[D]. 孙静. 天津医科大学, 2019(02)
- [4]SND1延缓CCl4诱导的转基因小鼠的肝纤维化进程但促进肝癌的发生及发展[D]. 钱宝鑫. 天津医科大学, 2018(01)
- [5]氧化苯砷抗肝纤维化作用及机制研究[D]. 仝艳艳. 上海交通大学, 2016(03)
- [6]EPAC对乙醛诱导的大鼠肝星状细胞增殖和激活的作用[D]. 杨岩. 安徽医科大学, 2016(02)
- [7]桃红四物汤含药血清对离体细胞影响研究概况[J]. 付晓烨,康泰,吴景东. 实用中医内科杂志, 2015(02)
- [8]基于鳖甲功效的先导化合物的研究（Ⅲ）-络合法分离鳖甲寡肽探讨及鳖甲七肽抗酒精性肝损伤活性研究[D]. 徐士勋. 北京中医药大学, 2014(09)
- [9]丹参酮ⅡA、丹酚酸B与甘草次酸复方脂质体构建及体内外评价研究[D]. 林珈好. 北京中医药大学, 2014(08)
- [10]硫化氢在SB203580影响肝星状细胞凋亡中的作用[D]. 徐霞. 石河子大学, 2014(03)