论文摘要
兔病毒性出血症（RHD）与兔粘（黏）液瘤病（Myxomatosis）是我国《兔产地检疫规程》、《兔屠宰检疫规程》规定检疫对象中的两种病毒性疫病。RHD和myxomatosis分别由兔出血症病毒（RHDV）与兔粘（黏）液瘤病毒（Rabbit Myxomavirus,RMYXV）感染引起,严重影响着我国和世界养兔业的健康发展,尤其RHD死亡率可高达90%以上。近年来,在产地检疫和屠宰检验检疫发现异常情况下分子生物学检测技术在确诊中发挥的重要作用愈发显著。在常见的分子生物学检测技术中,从技术体系成熟度、人才专业培养和生产企业操作角度讲,普通PCR检测技术与荧光定量PCR技术、LAMP等检测技术相比,更具有一定的实用性和发展潜力。为建立用于兔出血症病毒（RHDV）与兔粘（黏）液瘤病毒（RMYXV）的快速检测诊断方法,根据GenBank已公布的RHDV VP60基因和RMYXV M143R基因（GenBank Access No.HM104695.1）设计合成2对特异性引物和10条搭桥引物,分别采用RT-PCR和搭桥PCR技术获取RHDV VP60基因和RMYXV M143R基因中的保守区片段,经过PCR产物纯化回收、连接转化和挑菌、鉴定构建重组质粒pMD-19T-RHDV、pMD-19T-RMYXV,并以构建的两种重组质粒为模板,经过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验,以及人工感染RHDV样品和临床样品的初步检测应用,对RHDV与RMYXV的二重RT-PCR检测方法进行了探索。结果显示建立的RHDV与RMYXV二重RT-PCR方法具有良好的敏感性和特异性,采集样品后分别提取RNA和DNA,采用反转录试剂盒进行RNA反转录（RT反应）获得cDNA与提取的DNA在同一PCR反应管中经过确定的反应程序（95℃预变性5min;95℃40s,56.5℃30s,72℃30s,35个循环;72℃延伸10min）可分别扩增出RHDV和RMYXV的靶基因片段大小为294 bp和440 bp,RHDV与RMYXV的检测限度分别为150和200个拷贝的靶基因片段,而pGM-T-EBHSV（本实验室构建）、兔巴氏杆菌、兔源大肠杆菌和沙门氏菌等病原（或基因）的扩增结果均为阴性。初步应用检测结果显示人工感染样品的RHDV检出率为100%（6/6）,15份临床检样RHDV和RMYXV检测结果均为阴性。本研究为兔产地检疫、屠宰检验检疫以及临床诊断中兔出血症病毒（RHD）与兔粘（黏）液瘤病毒（RMYXV）的快速检测提供了一种可靠参考方法和技术储备。需要说明的是,因近年来我国尚无发现兔粘液瘤病的公开报道,本研究采用搭桥PCR技术进行了RMYXV检测靶基因片段的合成,解决了操作病毒过程中生物安全问题。与国内己报道的关于RHDV和RMYXV检测技术相比,本研究可以在同一PCR管中检测两种病毒,因此更加方便快捷。
论文目录
文章来源
类型: 国内会议
作者: 杨泽晓,王印,姚学萍,晏仕强,王翔,候景,张克山
关键词: 兔出血症病毒,兔粘液瘤病毒,搭桥
来源: 中国畜牧兽医学会兽医食品卫生学分会第十五次学术交流会 2019-12-12
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,畜牧与动物医学
单位: 四川农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病与人类健康四川省重点实验室
分类号: S852.65
DOI: 10.26914/c.cnkihy.2019.033692
页码: 74-75
总页数: 2
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