组蛋白乙酰化介导生命早期高温刺激产生的持续应激反应和长寿效应

论文摘要

衰老对生物是一个有害的过程,其特征主要表现为细胞和组织的功能随时间进行性降低,该现象在生命周期的末期尤为明显。然而衰老的速度常常能够被生物个体早期的一些经历所改变,例如,在生命早期给予适当的压力刺激能够延长一些模式动物的寿命,预示早期的温和刺激能够对机体的健康产生长期的有益影响,而相关的调控机制却鲜有报道。温度是一个重要的环境因素,能够对生物的代谢和衰老产生重要影响。较高的环境温度不利于生物的生存,高温能够引发机体产生胁迫反应,并能缩短生物个体的寿命。秀丽隐杆线虫（C.elegans,简称线虫）作为一个重要的模式生物,被广泛用于在生物体水平上进行温度调控的相关研究。之前有报道称,早期的高温刺激能够诱导线虫产生兴奋效应,在发育阶段将线虫置于高温环境中能够延长其寿命。本文中,我们以秀丽隐杆线虫作为模式生物,通过相关实验,揭示了早期高温影响线虫健康并延长寿命的分子机制,主要研究结果如下:1.高温能够激活线虫的先天免疫和解毒反应当生物在受到一定的压力刺激时,体内的应激反应会被激活,而抗压能力的提高通常与个体寿命的延长有着密切联系,因此,我们首先检测了高温对线虫应激反应相关基因的影响。通过RNA-seq,我们对15℃和25℃两个温度下线虫的转录组进行了比较。功能注释分析显示,许多参与应激反应的基因能够被高温诱导上调表达,尤其是先天免疫和解毒代谢相关的基因。同时,我们随机挑取免疫和解毒相关的基因进行了qPCR验证,发现它们确实能被高温诱导出现显著上调表达。随后利用免疫报告因子T24B8.5p::GFP在活体线虫上对先天免疫进行跟踪检测。T24B8.5是p38/ATR-7的靶标基因,p38/ATR-7能够被p38/PMK-1磷酸化而激活线虫的先天免疫反应。将L1期的幼虫置于25℃饲养至成虫D1期,GFP能够被高温强烈诱导,而且经qPCR检测,线虫内源性T24B8.5的转录水平被提升一百倍以上。与15℃中饲养的线虫相比,发育阶段经高温刺激的线虫表现出更高的抗病原体感染和抗氧化能力,表明高温激活了先天免疫和解毒反应,进而提升了线虫的防御能力。2.高温对线虫应激反应和长寿的诱导作用需要PMK-1进化上高度保守的p38/PMK-1促分裂原活化蛋白激酶是线虫免疫防御系统的重要组成部分,能够调控线虫先天免疫基因和解毒相关基因的表达。经检测发现,线虫PMK-1的磷酸化水平能够被高温显著提高,而且pmk-1 RNAi能够抑制25℃高温对免疫报告因子T24B8.5p::GFP的激活作用,同时,qPCR检测发现线虫内源性T24B8.5和免疫基因F49F1.7、C32H11.4的转录水平也被pmk-1 RNAi抑制。此外,pmk-1突变能大幅缩短发育阶段经25℃高温刺激的线虫的寿命。所以,PMK-1介导了25℃高温对线虫寿命的延长作用,该过程可能通过激活线虫的先天免疫和解毒反应参与其中。3.早期的高温刺激能诱导线虫产生持续的应激反应仅在发育阶段将线虫置于25℃的环境中能够延长寿命,表明早期的热刺激能够对线虫的健康产生长期的有益影响。考虑到抗压能力与寿命有着紧密关联,我们进一步检测了早期的高温刺激能否对线虫的应激反应产生持续影响。将L1期的幼虫在25℃下饲养到成虫D1,然后转至15℃,在去除高温刺激条件后,我们发现免疫报告因子T24B8.5p::GFP在成虫D4（代表线虫的中年期）和D7期（代表线虫的老年期）依旧保持高表达水平,而15℃对照组的GFP则始终处于低表达状态。qPCR进一步验证了T24B8.5,F494F1.7和cyp-37B1的转录情况,发现这些应激反应基因在恢复温度后一直维持较高的转录水平。而且,发育阶段经25℃刺激的线虫在去除高温刺激条件数天后,依旧能够保持较强的病原体抗性和氧化应激能力。说明发育阶段的25℃高温刺激能够诱导线虫产生长期持续的应激反应。4.CBP-1介导高温对线虫应激反应的持续激活环境因素对生物的长期调控作用通常有表观遗传的参与和介导,因此,我们对已知的可能参与线虫表观遗传调控的基因进行了RNAi文库筛选,结果发现,对编码组蛋白乙酰基转移酶的cbp-1进行RNAi后能够完全消除高温对T24B8.5p::GFP的激活作用。同时,cbp-1 RNAi能够消除25℃高温对线虫内源性先天免疫基因T24B8.5,F49F7.1和C32H11.4的上调表达作用,以及高温对线虫抗病原体感染和氧化应激能力的提升作用。而且,在成虫D1期去除高温刺激后,cbp-1 RNAi能够消除25℃高温对T24B8.5p::GFP的持续诱导作用,线虫内源性T24B8.5的持续表达同样被抑制。这些结果表明,高温对线虫应激反应的长期持续性激活作用依赖于CBP-1。5.组蛋白乙酰化参与高温对应激反应基因的调控组蛋白乙酰化水平的提高通常能够引起基因的上调表达。由于组蛋白乙酰基转移酶CBP-1在高温诱导应激反应激活的过程中发挥重要作用,预示着组蛋白的乙酰化可能参与到高温对线虫的调控。与应激反应基因的表达模式一致,25℃高温能够显著提高线虫内组蛋白的乙酰化水平,而这一提升作用能够被cbp-1 RNAi和pmk-1突变彻底消除。此外,组蛋白的乙酰化水平在去除高温刺激条件后依旧能够长期保持较高状态。我们进一步通过CHIP-qPCR对乙酰化组蛋白在应激反应基因启动子区域的聚集情况进行了分析,并证实了高温能够提高乙酰化组蛋白在应激反应基因启动子区域的水平。因此,我们认为高温促进应激反应基因的持续上调表达是通过提高启动子区域的乙酰化组蛋白来实现的。6.SWSN-1参与早期高温对应激反应的调控SWSN-1是在筛选过程中发现的另一个表观遗传调控因子,swsn-1 RNAi能抑制25℃高温对T24B8.5p::GFP的诱导表达作用。swsn-1编码SWI/SNF复合体的一个亚基,而SWI/SNF是一个重要的染色质重塑复合体,能够取代或替换核小体并解开染色质。对编码该复合体亚基的基因进行RNAi后,我们发现部分基因参与到25℃高温对T24B8.5p::GFP的激活作用,该现象表明SWI/SNF在高温对应激反应的调控中发挥重要作用。此外,swsn-1 RNAi能够消除高温对线虫病原体抗性和氧化应激能力的提升作用。7.表观遗传因子介导早期高温信号的体细胞记忆和寿命的延长机制基于前期的研究结果,我们认为,被早期高温诱导并持续增强的防御能力可有效应对衰老过程对机体带来的损伤,如细胞活性氧物质的提升,以及肠道菌群等病原体对线虫渗透感染能力的增强等。在进一步的验证中,我们分别对线虫的cbp-1和swsn-1进行基因沉默,对pmk-1进行功能敲除,然后将发育阶段经25℃高温刺激的线虫,在成虫D1时期转移到15℃,并展开寿命分析实验。结果发现,cbp-1RNAi能够完全消除高温对线虫寿命的延长作用,swsn-1 RNAi也能部分缩短被高温诱导延长的寿命,而作为介导高温对应激反应和组蛋白乙酰化调控的重要基因,pmk-1突变能够彻底消除高温刺激对线虫寿命的延长作用。该结果表明,通过免疫调控因子PMK-1,以及表观遗传调控因子CBP-1和SWSN-1的介导,早期的高温刺激诱导机体产生持续增强的应激反应,能够对线虫的健康带来长期的有益影响,并延长线虫的寿命。8.FAT-6/7和油酸参与高温对线虫应激反应的调控RNA-seq结果显示,大量脂质代谢相关的基因能够被25℃高温诱导调控,表明脂质可能在高温对线虫的调控中发挥作用。随后我们对参与线虫脂质代谢相关的基因进行了RNAi筛选,结果发现对编码Δ9脂肪酸去饱和酶的fat-6/7进行基因沉默后,25℃高温对T24B8.5p::GFP的激活作用被完全抑制,同时能够消除早期高温刺激对线虫抗病原体感染和氧化应激能力的提升作用。而且被高温诱导提升的组蛋白乙酰化水平也能被fat-6/7 RNAi大幅降低,表明FAT-6/7可能通过组蛋白乙酰化对线虫的应激反应进行调控。接下来我们检测是否存在某些特殊的脂肪酸代谢产物介导了FAT-6/7的调控作用。在对参与线虫脂肪酸饱和与去饱和作用的基因进行RNAi筛选后,我们并没有发现能够影响高温对T24B8.5p::GFP激活作用的基因。然而通过对fat-6/7 RNAi处理的线虫回补油酸（OA,FAT-6/7的代谢产物）,能恢复高温对T24B8.5p::GFP的激活作用,以及对线虫病原体抗性和氧化应激能力的提升作用。这些结果表明OA介导了高温对线虫应激反应的诱导作用。9.FAT-6/7通过HSF-1对线虫的组蛋白乙酰化和应激反应进行调控热休克蛋白1（HSF-1）作为一个重要的热应激转录因子,在高温环境下对线虫的应激反应和寿命起重要调控作用。经检测发现,HSF-1的报告因子hsp-16.2p::GFP能够被25oC高温诱导激活,而这一现象可以被fat-6/7 RNAi消除,说明HSF-1能够被上游的FAT-6/7调控。进一步研究发现,hsf-1 RNAi能抑制25oC高温对T24B8.5p::GFP的激活作用,并消除了高温对线虫抗病原体感染能力的提升作用。同时,hsf-1 RNAi能够大幅降低被25oC高温诱导提升的组蛋白乙酰化水平。说明HSF-1在FAT-6/7的下游,介导了早期高温对线虫表观遗传因子的调控和先天免疫能力的调控。pmk-1突变并不会对hsp-16.2p::GFP的高温激活作用产生影响,而hsf-1RNAi却能降低被高温诱导提升的PMK-1的磷酸化水平,表明HSF-1能够对下游的PMK-1进行调控,而pmk-1突变同样能够消除25oC高温对组蛋白乙酰化的提升作用。因此,我们揭示了一条如下的线性调控通路:早期的25oC高温信号经过FAT-6/7（OA）—HSF-1—PMK-1逐级传递,通过影响组蛋白的乙酰化水平,来实现高温刺激对线虫应激反应和衰老的长期调控。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 1 绪论
•   1.1 引言
•   1.2 文献综述
•     1.2.1 秀丽隐杆线虫与衰老调控
•     1.2.2 秀丽隐杆线虫中已知的衰老代谢调控通路简述
•   1.3 研究背景
•     1.3.1 环境因素对寿命的调控
•     1.3.2 表观遗传参与环境压力介导的衰老调控
•     1.3.3 p38/PMK-1 MAPK介导的免疫信号通路与衰老调控
•     1.3.4 脂质与衰老调控
•   1.4 研究目的与意义
•   1.5 研究的主要内容与技术路线
•     1.5.1 研究内容
•     1.5.2 技术路线
• 2 组蛋白乙酰化介导高温对应激反应和长寿的诱导作用
•   2.1 实验材料与方法
•     2.1.1 实验涉及的线虫和细菌品系
•     2.1.2 实验涉及引物统计
•     2.1.3 主要试剂及配置
•     2.1.4 主要实验仪器
•     2.1.5 方法与步骤
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 早期高温能够激活秀丽隐杆线虫的先天免疫反应和解毒反应
•     2.2.2 PMK-1 是高温诱导秀丽隐杆线虫产生应激反应和延长寿命的必要条件
•     2.2.3 早期高温能诱导秀丽隐杆线虫产生持续的应激反应
•     2.2.4 CBP-1 介导了高温对秀丽隐杆线虫应激反应的激活
•     2.2.5 CBP-1介导了早期高温对秀丽隐杆线虫应激反应的持续诱导作用
•     2.2.6 组蛋白乙酰化调控应激反应基因在高温环境中的表达
•     2.2.7 SWSN-1 能够对秀丽隐杆线虫在高温下的应激反应进行调控
•     2.2.8 高温能够诱导秀丽隐杆线虫对其产生表观遗传记忆,进而延长线虫寿命
•     2.2.9 高温能够重塑秀丽隐杆线虫的脂肪酸代谢
•     2.2.10 FAT-6/7 和油酸参与到高温对秀丽隐杆线虫应激反应的调控
•     2.2.11 FAT-6/7 通过HSF-1 来调节秀丽隐杆线虫的组蛋白乙酰化和应激反应
•   2.3 讨论
• 3 结论与展望
• 参考文献
• 附录
•   附录表1.抗病原体感染实验统计结果
•   附录表2.抗氧化和热应激实验统计结果
•   附录表3.寿命分析实验统计结果
•   附录表4.RNAi筛选基因统计
•   博士期间发表论文及参与课题
•   学位论文数据集
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 周磊

导师: 庞珊珊

关键词: 秀丽隐杆线虫,高温,应激反应,表观遗传,长寿

来源: 重庆大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 重庆大学

分类号: Q41

总页数: 126

文件大小: 5185K

下载量: 56