一、RNAi的曲折经历与发展（论文文献综述）
徐金瑞[1]（2021）在《酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶1在BCG感染小鼠及巨噬细胞中的作用研究》文中研究说明结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,Mtb）引起的感染性疾病,是临床上最棘手的疾病之一,也是单一传染病导致的主要死亡原因,位列全球十大死亡原因之一。作为一种典型的胞内菌,Mtb可通过多种策略抑制或逃避先天免疫和适应性免疫,并通过调节宿主细胞的功能,在胞内微环境中得以生存。因此,更好地理解Mtb与宿主（细胞）相互作用的分子机制对于确定结核病治疗的新靶点至关重要。本研究首先对牛结核分枝杆菌减毒株BCG（Bacillus Calmette-Gue’rin）感染的牛原代肺泡巨噬细胞（primarybovinealveolarmacrophages,PBAMs）进行了转录组测序（RNA-Seq）及生物信息学分析。在此基础上,以筛选出的酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶1（Acyl-CoA:cholesterol acyltransferasesl,ACAT1）为研究对象,在细胞水平上分别对过表达ACAT1或干扰ACAT1的RAW264.7稳转细胞株和K604抑制剂处理的RAW264.7细胞或PBAMs经BCG感染,在动物水平分别对小鼠肺组织过表达ACAT1或腹腔注射K604抑制ACAT1并经BCG感染后,对细胞凋亡、炎性反应、细胞自噬相关指标进行检测,旨在从细胞水平与动物个体水平揭示ACAT1在结核分枝杆菌感染中的免疫调控作用。研究结果如下:1.对BCG感染12h后的PBAMs进行RNA-Seq分析结果表明:ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporters）家族成员及ACAT1基因表达下调,RT-PCR验证了上述研究结果。不同感染时间的Western blot检测结果显示:ACAT1、ABCG1、ABCA1的表达先下降后上升,ABCA5和ABCA6的表达逐渐下降,细胞内胆固醇含量变化趋势与之相反。以上结果表明,在BCG感染巨噬细胞初期,可通过下调ABC转运蛋白及ACAT1,从而使胞内胆固醇水平升高。2.分别从细胞水平和动物水平研究了 ACAT1对BCG诱导细胞凋亡的调控作用。①细胞水平的研究结果显示:随BCG感染时间延长,巨噬细胞凋亡率逐渐升高,促凋亡分子cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase8、cleaved-Caspase9、BAX、GRP78、CHOP、cleaved-Caspase12、CytochromeC的表达均逐渐上调,抑凋亡分子BCL-2、BCL-XL的表达均逐渐下调。过表达ACAT1与BCG共处理组较BCG感染组细胞凋亡率进一步上升,促凋亡蛋白进一步上调,抑凋亡蛋白进一步下调,而干扰或抑制ACAT1的结果与之相反,且抑制ACAT1后,下调了 BCG感染所致的巨噬细胞内ROS的释放和Ca2+水平。以上结果表明,过表达ACAT1促进了 BCG诱导的巨噬细胞凋亡,而抑制ACAT1缓解了巨噬细胞凋亡的发生,且外源性凋亡途径及内源性凋亡途径均参与其中。②动物水平的研究结果显示:BCG感染小鼠后,肺组织出现一定数量的凋亡小体,过表达ACAT1与BCG共处理组较BCG感染组凋亡小体的数量减少,而K604与BCG共处理组凋亡小体的数量增加。BCG感染小鼠后,肺组织促凋亡相关蛋白cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase8、cleaved-Caspase9、cleaved-Caspase12的表达上调,过表达ACAT1与BCG共处理组较BCG感染组上述蛋白的表达下调,而K604与BCG共处理组上述蛋白的表达上调。以上结果表明,过表达ACAT1抑制了 BCG感染的小鼠肺组织细胞的凋亡,而抑制ACAT1促进了 BCG感染的小鼠肺组织细胞的凋亡。3.分别从细胞水平和动物水平研究了 ACAT1对BCG感染后炎性反应的的调控作用。①细胞水平的结果显示:BCG感染巨噬细胞后,TLR2和TLR4蛋白的表达及促炎因子TNFα、IL-6、IL-1β的释放均随感染时间逐渐升高。BCG感染组较未感染对照组依赖MyD88途径相关蛋白TLR2、TLR4、MyD88、TRAF-6和p-NF-κBp65的表达上调,过表达ACAT1与BCG共处理组较BCG感染组上述蛋白的表达上调,干扰ACAT1与BCG共处理组上述蛋白的表达下调,而非依赖MyD88途径相关蛋白IRF3、TBK1的表达在各组间差异不显着。以上结果表明,过表达ACAT1促进了 BCG感染巨噬细胞的炎性反应,而干扰或抑制ACAT1对其具有缓解作用,上述过程均依赖MyD88信号通路。②动物水平的研究结果显示:BCG感染小鼠后,肺组织炎性改变明显,过表达ACAT1与BCG共处理组较BCG感染组炎性反应程度减轻,而抑制ACAT1与BCG共处理组炎性改变程度加重。对40个炎性因子的抗体芯片检测结果显示,BCG感染后,多个炎性因子表达上调。过表达ACAT1与BCG共处理组较BCG感染组TNFα、IL-1β、IL-6等25个炎性因子的表达下调,而抑制ACAT1与BCG共处理组TNFα、IL-1β、IL-6等29个炎性因子的表达上调。蛋白质组学分析结果表明,与BCG感染组相比,抑制ACAT1与BCG共处理组粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞的激活或增殖有关的通路上调,NK细胞介导的细胞毒性相关分子及细胞黏附分子的表达上调。抑制ACAT1与BCG共处理组较BCG感染组NLRP3炎性小体的活化水平上升,过表达ACAT1与BCG共处理组NLRP3炎性小体的活化水平下降。以上结果表明,过表达ACAT1降低了 BCG感染小鼠后肺组织的炎性反应,而抑制ACAT1促进了 BCG感染小鼠后肺组织的炎性反应,多种炎性细胞及NLRP3炎性小体参与调控。4.分别从细胞水平和动物水平研究了 ACAT1对BCG感染后细胞自噬的的调控作用。①细胞水平的研究结果显示:BCG感染巨噬细胞后,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin、ATG5、ATG7的表达均上调,而抑制ACAT1与BCG共处理组较BCG感染组上述蛋白的表达进一步上调,自噬小体及自噬溶酶体数量进一步增多。以上结果表明,抑制ACAT1促进了 BCG诱导的巨噬细胞自噬。②动物水平的研究结果显示:BCG感染小鼠后,肺组织自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclinl、ATG5、LAMP1、Rab7的表达上调,抑制ACAT1与BCG共处理组较BCG感染组上述蛋白的表达进一步上调,而过表达ACAT1与BCG共处理组上述蛋白的表达下调,且肺组织载菌量增多。以上结果表明,过表达ACAT1抑制了 BCG感染小鼠后肺组织细胞的自噬,而抑制ACAT1促进了 BCG感染小鼠后肺组织细胞的自噬。综合以上研究结果,ACAT1对BCG感染引起的免疫反应发挥重要的调控作用。在细胞水平,过表达ACAT1通过外源性途径及内源性途径促进BCG诱导的巨噬细胞凋亡,通过依赖MyD88途径促进炎性反应,而抑制ACAT1能够缓解BCG感染巨噬细胞后的凋亡、炎性反应,促进BCG诱导的细胞自噬。在动物水平,过表达ACAT1抑制了 BCG感染小鼠后肺组织的细胞凋亡和自噬,抑制了 NLRP3炎性小体的活化,降低了 BCG感染小鼠引起的肺组织炎性反应,协同促进了BCG在肺部的扩散,而抑制ACAT1促进了 BCG感染小鼠后肺组织的细胞凋亡、细胞自噬和炎性反应。因而,抑制ACAT1或许有望成为结核病治疗的潜在途径。
康璇[2]（2021）在《Asprosin负调控海马METTL3-m6A-YTHDF1轴：糖尿病认知功能障碍新机制》文中指出Asprosin是由原纤维蛋白前体（profibrillin,FBN1基因编码）裂解产生的含140个氨基酸残基的C末端蛋白片段分子,具有促进肝糖释放、升高血糖的生理功能,已被证实是2型糖尿病的高危险因素。探讨Asprosin在糖尿病认知功能障碍（diabetes-associated cognitive decline,DACD）中的作用具有重要意义。N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）是真核生物mRNA最常见的修饰形式。研究表明海马METTL3-m6A-YTHDF1轴可正向调控学习与记忆,甲基转移酶METTL3催化形成的m6A修饰促进学习记忆,而m6A对学习记忆的调控依赖于识别蛋白YTHDF1。故我们将从调控海马METTL3-m6A-YTHDF1轴的视角阐释DACD的发病机制。综上,Asprosin是否通过负调控海马METTL3-m6A-YTHDF1轴介导DACD的发生呢?为回答上述科学问题,我们从以下三个方面进行研究:1)明确糖尿病大鼠在认知受损的同时存在海马组织Asprosin表达升高和METTL3-m6A-YTHDF1轴紊乱;2)明确海马过表达Asprosin可使正常大鼠海马METTL3-m6A-YTHDF1轴紊乱、认知功能受损;3)明确沉默海马Asprosin能改善糖尿病大鼠的认知功能并使其海马METTL3-m6A-YTHDF1轴恢复正常。第一部分糖尿病大鼠同时存在认知受损、海马组织Asprosin表达升高和METTL3-m6A-YTHDF1轴紊乱研究目的:明确DACD与海马Asprosin、METTL3-m6A-YTHDF1轴的异常改变相关。研究方法:在高脂饮食（high fat diet,HFD）喂养4周后,给予SD大鼠腹腔注射STZ（30 mg/kg）建立糖尿病模型。8周后采用新物体识别（Novel object recognition,NOR）试验、Morris水迷宫（Morris water maze,MWM）试验评估大鼠的认知功能;RT-qPCR检测海马组织Asprosin mRNA水平;Western blot检测海马组织Asprosin、突触相关蛋白（PSD95和SYN1）、谷氨酸受体（NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、GluA1和GluR2）、METTL3和YTHDF1的表达;比色法定量检测m6A修饰丰度;m6A-seq及转录组测序检测海马m6A修饰及基因表达的改变。研究结果:1)糖尿病大鼠存在认知功能障碍:糖尿病大鼠在NOR试验中的分辨指数显着降低;在MWM试验中找到平台潜伏期明显延长,在目标象限停留时间百分比和穿过逃逸平台的次数均显着减少,表明糖尿病大鼠存在认知功能障碍。2)糖尿病大鼠海马突触可塑性受损:糖尿病大鼠海马组织突触相关蛋白PSD95和SYN1蛋白表达水平均明显降低;谷氨酸受体NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、GluA1和GluR2蛋白表达显着升高,表明糖尿病大鼠海马突触可塑性受损。3)糖尿病大鼠海马组织Asprosin水平增高:糖尿病大鼠海马组织Asprosin mRNA及蛋白表达水平均升高。4)糖尿病大鼠海马METTL3-m6A-YTHDF1轴紊乱:糖尿病大鼠海马组织m6A修饰丰度降低,METTL3、YTHDF1表达明显下降,表明糖尿病大鼠海马METTL3-m6A-YTHDF1轴紊乱。5)糖尿病大鼠海马组织的m6A修饰和基因表达的变化:m6A-seq数据鉴定出糖尿病大鼠海马组织有692个m6A修饰上调的差异peak和1210个m6A修饰下调的差异peak,功能注释主要富集于树突棘发育、轴突再生;转录组测序发现糖尿病大鼠海马组织有140个上调的差异表达基因和99个下调的差异表达基因,功能注释主要富集于突触、帕金森病、氧化磷酸化、阿尔兹海默病;转录组测序和m6A-seq的关联分析发现糖尿病大鼠海马组织有28个差异基因,功能注释主要富集于帕金森病、阿尔兹海默病。第二部分海马过表达Asprosin可诱导大鼠认知功能障碍和海马METTL3-m6A-YTHDF1轴紊乱研究目的:明确海马过表达Asprosin能诱导认知功能障碍、海马突触可塑性受损及海马METTL3-m6A-YTHDF1轴紊乱。研究方法:SD大鼠通过侧脑室注射腺相关病毒过表达载体AAV-Asprosin。4周后采用NOR试验、MWM试验评估大鼠的认知功能,RT-qPCR检测海马组织Asprosin mRNA水平;Western blot检测海马组织Asprosin、突触相关蛋白、谷氨酸受体、METTL3和YTHDF1的表达;透射电镜观察海马突触超微结构;高效液相色谱-质谱检测海马组织谷氨酸含量;比色法定量检测m6A修饰丰度;m6A-seq及转录组测序检测海马m6A修饰及基因表达的改变。研究结果:1)海马过表达Asprosin诱导大鼠认知功能障碍:海马过表达Asprosin显着降低正常大鼠在NOR试验中的分辨指数,明显延长在MWM试验中找到平台潜伏期,显着减少在目标象限停留时间百分比和穿过逃逸平台的次数,表明海马过表达Asprosin使正常大鼠的认知功能受损。2)海马过表达Asprosin损伤正常大鼠的海马突触可塑性:海马过表达Asprosin可降低正常大鼠海马组织突触相关蛋白PSD95和SYN1蛋白的表达水平,升高谷氨酸受体NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、GluA1和GluR2蛋白表达水平;降低海马CA1、CA3和DG区突触数密度,显着减少突触活性区长度和突触后致密物厚度,明显增宽突触间隙宽度;对海马组织谷氨酸水平无影响。以上结果表明海马过表达Asprosin损伤正常大鼠的海马突触可塑性。3)海马过表达Asprosin使正常大鼠海马METTL3-m6A-YTHDF1轴紊乱:海马过表达Asprosin下调海马组织m6A丰度,降低海马组织METTL3、YTHDF1表达,提示海马过表达Asprosin使正常大鼠海马METTL3-m6A-YTHDF1轴紊乱。4)海马过表达Asprosin对正常大鼠海马组织m6A修饰及基因表达的影响:m6A-seq数据鉴定出海马过表达Asprosin大鼠海马组织有1014个m6A修饰上调的差异peak和759个m6A修饰下调的差异peak,功能注释主要富集于G蛋白偶联受体活性及信号通路、免疫应答、NOD样受体信号通路、神经活性配体受体相互作用;转录组测序发现海马过表达Asprosin大鼠海马组织有79个上调的差异表达基因和83个下调的差异表达基因,功能注释主要富集于离子型谷氨酸受体、AMPA受体活性的调节、突触后密度、树突棘形态发生及PI3K-Akt信号通路;转录组测序和m6A-seq的关联分析发现海马过表达Asprosin大鼠海马组织有10个差异基因,功能注释主要富集于Hippo信号通路。第三部分沉默海马Asprosin能逆转糖尿病大鼠海马METTL3-m6A-YTHDF1轴紊乱、改善其认知功能研究目的:明确沉默海马Asprosin能改善糖尿病大鼠的认知功能并使海马METTL3-m6A-YTHDF1轴恢复正常。研究方法:SD大鼠给予HFD喂养4周,在腹腔注射STZ（30 mg/kg）前预先侧脑室注射AAV-Asprosin-sh RNA,8周后采用NOR试验、MWM试验评估大鼠的认知功能,RT-qPCR检测海马组织Asprosin mRNA水平;Western blot检测海马组织Asprosin、突触相关蛋白、谷氨酸受体、METTL3和YTHDF1的表达;透射电镜观察海马突触超微结构;高效液相色谱-质谱检测海马组织谷氨酸含量;比色法定量检测m6A修饰丰度;m6A-seq及转录组测序检测海马m6A修饰及基因表达的改变。研究结果:1)沉默海马Asprosin改善糖尿病大鼠的认知功能:沉默海马Asprosin显着增加糖尿病大鼠在NOR试验中的分辨指数,缩短在MWM试验中找到平台潜伏期,增加在目标象限停留时间百分比和穿过逃逸平台的次数,表明沉默海马Asprosin改善糖尿病大鼠的认知功能。2)沉默海马Asprosin改善糖尿病大鼠的海马突触可塑性:沉默海马Asprosin升高糖尿病大鼠海马组织突触相关蛋白PSD95和SYN1蛋白表达水平,降低谷氨酸受体NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、GluA1和GluR2蛋白表达水平;降低糖尿病大鼠海马组织谷氨酸水平;增加海马CA1、CA3和DG区突触数密度,增加突触活性区长度和突触后致密物厚度,减少突触间隙宽度。表明沉默海马Asprosin改善糖尿病大鼠的海马突触可塑性。3)沉默海马Asprosin使糖尿病大鼠海马METTL3-m6A-YTHDF1轴恢复正常:沉默海马Asprosin上调海马组织m6A修饰丰度;增加海马组织METTL3、YTHDF1表达,表明沉默海马Asprosin可恢复糖尿病大鼠海马METTL3-m6A-YTHDF1轴。4)沉默海马Asprosin对糖尿病大鼠海马组织m6A修饰及基因表达的影响:m6A-seq数据鉴定出沉默海马Asprosin的糖尿病大鼠海马组织有845个m6A修饰上调的差异peak和736个m6A修饰下调的差异peak,功能注释主要富集于糖酵解和糖异生、NOD样受体信号通路、免疫应答、钙信号通路;转录组测序发现沉默海马Asprosin的糖尿病大鼠海马组织有140个上调的差异表达基因和99个下调的差异表达基因,功能注释主要富集于固有免疫应答、帕金森病、氧化磷酸化、PI3K-Akt信号通路;m6A-seq的关联分析发现沉默海马Asprosin的糖尿病大鼠海马组织有29个差异基因,功能注释主要富集于炎症反应、神经活性配体受体相互作用、PI3K-Akt信号通路。结论:Asprosin通过负调控海马METTL3-m6A-YTHDF1轴介导糖尿病认知功能障碍的发生。
方春燕[3]（2021）在《Hox基因Antennapedia对昆虫翅发育的功能探究及机制解析》文中研究表明昆虫作为地球上数量最多、种类丰富的一个生物类群,飞行能力的获得为其在地球上的大范围扩散奠定了基础。为了进一步适应地球复杂的生存环境,不同昆虫衍生出了形态各异的翅膀,且同物种间前后翅形态也存在较大的差异。近年来,随着进化发育生物学研究策略的不断革新,已经明确昆虫翅的起源、发生及发育与同源异型基因（Homeotic gene,Hox）紧密相连。Hox基因是1978年由路易斯在果蝇中首次发现的,是控制动物从前到后各个体节形态的重要发育调控基因家族,任何一个Hox基因的突变都会引起对应体节器官、组织的异常发育。除跳蚤、衣鱼等少数昆虫没有翅膀以外,大部分昆虫在第二、三胸节着生前后两对翅膀。这两个体节主要为Hox基因Antennapedia（Antp）和Ultrabithorax（Ubx）控制的区域,因此推测翅的发育与这两个基因相关。已有研究表明在果蝇、赤拟谷盗和蝴蝶中,Ubx缺失或过表达导致前后翅（平衡棒）之间的同源异型转化,而在翅原基中下调或异位表达Antp后对翅形态没有任何影响,因此进化发育生物学领域普遍认为昆虫前后翅形态特化的原因是由于Ubx通过在后翅中调控一系列与翅发育相关基因所致,而前翅不受Hox基因Antp调控,处于Antp-free的状态。然而家蚕中存在两个Antp基因功能缺失突变体Nc和Wes,这两个纯合突变体在胚胎期的表型与果蝇Antp纯合突变体相似,均存在胚胎期致死、胸节愈合及胸足向触角转换等特征。但是其杂合突变体能正常发育至成虫,且成虫翅发育缺陷,这个现象在其他物种中并未被提及。基于此,我们推测Antp参与了昆虫翅的发育。本研究中,我们以家蚕、果蝇赤拟谷盗及果蝇为研究对象,通过瞬时干涉、CRISPR-Cas9基因编辑手段及UAS-GAL4双元系统下调Antp的表达,探究Antp是否影响昆虫翅的发育;以家蚕Antp杂合突变体Wes为研究对象,利用ELISA、双荧光素酶、EMSA和Ch IP-PCR等手段探究Antp是如何影响昆虫翅发育的;通过比较蛋白质组学,获得更多Antp调控翅发育的潜在下游靶基因。本研究取得的主要结果如下:1、家蚕翅原基中过量表达Antp不影响翅发育Antp基因在家蚕翅的时空表达模式表明Antp基因在前后翅中均有表达,并且在Antp杂合突变体Wes(Antp+/-)翅原基中的表达强度显着低于野生型大造翅原基中的表达,因此我们推测在翅原基中过量表达Antp后能使家蚕翅变大。我们截取了在蛹翅中特异性高表达的翅原基表皮蛋白基因Bm Wcp4的上游启动子,构建了驱动Antp基因在家蚕翅原基中特异性高量表达的转基因载体,注射入新鲜蚕卵中,在G1代通过红色荧光标签筛选潜在的阳性个体。对筛选到的阳性个体进行分子检测:1、通过反向PCR实验表明,Antp过表达盒的插入位置为基因间区,未破坏其他基因的结构;2、q RT-PCR和Western-blot实验表明,在转录水平和蛋白水平,Antp在翅中的表达均显着上调,因此我们认为在家蚕中的Antp过表达品系构建成功。由于肉眼观察Antp转基因过表达品系的成虫翅形态与野生型无显着差异,因此我们将过表达品系扩大培养后,对衡量翅正常发育的两个指标翅面积和翅负荷进行了精确测量,结果表明过表达品系的翅面积和翅负荷与野生型大造之间无显着差异。2、下调Antp表达导致翅发育异常由于在翅原基中过量表达Antp后,家蚕翅的发育未受影响,因此我们将ds Antp注射入野生型游走期家蚕中,以下调Antp在翅中的表达。结果显示,注射48h后,Antp干涉个体的表达量显着低于对照,对翅原基解剖观察发现,Antp干涉个体翅原基与对照组翅原基在形态上无显着差异,但Antp干涉个体翅原基内部结构翅脉发育不良,该现象与Wes突变体(Antp+/-)翅原基表型一致。化蛾后,Antp干涉个体翅表现为卷曲皱缩,翅型显着变小。为了进一步探究Antp功能丧失后对翅发育的影响,我们利用CRISPR-Cas9编辑手段敲除Antp。将体外转录合成的针对Antp的sg RNA和Cas9蛋白混合均匀后注射入新鲜蚕卵中,G0代成虫出现了与Wes(Antp+/-)一致的异常翅型,对突变表型个体的Antp基因测序,结果表明在设计的靶位点处存在大片段的缺失和少量碱基的插入,导致基因移码突变,引起基因功能的丧失。以上结果表明Antp是家蚕翅发育所必需的。Antp作为Hox家族中的一员,在进化上高度保守。为了阐明Antp基因对翅发育的影响具有广泛的适用性,我们从NCBI数据库中调取了7个目,49种昆虫的Antp蛋白全长序列,进行系统发生树分析和蛋白二级结构分析。其中膜翅目、鳞翅目、鞘翅目、半翅目和直翅目在成虫期有完整的翅结构,而弹尾目和虱目在整个生命周期中不存在翅膀;同一目昆虫均聚在1个分支上,暗示Antp在同一目昆虫中的功能具有一定的保守性。蛋白质二级结构分析显示,所有物种Antp均有Homeodomain结构域,而Hox基因作为转录因子调控下游基因是基于homeodomain区域与DNA结合,进而控制胚胎或动物体特定位置细胞的分化、特化。以上结果表明,在进化上Antp基因控制昆虫胸部组织和器官发育的功能是保守的。为了说明Antp基因在昆虫翅发育过程中的功能是保守的,我们以双翅目昆虫果蝇和鞘翅目昆虫赤拟谷盗为研究对象,下调Antp在翅中的表达。结果显示,Antp表达下调后果蝇和赤拟谷盗成虫翅均发育异常。综上,Antp在昆虫翅发育过程中不可或缺。3、Antp调控20E的合成影响翅发育为了阐明Antp如何影响昆虫翅发育,我们调查了20E合成通路基因在前胸腺、血淋巴及翅原基中的表达情况。q RT-PCR结果显示,仅20E合成路径上的最后一个基因shade在翅原基中表达,且其在Wes(Antp+/-)突变翅中的表达显着低于正常。通过ELISA实验测量了ecdysone（20E的前体）和具有活性的20E在Wes(Antp+/-)突变翅和正常翅中的滴度,结果显示ecdysone滴度在两品系间无显着差异,但20E在Wes(Antp+/-)突变翅中的含量显着低于正常,表明突变翅产生的原因可能是翅中20E含量不足导致的。进一步通过双荧光素酶实验、EMSA和Ch IP-PCR实验证实,Antp可直接结合于shade基因的上游启动子区域以调控shade的表达。基于以上,表明在昆虫翅发育过程中,Antp可通过调控20E合成基因shade控制20E在翅中的合成。4、20E上调Antp在翅中的表达由于Antp在翅中的表达与20E在昆虫中的周期性变化具有一定的一致性,因此我们推测在翅发育过程中,20E可调控Antp的表达。通过JASPAR软件分析Antp启动子区域,发现Antp启动子上存在3个20E核受体Ec R/USP的结合基序。我们将Antp启动子构建进萤火虫光酶报告载体（PGL3-basic）内,将其和海肾光报告载体共转进Bm N细胞后,以添加20E的细胞为实验组,添加20E溶剂DMSO的细胞为对照组,48小时后收集细胞检测Antp启动子的启动活性。结果显示,相较于对照组,添加20E后,Antp启动子的启动活性显着增强。此外,对Bm N细胞和家蚕个体额外添加20E后,Antp的表达较对照组均显着上调。以上结果表明,在昆虫翅中,20E在细胞内和Ec R/USP结合形成复合物后,该复合物结合于Antp启动子区域调控Antp的转录表达。5、Antp通过调控表皮蛋白基因的表达影响翅发育为了探究除shade外,是否还有其他基因对Wes(Antp+/-)突变翅型异常的表型有贡献,,基于非依赖数据采集（data-independent acquisition,DIA）蛋白质组学技术,对两品系的翅进行了比较蛋白组分析。结果显示,共鉴定到3993个蛋白质,其中差异蛋白370个（P-value<0.01,|log2FC|>0.58）。相较于正常翅,Wes(Antp+/-)突变翅中鉴定到238个蛋白表达上调,132个蛋白表达下调。我们调查了3个在家蚕翅原基中表达模式与Antp一致的表皮蛋白基因（CPH28,CPG24,CPG9）,在Wes(Antp+/-)突变翅和正常翅中的表达情况。结果显示三个表皮蛋白基因在Wes(Antp+/-)突变翅的表达相较正常翅中的表达均显着下调。在Bm N细胞中,过量表达Antp后,三个表皮蛋白基因较对照组均显着上调,随后我们以CPH28为例,通过双荧光素酶实验和体内外结合实验证明Antp蛋白可直接结合于CPH28启动子区域调控其表达。在蛹期下调CPH28的表达后,成虫翅型缺陷。表明表皮蛋白在翅发育过程中非常重要。综上所述,本研究表明在家蚕、果蝇和赤拟谷盗中敲低或敲除Antp后会导致成虫翅变小,且卷曲皱缩。并证实Antp通过直接调节翅原基中蜕皮激素合成基因Shade的表达而调控蜕皮激素20E的含量;同时,Antp通过与翅表皮蛋白基因的顺势调控原件结合,进一步调控翅的发育。本研究表明前翅发育不是Hox-free,Antp基因对翅发育不可或缺,以丰富调控翅发育的分子机理,并为鳞翅目害虫的防治提供新的靶点。
张慧[4]（2020）在《下调乙酰辅酶A羧化酶A基因表达通过调控线粒体功能抑制前列腺癌进展》文中进行了进一步梳理背景能量代谢重编是肿瘤重要特点,脂肪酸代谢异常是其中之一。近年多项研究表明,肿瘤普遍存在脂肪酶过度表达的状况,众多研究拟探索脂肪酶抑制剂作为癌症潜在治疗方法。本研究旨探索乙酰辅酶A羧化酶A（Acetyl-CoA Carboxylase-A,ACACA）基因对前列腺癌（Prostate Cancer,PCa）细胞及线粒体功能,代谢产物和动物体内肿瘤形成影响。方法免疫组织化学检测ACACA在人前列腺癌组织芯片中的表达,评估不同临床分期病理分级中的情况。公共数据库GEPIA分析ACACA在人前列腺癌及非癌中的表达。细胞功能实验检测前列腺癌低表达ACACA细胞系功能及代谢组学变化。WB检测脂肪酸及酯类代谢途径相关蛋白表达。海马实验检测细胞系线粒体潜能及能量产生变化。流式细胞术和荧光显微镜检测线粒体染色情况。qRT-PCR检测线粒体DNA（mtDNA）。流式细胞术检测细胞活性氧（ROS）水平。比色法检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+/NADH）水平。动物体内探讨ACACA对裸鼠肿瘤形成影响。结果1、ACACA在前列腺癌组织中高表达,临床TNM分期显示晚期PCa患者ACACA表达水平强于低级别患者。T3强于T2、T1,N1强于N0,M1强于M0,均有统计学差异。GEPIA统计显示前列腺癌患者中ACACA表达明显高于健康者。2、细胞功能实验显示,与对照组相比敲低ACACA基因后,DU145细胞和PC3细胞迁移能力,侵袭能力,增殖能力明显减弱,细胞周期G1期延长。均有统计学意义。3、代谢组学检测显示,敲低ACACA基因后,DU145细胞中有94种代谢物质发生改变,PC3细胞中105种物质发生改变,两种细胞中39种物质同时发生改变。ATP水平在两种细胞中均降低。PC3细胞中敲低ACACA基因后,脂肪酸代谢产物L-棕榈酰肉碱和硬脂肉碱水平减少,相关途径蛋白（FAS,Lipin1,ATP-CL,P-ATP-CL,AceCS1,ACSL1）水平下调。均有统计学意义。4、海马实验显示,敲低ACACA基因后,DU145和PC3细胞中ATP产量,基础呼吸,最大呼吸,储存呼吸能力均下降。实时ATP检测中发现,DU145细胞总ATP产生率下降,线粒体ATP产生率显着下降。5、线粒体荧光染色显示,敲低ACACA基因后,DU145和PC3细胞线粒体染色及平均荧光强度均减弱。DU145和PC3细胞mtDNA均明显降低。且均有统计学差异。6、NAD+/NADH检测发现,敲低ACACA基因后,DU145和PC3细胞中该比值均上升,且细胞内ROS水平均高于对照组,均有统计学差异。7、裸鼠成瘤模型中,实验组肿瘤在各个时间点体积明显小于对照组,肿瘤重量也明显小于对照组,均有统计学差异。结论:ACACA基因的高表达与前列腺癌的TNM分期呈正相关。结果证实,前列腺癌细胞中ACACA的下调通过干扰NAD+/NADH,线粒体ATP产量,mtDNA和ROS水平的平衡而影响线粒体潜力,从而降低了肿瘤细胞的增殖能力。测试线粒体潜力和ACACA的表达可能会在将来成为预测目标和治疗方法。
赵志平[5]（2020）在《GDF-15通过孤儿受体GFRAL促进胰腺癌增殖及侵袭转移的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）是消化系统中恶性程度极高、疗效及生存预后极差的肿瘤之一。流行病学研究表明,全世界每年有超过33万人死于胰腺导管腺癌,其总体5年生存率约6%（2%-9%）。由于胰腺癌起病隐匿,进展迅速,大多数患者就医时已经处于中晚期并出现局部浸润及远处转移,因此只有约10%-15%的胰腺癌患者有机会接受根治性手术切除。大多数患者只能采用姑息性手术、化疗、放疗、免疫治疗等疗法,临床疗效收获甚微。因此,深入研究胰腺癌细胞增殖及侵袭转移的分子调控机制,对防治PDAC的增殖及侵袭转移,研发新的早期诊断肿瘤标志物,提高临床患者的生存预后具有重要意义。转化生长因子-β超家族（Transforming growth factor-βsuperfamily,TGF-βs）是一类具有多种生物学功能的多肽类细胞因子,目前研究发现共有33种不同的亚型（TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3,Inhibinα,InhibinβA,InhibinβB,InhibinβC,InhibinβE,Nodal,Myostatin,BMP-2,BMP-3,BMP-4,BMP-5,BMP-6,BMP-7,BMP-8A,BMP-8B,BMP-9,BMP-10,GDF-1,GDF-3,GDF-5,GDF-6,GDF-7,GDF-9,GDF-9B,GDF-10,GDF-11,GDF-15,MIS,Lefty A,Lefty B）,能够在细胞形态维持以及细胞分化、增殖、凋亡、衰老、迁移等生物学过程中发挥重要作用。生长分化因子-15（Growth differentiation factor 15,GDF-15）,是转化生长因子-β超家族中生长分化因子亚家族的成员,又称作巨噬细胞抑制因子-1（MIC-1）、非甾体抗炎药物活化基因-1（NAG-1）、前列腺源性生长因子（PDF）、胎盘转化生长因子β（PTGFβ）、胎盘骨形态发生蛋白（PLAB）以及PL74。最早由澳大利亚Bootcov MR等学者在1997年从人源U937骨髓单核细胞c DNA文库中分离出GDF-15。作为TGF-β家族中的一员,GDF-15跟家族中其它成员的氨基酸序列相似性仅为15%-29%。GDF-15基因位于人类19号染色体GRCh38.p13,含有两个外显子和一个内含子,长为7007bp DNA。经转录翻译合成含有308个氨基酸的GDF-15前体蛋白（无活性）,在细胞内经Furin-like蛋白酶切割加工后形成具有生物学活性的分泌型GDF-15,分子量约为30k Da。在生理状况下,GDF-15在除胎盘组织以外的其他组织中不表达或者少量表达;然而在病理状况下,如炎症、应激、损伤、缺血再灌注、心衰、II型糖尿病等,受累的组织器官中GDF-15的表达量显着增多,相应的血浆中GDF-15表达量亦升高。研究报道,在多种类型肿瘤如恶性胶质瘤、睾丸癌、卵巢癌、口腔鳞状细胞癌、葡萄膜黑色素瘤、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌以及肝细胞癌中GDF-15异常高表达,可以作为检测和判断肿瘤预后的潜在生物学标志物。GDF-15主要由活化的巨噬细胞以及肿瘤细胞分泌,在肿瘤的发生发展过程中扮演重要角色。在胰腺癌中,GDF-15基因受Twist1调控而持续表达,增强胰腺癌细胞增殖及侵袭转移,并诱导细胞对化疗药物产生耐药性,但其具体分子机制有待进一步阐明。胶质细胞源性神经营养因子家族α样受体（Glial-derived neurotrophic factor receptor alpha-like,GFRAL）是胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）受体α家族的孤儿受体。研究报道,GDNF蛋白家族有四个成员,即GDNF家族受体-α1（GFR-α1）,GDNF家族受体-α2（GFR-α2）,GDNF家族受体-α3（GFR-α3）和GDNF家族受体-α4（GFR-α4）。其中GFRAL基因定位于人6号染色体,包含有9个外显子,且存在可变剪切体。GFRAL蛋白由395个氨基酸残基组成,在其C-末端有20-30个可伸缩的疏水性氨基酸,N-末端存在一个信号肽。GFRAL蛋白通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定在细胞膜上。作为一种单次跨膜蛋白,GFRAL位于细胞内的结构域较短,缺乏向细胞内传导信号的能力,因此在发挥生物学作用时,需要酪氨酸激酶辅助受体Ret来协助GFRAL受体进行信号的传导。来自四个不同的医学研究团队Emmerson PJ,Yang L,Mullican SE和Hsu JY在Nature Medicine和Nature刊文报道,GFRAL局限地表达于小鼠脑干最后区（Area postrema,AP）以及孤束核（Nucleus tractus solitarius,NTS）中的神经细胞膜表面;GFRAL能够与GDF-15特异性结合,其结合率跟GDF-15的浓度呈正相关。在神经细胞膜上形成GDF-15/GFRAL/Ret复合物,激活胞内PI3K-Akt,Erk1/2,MAPK和磷脂酶C（PLC）γ信号通路,从而抑制小鼠的摄食行为,调节新陈代谢,降低体重,改善血糖,能作为严重肥胖、2型糖尿病以及厌食/恶病质治疗的潜在靶标。然而,GFRAL在肿瘤中尚未见相关研究报道。为深入研究GDF-15与孤儿受体GFRAL在胰腺癌中的临床意义及其具体的分子机制,结合前期研究工作基础,我们提出如下研究设想:胰腺导管腺癌细胞能够自分泌分化生长因子GDF-15,作用于胰腺癌细胞自身膜上受体GFRAL,通过GDF-15/GFRAL信号通路,促进胰腺癌细胞增殖及侵袭转移。研究目的1.通过收集临床胰腺癌病例,检测胰腺癌组织及血浆样本中GDF-15、GFRAL的表达情况,分析二者之间表达的相关性,明确其异常表达对PDAC患者临床病理因素及生存预后的影响,为后续的机制研究提供依据。2.检测GDF-15及GFRAL在胰腺癌细胞系中的表达情况,分析二者在细胞水平表达的相关性。3.阐明胰腺癌自分泌GDF-15,可直接与细胞膜受体GFRAL结合,通过GDF-15/GFRAL信号通路,促进胰腺癌细胞增殖及侵袭转移的分子机制。4.构建裸鼠皮下成瘤模型,在动物水平探讨GDF-15及GFRAL对胰腺癌体内成瘤的影响,为开发新的胰腺癌诊治策略提供新思路。研究方法1.采用酶联免疫吸附实验（ELISA）,检测正常人与胰腺癌患者血浆中GDF-15的表达情况,并用Graph Pad Prism 5软件分析GDF-15在正常人及胰腺癌患者血浆中的表达水平。同时,采用免疫组化（IHC）实验在正常人及胰腺癌组织中对GDF-15的表达进行验证。根据胰腺癌患者血浆中GDF-15表达的高低将PDAC病例分为高表达组和低表达组（区分高、低表达组的依据为GDF-15在所有胰腺癌血浆病例中表达的均值）,分别统计上述两组病例间PDAC患者年龄、性别、肿瘤临床分期分级、肿瘤大小以及术后生存预后等临床资料的差异性。2.通过ELISA实验,检测正常胰腺导管上皮细胞系HPDE以及四株胰腺癌细胞系（As PC-1,Bx PC-3,Panc-1和Hs766t）中GDF-15的表达情况,并用Graph Pad Prism 5软件分析GDF-15在正常及胰腺癌细胞系中的表达水平,从而在体外细胞系水平,对GDF-15在临床组织及血浆样本中的表达情况进行验证。3.采用免疫组化（IHC）实验在正常人及胰腺癌组织检测GFRAL的表达情况。根据免疫组化评分的高低将PDAC病例分为高表达组和低表达组,分别统计上述两组病例间PDAC患者术后生存预后等临床资料的差异性;同时,采用WB实验在正常胰腺导管上皮细胞株HPDE以及六株胰腺癌细胞系As PC-1,Bx PC-3,CFPAC-1,Panc-1,SW1990和Hs766t中检测GFRAL蛋白的表达情况。4.采用Graph Pad Prism 5软件,分别在胰腺癌临床样本以及胰腺癌细胞系中,统计分析GDF-15和GFRAL表达量之间的相关性。5.通过免疫荧光（IF）、激光扫描共聚焦（CLSM）等实验技术,在胰腺癌组织石蜡切片以及细胞系中行免疫荧光双标记GDF-15和GFRAL,在激光扫描共聚焦仪器上观察GDF-15及GFRAL在胰腺癌组织及细胞系中表达的共定位情况。采用免疫共沉淀（Co-IP）实验,在胰腺癌细胞系中,从分子水平上来验证GDF-15蛋白与GFRAL蛋白的直接相互作用。6.构建干扰慢病毒Lv-GDF15-RNAi和合成人重组GDF-15（Recombinant human GDF-15）细胞因子,分别下调和模拟上调GDF-15在胰腺癌细胞中的下调和上调表达,并采用CCK-8、Transwell、划痕实验等技术观察GDF-15对胰腺癌细胞增殖、侵袭转移的影响。7.构建过表达慢病毒Lv-EGFP-GFRAL（+）以及其阴性对照慢病毒Lv-EGFP-GFRAL（-）,感染胰腺癌细胞,采用流式细胞筛选出稳定上调表达GFRAL蛋白的细胞,并采用WB实验检测GFRAL蛋白的过表达效率。使用人重组GDF-15细胞因子刺激Lv-EGFP-GFRAL（+）和Lv-EGFP-GFRAL（-）细胞,观察细胞增殖以及侵袭转移能力的改变情况。8.使用4周大小的BALB/c雌性裸鼠作为研究对象,通过接种带有干扰慢病毒Lv-GDF15-RNAi稳定下调表达GDF-15的As PC-1细胞（2×106个/只）构建胰腺癌裸鼠皮下成瘤模型,30天后采用小动物成像系统（IVIS?Spectrum系统）观察GDF-15在裸鼠体内对胰腺癌细胞成瘤的影响。研究结果1.与正常人胰腺组织（7例）以及正常血浆（20例）相比较,GDF-15在胰腺癌肿瘤组织（21例）以及胰腺癌血浆（34例）中显着高表达（P<0.0001）;GDF-15高表达组中胰腺癌患者术后5年生存率明显低于GDF-15低表达组（P=0.0120）。2.在细胞系水平验证GDF-15的表达情况,不同胰腺癌细胞系中的表达水平不一致,其中在As PC-1中表达最高,在Hs766t中表达最低。3.与正常胰腺组织（13例）相比较,GFRAL在胰腺癌组织（117例）中明显高表达;GFRAL高表达组中胰腺癌患者术后5年生存率明显低于GFRAL低表达组（P=0.0272）。且GFRAL在胰腺癌细胞系中的表达情况与临床样本相一致。4.GDF-15及GFRAL在胰腺癌样本中表达的相关性,采用Graph Pad Prism 5软件统计分析发现,GDF-15与GFRAL的表达呈正相关（r2=0.6501,P=0.0009）。5.激光扫描共聚焦显示GDF-15与GFRAL在胰腺癌组织中共定位表达,且免疫共沉淀实验证明GDF-15与GFRAL蛋白能通过直接相互结合来发挥生物学作用。6.人重组GDF-15细胞因子能促进胰腺癌细胞的增殖、侵袭转移;下调GDF-15的表达后,胰腺癌细胞系的增殖及侵袭转移能力显着减弱。慢病毒上调GFRAL表达后,GDF-15对胰腺癌细胞的增殖及侵袭转移能力显着增强。7.在胰腺癌裸鼠皮下成瘤模型体内,与阴性对照组（Lv-GDF15-NC）比较,接种干扰慢病毒Lv-GDF15-RNAi As PC-1细胞组裸鼠皮下的肿瘤质量及体积明显较小（P=0.0286）。研究结论1.胰腺癌患者血浆及组织中GDF-15、GFRAL显着高表达,且与患者临床预后密切相关;可以作为胰腺癌患者临床诊疗的肿瘤标志物。2.在胰腺癌临床样本和细胞系中,GDF-15及GFRAL表达皆呈正相关。3.GDF-15及GFRAL在胰腺癌中共定位表达,且二者能直接相互结合。4.胰腺癌细胞可以自分泌GDF-15。5.GDF-15通过GFRAL受体促进胰腺癌细胞的增殖及侵袭转移。本研究通过深入探讨GDF-15/GFRAL通路对胰腺癌发生发展的影响。首次提出并证实胰腺癌细胞高表达孤儿受体GFRAL,并自分泌GDF-15,通过与PDAC细胞膜受体GFRAL直接相互结合,从而促进胰腺癌增殖及侵袭转移。进一步丰富了PDAC增殖及侵袭转移机制研究的理论宝库,并为临床PDAC增殖及侵袭转移的防治提供了新的潜在靶点。
香凤[6]（2020）在《鲤春病毒血症病毒的受体捕获及初步筛选》文中认为鲤春病毒血症（Spring Viraemia of Carp,SVC）是一种传染性与致死率均较高的鱼类传染病,引起该病的病原是鲤春病毒血症病毒（Spring Viraemia of Carp virus,SVCV）。SVCV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）水泡病毒属（Vesiculovirus）的一种,为有囊膜的单股负链RNA病毒,其主要宿主为鲤科鱼类,其中鲤鱼最易感染并致死,目前尚无有效的治疗药物与方法。至今,有关SVCV的诊断方法的研究资料较多,但对其侵染机制的研究较少,尚不清楚SVCV赖以进入宿主细胞的受体。鉴定SVCV的受体,有助于了解该病毒感染机理,并可为研究疫苗及治疗方法提供理论基础。本研究以鲤鱼上皮瘤细胞（Epithelioma papulosum cyprini,EPC）作为宿主细胞对SVCV进行扩培,使用蔗糖密度梯度离心法分离纯化该病毒粒子,离心后病毒粒子主要分布在30%及45%的蔗糖层之间。通过三功能交联分子Sulfo-SBED和ASB分别标记纯化的病毒粒子,然后与EPC膜蛋白或EPC活细胞孵育以捕获SVCV结合蛋白,通过链霉亲和素层析柱进行亲和层析纯化捕获蛋白后进行质谱鉴定。经质谱分析,再使用本研究经转录组测序获得的蛋白质数据库进行搜索比对鉴定,结果发现使用Sulfo-SBED捕获结合蛋白共578种,对照组共159种;使用ASB捕获到的蛋白共415种,对照组共287种。对比找出实验组捕获到而对照组未捕获到的蛋白,采用在线跨膜区分析工具（Trans Membrane prediction using Hidden Markov Models,TMHMM）对其逐一进行跨膜区分析预测,Sulfo-SBED捕获到29种膜蛋白,ASB捕获到21种膜蛋白,其中6种蛋白两种方法均有捕获。分别将这些膜蛋白的序列在NCBI上进行blast分析,发现其中有8种蛋白分别与细胞膜蛋白高度同源,其余36种与定位在线粒体或核糖体等细胞器膜上的蛋白高度同源,推测这8种蛋白极有可能存在SVCV受体,分别为EPC转录组测序编号Unigene12835、Unigene13423、Unigene19308、Unigene7122、CL1989.Contig1、CL3290.Contig2、CL3871.Contig1和CL51.Contig3。接下来采用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术对该8种蛋白进行功能验证及受体初步鉴定。使用RNaseⅢ体外消化双链RNA（Double-stranded RNA,ds RNA）法制备小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）,将RNaseⅢ酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳,通过切胶回收纯化获得siRNA混合物（siRNA mixture,siRNA mix）,然后将siRNA mix转染至EPC细胞,24h后收样,通过荧光定量PCR技术检测靶基因的相对表达量。结果显示,siRNAmix在转染体系中终浓度为0.1nmol/L及0.5 nmol/L时,靶基因均有较好的下调效果,与Mock组相比,基因相对表达量可以下调50%左右（P<0.05）。对8个拟鉴定基因的siRNA mix进行两两组合,共28个组合。将组合中两个基因的siRNA mix混匀转染至EPC中,每个基因的siRNA mix的终浓度均为0.5 nmol/L。转染48 h,加入等量的SVCV病毒原液攻毒。攻毒36 h后,收集样品,利用荧光定量PCR技术检测病毒的增殖情况。结果显示,只有CL3290.Contig2和CL51.Contig2混合的组合的病毒拷贝数显着低于Mock组,说明CL3290.Contig2与CL51.Contig2可能为SVCV的受体或者共受体。分别单独使用终浓度0.5 nmol/L的siRNA mix转染EPC靶向干扰CL3290.Contig2和CL51.Contig2然后攻毒检测,发现分别单独抑制这两个基因的表达均可以在一定程度上减轻SVCV的感染,进一步证明了这两个基因极有可能是SVCV侵染EPC细胞的受体。
景田兴[7]（2020）在《桔小实蝇细胞色素P450全基因组注释及CYP4G亚家族基因功能研究》文中研究说明细胞色素P450是生物体一类重要的代谢解毒酶,P450通过代谢内源和外源物质参与昆虫的取食、生长、发育、生殖以及防御等生理活动,在昆虫适应外界环境、抗药性产生等方面扮演重要角色。P450亚家族CYP4G起源于昆虫祖先由水生环境向陆生环境的转变期,具有合成表皮烃类物质阻止水分散失和维持体内水平衡的重要功能,对于昆虫适应低湿环境至关重要。近年来研究发现,部分昆虫CYP4G亚家族的功能可能出现了分化,可能具有调控昆虫生长发育等功能,但机制尚不明确。桔小实蝇环境适应能力强,寄主范围广,可对多种水果蔬菜造成严重的危害。桔小实蝇的适生范围近年来迅速扩大,有逐渐向高纬度低湿度地区扩散的趋势,说明桔小实蝇对低湿度环境有较强的适应能力。探索CYP4G亚家族是否影响桔小实蝇对干燥环境下的适应能力对揭示其快速扩张的机制,以及制定相应的防控策略等有重要的参考意义。此外,鉴于CYP4G作为保守直系同源基因已出现功能分化现象,探究其承担的其他生理功能可为防控桔小实蝇提供潜在的新靶标。因此,本学位论文以桔小实蝇为研究对象,在注释获得桔小实蝇全基因组P450并解析其表达模式的基础上,综合运用RNAi、表达谱测序、GC/MS、超景深三维显微成像、异源表达等技术和手段,揭示CYP4G100调节表皮烃类化合物合成的CYP4G亚家族保守功能;系统观察明确桔小实蝇围蛹的发育过程并建立围蛹发育分级标准;探究CYP4G188通过调节蜕皮激素滴度介导桔小实蝇蛹-成虫蜕皮的分子机制。主要研究结果如下:1桔小实蝇P450全基因组鉴定与表达模式解析利用桔小实蝇基因组数据以及本地转录组数据库,注释获得101个P450基因信息。序列分析显示所有基因均具有Helix-C、Helix-I、Helix-K、PERF和Heme-binding等5个P450蛋白保守结构域。系统发育分析结果显示,桔小实蝇P450分为CYP2、CYP3、CYP4和CYPmito4个集团,各集团分别由7个、46个、32个和16个P450基因组成。这些P450可进一步分为25个家族57个亚家族,其中最大的家族由31个基因组成,最小的家族仅由1个基因构成。在基因组scaffolds上对这些P450进行定位发现,59个P450以基因簇的形式出现在scaffolds上,说明桔小实蝇P450在进化中出现由复制引起的基因扩增现象。进一步利用q PCR技术解析P450基因在不同发育阶段和成虫不同组织的表达模式,发现超过一半的P450基因在成虫期高表达,部分基因在幼虫和蛹期丰度较高,仅9个P450基因在卵期高表达;绝大多数P450基因在成虫脂肪体、中肠和马氏管等代谢组织表达量较高,少数基因在卵巢中特异性高表达。在桔小实蝇全基因组P450注释中,获得CYP4G亚家族基因3个:CYP4G100、CYP4G101和CYP4G188。克隆获得3个CYP4G基因的c DNA序列,分析发现其均具有CYP4G亚家族特征插入序列。通过与其他昆虫CYP4G进行系统发育分析发现,CYP4G聚为两枝,桔小实蝇CYP4G100与CYP4G101聚为一枝,CYP4G188在另外一枝。CYP4G100与CYP4G101的表达模式相似,均在羽化前期、成虫期以及成虫脂肪体中高表达,这与其他昆虫中调节表皮烃合成的CYP4G基因表达模式高度一致,但CYP4G101的实际表达丰度极低。CYP4G188则仅在围蛹中期（化蛹后第5天）特异性高表达,暗示桔小实蝇CYP4G亚家族成员功能出现分化。2桔小实蝇CYP4G100调节表皮烃合成干燥环境处理（相对湿度RH<10%）可显着诱导桔小实蝇CYP4G100基因表达上调。利用注射法RNAi,沉默CYP4G100表达后,可阻断桔小实蝇表皮烃合成过程,造成几乎所有种类表皮烃含量极显着下降,同时合成烃类底物的甘油酯含量显着积累;与此同时,沉默CYP4G100后的桔小实蝇在干燥环境中失水率显着上升,并导致死亡。上述结果说明,CYP4G100通过调节表皮烃的合成进程从而影响桔小实蝇对干燥环境的适应能力。3桔小实蝇CYP4G188影响蛹-成虫蜕皮进程CYP4G188在桔小实蝇围蛹发育至第5天时特异性高表达,表明该基因的功能很可能与围蛹发育有关。通过系统观察并描述桔小实蝇围蛹发育的形态学特征,根据幼虫-蛹蜕皮、头外翻、蛹-成虫蜕皮、复眼颜色变化等围蛹发育中的形态学变化,建立了围蛹发育的分级标准,并将桔小实蝇围蛹发育分为6个阶段:幼虫弃食期、幼虫-蛹蜕变期、隐头蛹期、显头蛹期、隐成虫期和羽化期。采用高通量表达谱测序筛选了与CYP4G188表达模式一致和相反的基因,通过对这些基因功能聚类（GO、KEGG）,推测CYP4G188很可能调节围蛹发育中蛹-成虫蜕皮过程。据此,在成功构建桔小实蝇围蛹注射法RNAi技术体系的基础上,沉默CYP4G188表达,发现桔小实蝇蜕皮激素滴度显着增加,蛹-成虫蜕皮提前完成。比较分析外源蜕皮激素处理与沉默CYP4G188后的围蛹外部形态表型发现,两种处理均导致围蛹中期发育加速,复眼颜色变化明显提前,但对成虫羽化率和羽化时间没有影响。4 CYP4G100与CYP4G188的异源表达与活性检测基于p-Cold II构建原核表达载体,使用添加稀有密码子的Rosetta（DE3）感受态细胞为宿主的原核表达系统,成功表达出CYP4G100和CYP4G188可溶蛋白,但经CO差光谱分析,重组蛋白仅在420 nm处有吸收峰,无P450活性。基于p Fast-HT A载体构建的Bac-to-Bac真核表达系统未成功表达出目的蛋白。综上所述,本学位论文研究结果揭示了桔小实蝇CYP4G100具有CYP4G亚家族的保守功能,通过调节表皮烃的合成过程进而影响桔小实蝇对干燥环境的适应能力;CYP4G亚家族功能分化的CYP4G188则通过负调节桔小实蝇围蛹发育中蜕皮激素滴度而影响蛹-成虫蜕皮过程。上述两个CYP4G亚家族基因功能的研究对于了解桔小实蝇适应干燥环境的机制,延缓桔小实蝇的扩散具有重要的参考价值,有关CYP4G基因调节桔小实蝇的变态发育过程的功能,为新型特异性防控药剂的研发提供了作用靶标。此外,本研究建立的桔小实蝇围蛹发育的分级标准对于田间准确的预测预报提供了技术指标。
丁飞[8]（2019）在《基于核酸纳米凝胶的功能性核酸递送系统研究》文中指出基于核酸药物分子的基因治疗是一类极具前景的治疗方式,但缺乏安全有效的核酸递送载体是制约基因治疗进一步向临床转化的关键因素。传统的非病毒型核酸递送载体主要是利用核酸分子带负电的特性通过静电相互作用将其与阳离子载体进行复合,进而实现对核酸药物的压缩保护。这类输送载体的构建策略简单高效,然而阳离子载体普遍存在生物毒性等问题,制约其进一步的发展和应用。核酸分子作为一类内源性生物大分子,不仅有着极好的生物相容性和可降解性,而且自身特有的分子识别精确组装特性为核酸药物的负载提供了基础。基于此,本论文通过点击反应制备了DNA接枝聚己内酯的刷状聚合物,以核酸为交联试剂,通过分子自组装构建了一系列非阳离子型核酸纳米凝胶作为功能性核酸递送载体。这种新型递送系统跳出了传统阳离子载体通过静电相互作用负载核酸药物的机制,利用核酸自组装实现核酸药物的负载压缩和保护,实现核酸药物的高效递送,主要工作内容和结果概述如下:1.核酸纳米凝胶有效递送siRNA用于抗肿瘤治疗受阳离子载体压缩保护核酸药物的启发,我们通过核酸亲和杂交的策略构建了一种能够压缩保护siRNA的非阳离子型核酸纳米凝胶体系。首先通过无铜催化的点击反应合成侧链接枝DNA的聚己内酯（DNA-g-PCL）刷状聚合物,其具有多价的交联位点,能够与交联剂siRNA相互交联组装形成核酸纳米凝胶,而且通过改变这两种组分的比例能够实现对核酸纳米凝胶尺寸的调控。这种核酸杂交交联策略能够将siRNA完全包裹在核酸纳米凝胶体系内部,增强siRNA对核酸酶的耐受性以及整个纳米体系的稳定性。我们进一步评估核酸纳米凝胶的细胞摄取能力以及体外基因沉默效果,发现核酸纳米凝胶能够高效地被细胞摄取,而且拥有与Lipofectamine 2000相当的基因沉默能力。此外,我们通过皮下荷瘤裸鼠评估了核酸纳米凝胶体内抗肿瘤效果以及药代行为。实验证实,核酸纳米凝胶的表面负电荷特性赋予其较长的体内循环半衰期和较好的肿瘤富集能力,能够高效地抑制肿瘤生长。2.核酸纳米凝胶共递送Cas9与sg RNA用于基因编辑作为抵御外源基因的适应性原核免疫系统,CRISPR/Cas9体系快速地发展成为由Cas9和sg RNA组成的基因编辑工具。阻碍CRISPR/Cas9基因编辑工具进一步向临床转化的因素之一是缺少安全有效的递送载体。目前,非病毒型Cas9/sg RNA递送载体主要还是基于静电作用的阳离子型输送体系。然而这种构建策略无法规避阳离子载体的毒性问题。基于核酸自组装策略,本章成功制备了一种能够同时输送Cas9和sg RNA的非阳离子型核酸纳米凝胶递送体系。核酸纳米凝胶输送系统由侧链接枝DNA的聚己内酯（DNA-g-PCL）刷状聚合物、交联剂DNA linker以及Cas9/sg RNA复合体组装而成,其中具有多价交联位点的DNA-g-PCL能够通过核酸杂交的策略负载Cas9/sg RNA复合体,然后通过交联剂DNA linker使其交联组装形成内部包裹了Cas9/sg RNA的核酸纳米凝胶。我们对核酸纳米凝胶进行了稳定性评估,发现核酸纳米凝胶不仅拥有优异的生理稳定性,而且纳米凝胶还能够增强Cas9/sg RNA对核酸酶的耐受性。我们进一步评估了核酸纳米凝胶的细胞摄取能力以及体外基因编辑的效果,发现核酸纳米凝胶能够高效地被细胞摄取,并且在胞内能够持续释放Cas9/sg RNA,最终实现靶向基因剪切。3.负载聚多巴胺涂层的核酸纳米凝胶用于siRNA介导的低温光热治疗光热治疗作为高效的抗肿瘤策略,通常需要保持肿瘤病灶部位的温度大于50℃。然而,肿瘤病灶的高温状态可能诱发炎症以及肿瘤转移。因此,在相对较低的温度（42-45℃）下,获得高效的抗肿瘤效果对于光热治疗的临床转化至关重要。我们在核酸纳米凝胶输送体系的基础上,进一步在递送载体表面修饰具有光热转换性能的聚多巴胺涂层,所制备的负载聚多巴胺涂层的核酸纳米凝胶不仅具有优异的光热转换能力,同时增强了siRNA递送载体体内的稳定性。我们首先对负载聚多巴胺涂层核酸纳米凝胶的细胞摄取能力以及体外基因沉默效果进行了评估,发现聚多巴胺涂层核酸纳米凝胶能够高效地被细胞摄取,而且在近红外激光照射下,实现溶酶体逃逸,拥有比纳米凝胶更加优异的基因沉默效果。我们进一步评估了负载聚多巴胺涂层核酸纳米凝胶体外低温光热治疗的效果。实验证实,所制备的纳米粒子能够通过抑制细胞热休克蛋白的表达,实现高效的低温光热治疗。最后,我们通过皮下荷瘤裸鼠评估了负载聚多巴胺涂层核酸纳米凝胶低温光热抗肿瘤的效果以及药代动力学行为。实验证实,负载聚多巴胺涂层核酸纳米凝胶拥有比核酸纳米凝胶更长的体内循环半衰期和更好的肿瘤富集能力,在低温条件下能够高效地抑制肿瘤生长,甚至消融肿瘤。
刘小丰[9]（2019）在《调控柑橘精油生物合成关键基因的挖掘》文中研究指明植物精油是食品、饮料、日化和药品等产业的重要原料,有很高的经济价值。柑橘精油约占世界植物精油产量的30%,是最主要的植物精油来源。柑橘精油储藏在位于果皮、花瓣、叶片等组织的油胞中,其中果皮中的精油含量最高,能达到鲜重的2%以上。果皮约占柑橘果实重量的20%,柑橘精油主要在榨汁过程中从果皮提取。提高果皮中精油的含量,将显着提高柑橘加工的附加值。不同柑橘品种果皮精油含量不同,这种差异通常由遗传因素造成,但其分子机制鲜有研究。本研究从金柑果皮油胞发育入手,结合精油成分分析,研究组织中精油积累和油胞发育的规律,以及精油成分的变化特征。并利用精油含量正常的金柑品种融安金柑与其实生变异、低精油含量品种滑皮金柑遗传背景相似这一特点,针对精油合成的遗传差异进行设计,对两个品种的果皮和叶片进行RNA-seq,分析与精油合成相关基因的表达特征,并筛选与精油合成密切相关的调控基因。通过对该调控基因进行生物信息学分析,预测其功能,并通过研究不同组织、不同品种中基因的表达水平与精油含量,分析其表达水平与精油含量的相关性。利用超表达、干扰、基因编辑等转基因技术,实现提高、降低候选基因的表达水平以及敲除掉该基因,分析转基因植株叶片中精油的成分及含量,阐明该基因在调控柑橘精油合成中的作用。主要研究结果如下:1.金柑的油胞形成于组织发育的早期,油胞分泌腔体积受精油积累量的影响。金柑果皮的油胞在组织发育的早期即已形成,在果实的生长过程中,因精油积累量的增加,油胞分泌腔的平均体积逐渐增大,但也有部分油胞分泌腔停止生长,大小油胞间的差异非常明显。随着果实从生长期进入成熟期,油胞分泌腔的体积增加更快,全部油胞分泌腔的体积同时增大的趋势更明显。精油在油胞分泌腔中的积累过程与果实发育过程并不同步。在生长阶段,果实生长速率和表面积增长速度明显快于成熟阶段,而果实成熟期的精油积累速度快于生长期。2.金柑果实在不同的生长发育时期果皮中挥发性成分的比例不同。抗菌性成分在果实成熟期比例明显降低。芳樟醇、α-萜品醇、香叶醇等具有良好抗菌能力的醇类化合物的含量在从花后30天时的3.99%降到果实成熟时的0.95%,其它具有较强抗菌能力的柠檬醛、香芹酮和樟脑等在果实成熟阶段其含量明显下降甚至未能检出。一些在其它柑橘品种果皮中常见的具有刺激性气味的成分,如莰烯（樟脑味）、α-水芹烯（松节油味）、石竹烯（辛辣味）和α-没药醇（辛辣味）等在金柑果实的成熟阶段未检出。樟脑和4-乙酰-1-甲基环己烯（辛辣味）仅在花后60天前的果皮中微量存在。这可能是金柑果皮刺激性小、适口性好、可以直接食用的原因之一。3.果皮精油含量的增加是单萜和倍半萜积累量增加的结果随着果实的发育,果皮精油成分中单萜的含量由5272.03μg·g-1（76.86%）增加到13587.04μg·g-1（80.49%）,倍半萜含量由976.07μg·g-1（14.07%）增加到2293.44μg·g-1（14.15%）,分别增加了1.58和1.35倍。而占总精油含量极低的非萜类化合物的含量由168.58μg·g-1（2.54%）增加到213.42μg·g-1（1.19%）,仅增加了0.27倍,但其比例明显降低。因此,金柑果皮中精油含量的增加,油胞分泌腔的膨大是单萜和倍半萜不断积累的结果。4.调控精油合成的重要候选基因筛选滑皮金柑（HP）的油胞数目和精油含量远低于融安金柑（RA）及其它柑橘品种。RNA-seq找到398个在果皮和叶片中有表达差异的基因,涉及到精油合成相关的代谢途径有萜类骨架生物合成（Terpenoid backbone biosynthesis,ko00900）、柠檬烯和蒎烯的降解（Limonene and pinene degradation,ko00941）、单萜的生物合成（Monoterpenoid biosynthesis,ko00902）和倍半萜和三萜的生物合成（Sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis,ko00909）。对萜类骨架生物合成中的MEP途径和MVA途径的关键基因以及一些有代表性的单萜、单萜醇、倍半萜合成基因进行q RT-PCR分析。结果除了一个GGPPS外,其它MEP途径和MVA途径基因在叶片和果皮中的趋势并不一致。但多个萜烯合成酶基因在HP组织中表达水平显着下调,推测这些单萜和倍半萜合成酶基因共有的转录调控基因在HP中的表达水平可能发生了改变。进一步筛选,在叶片和果皮中的共有的398个DEG中找到4个可能与次生代谢调控相关的转录调控因子基因Cs2g14570、Cs5g01450、Cs7g08960和Cs4g03550。对这4个转录调控因子进行q RT-PCR分析。其中Cs2g14570（AP2/ERF转录调控因子）、Cs5g01450（MYC2转录调控因子）和Cs7g08960（F-box蛋白）在HP的叶片和果皮中的表达都较RA极显着下调。且前人研究证实,这三个类型的转录调控因子参与了次生代谢产物的调控。特别是MYC2基因,参与多个物种的倍半萜、双萜和生物碱合成的调控。因此,筛选Cs5g01450（暂命名为Fc MYC2）进行下一步的表达分析和转基因功能验证,以阐明其在柑橘精油合成调控中的作用。5.柑橘的Fc MYC2是一个序列特异性极高的MYC2型b HLH家族基因分别从HP和RA中成功地克隆了Fc MYC2,基因全长1563 bp,GC含量46%,编码520个氨基酸,其蛋白分子量58.35 KD,等电点6.83。该基因在甜橙基因Cs5g01450的804与805间多了―CAT‖,编码1个His,该氨基酸不在保守结构域上。Fc MYC2基因仅有一个外显子,无内含子,与甜橙基因Cs5g01450相同。在+408和+1320位点上,RA和HP中都检测到了SNP位点的变异,这些SNP位点位于密码子的第3位,未造成氨基酸的改变。用Fc MYC2的碱基和氨基酸比对柑橘中甜橙和克里曼丁两个基因组数据库,仅有甜橙的Cs5g01450（或orange1.1g010053m）和克里曼丁中的Ciclev10019730m序列一致性极高（E-value=0.0,per.Ident>99%）,且再无其它高相似性的基因,因此推测它们应为同一基因。柑橘的Fc MYC2与其它物种的MYC2基因在碱基序列上差异极大,进化分析发现其与最近缘的油菜MYC2-like基因自展值仅46%。尽管Fc MYC2编码的氨基酸在保守结构域的序列上保守性很高,但在非保守结构域区域,氨基酸序列的同源性极低。这说明柑橘的Fc MYC2是一个序列特异性极高的MYC2型b HLH家族转录调控因子基因。亚细胞定位显示Fc MYC2定位于细胞核中。Fc MYC2的表达受到Me JA的诱导,在Me JA处理后6 h达到最高表达水平。6.Fc MYC2的表达水平与精油的合成密切相关Fc MYC2在HP的茎表皮、叶片、花瓣中表达水平与根相当,都处于极低的水平,仅在有少量油胞的果皮中表达水平相对较高（P<0.05）,但明显低于在RA的茎、叶和果皮中的表达水平。在RA组织中,无油胞的根中Fc MYC2同样处于极低的表达水平,与HP的根相当。但在其它组织中,Fc MYC2都表现出较高的表达水平,特别是在精油含量最高的果皮中,Fc MYC2表达水平也是最高,其次是叶片和茎表皮中也有很高的表达水平。综合以上分析,不难看出,Fc MYC2在精油含量高的组织中表达水平更高。对HP和7个不同类型柑橘品种果皮中的Fc MYC2进行表达分析和果皮精油含量的滴定。结果表明Fc MYC2在油胞密集的品种中的表达水平显着高于HP,表达水平较低的枳中Fc MYC2的表达量也是HP的30倍以上,可见Fc MYC2在HP中的低表达具有非常明显的特异性。精油含量分析显示,HP果皮精油含量仅0.09 mg·g-1,其它几个柑橘品种果皮精油含量在4.49-18.23 mg·g-1之间,远高于HP。相关分析显示,柑橘果皮中Fc MYC2的表达水平与其精油含量呈极显着正相关（r=0.880,P<0.01）。7.Fc MYC2的调控单倍和倍半萜的合成分别构建了Fc MYC2的超表达载体、RNA干扰载体和基因编辑载体,利用农杆菌转化锦橙上胚轴。获得了97株Fc MYC2转基因植株,其中38株表现出油胞分泌腔细小或无肉眼可见分泌腔。基因表达分析显示,超表达植株中Fc MYC2的表达水平极显着地提高,干扰植株中Fc MYC2的表达水平极低。对基因编辑的植株进行测序分析显示,部分植株中的Fc MYC2实现了完全的编辑,这些编辑分别造成移码突变、翻译提前终止、长片段删除等导致蛋白功能丧失的突变。精油成分分析表明,超表达组植株无论是精油含量、成分类型的比例与对照组都没有发生明显的变化,10个含量较高的成分都是柠檬烯、香茅醛、柠檬醛、邻甲氨基苯甲酸甲酯、β-柠檬醛、桧烯、β-罗勒烯、β-石竹烯、3-蒈烯和芳樟醇,分别占对照植株的总挥发性精油成分总量的82.28%和超表达植株挥发性精油成分总量的85.69%。另外,单萜烯作为柑橘精油的主要成分,在超表达锦橙、干扰锦橙及对照锦橙中的含量比率非常近似,都在50%以上。干扰植株中叶片总精油含量降为对照的12.65%,单萜和倍半萜含量显着降低,特别是单萜氧化物含量和倍半萜氧化物含量的比例,但单萜烯和倍半萜烯含量的比例却有所上升。基因编辑植株中总精油含量极低,仅为对照的1.52%,仅残存极微量的单萜柠檬烯和β-环柠檬醛,倍半萜完全未检出。可见,降低Fc MYC2的表达水平会导致单萜和倍半萜合成量的降低,敲除Fc MYC2会造成单萜和倍半萜合成基本终止。因此,通过本研究的结果可以基本确定Fc MYC2是调控柑橘单萜和倍半萜合成的关键基因。
周璇[10]（2019）在《桃蚜Myzus persicae唾液蛋白Mp1与拟南芥PP2-A1互作促进侵袭》文中研究说明植物遭受害虫侵袭时,会产生多种防卫机制。其中植物韧皮部防卫反应（phloem-based defense,PBD）主要是针对刺吸式口器害虫而立义,代表了植物抗虫性的一种特殊机制。PBD包括两种关键组分,一是由凝集素类韧皮部蛋白质（phloem protein,PP）形成的复合体,二是类似葡聚糖合酶（β-1,3-glucan-like,GSL）催化生成的胼胝质。PP复合体与胼胝质堵塞筛管细胞壁和筛孔,阻碍蚜虫刺吸韧皮部。通过本实验室前人对拟南芥PP2基因的研究表明,PP2属于诱导表达的基因,在植物正常生长条件下表达量通常很低,当植物受害虫侵袭或环境胁迫时,表达水平大幅度提高,植物对害虫侵袭的抵抗能力也因此得到加强。拟南芥PP2-A1发生突变时,对桃蚜的抗性大大降低,而拟南芥PP2-A1过表达时,则对蚜虫的取食行为和繁殖力有明显的抑制作用,可见PP2-A1是PP中调控拟南芥PBD的关键基因。桃蚜为使自身顺利取食韧皮部汁液,必然发展出一系列的应对策略来避开或适应植物的PBD。桃蚜（Myzuspersicae Sulzer）是利用口针穿透植物维管束取食韧皮部汁液的一种典型昆虫,蚜虫口针的刺吸取食除对植物造成机械损伤外,还会传播多种植物病毒。桃蚜需要与其宿主形成密切联系,以便顺利取食和定殖。在利用口针探测和取食时,桃蚜主要分泌两种类型的唾液,即凝胶型唾液E1和水溶性唾液E2,其中水溶性唾液E2中含有多种酶,可参与抑制植物防卫反应。本课题根据已知的抗蚜基因PP2-A1,通过与桃蚜唾液进行Pull-Down实验,筛选出可能与PP2-A1互作的唾液蛋白即Mp1,接着又用双分子荧光互补实验（bimolecular fluorescence complementation,BiFC）和免疫共沉淀实验（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）进一步验证了 PP2-A1与Mp1的互作关系后,初步探究了Mp1的生物学功能,即拟南芥中PP2-A1的影响会影响Mp1在细胞中的定位,Mp1对桃蚜繁殖具有正向调控作用,因而证明了Mp1可以通过调控拟南芥PBD反应促进桃蚜对拟南芥的侵袭。
二、RNAi的曲折经历与发展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RNAi的曲折经历与发展（论文提纲范文）
（1）酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶1在BCG感染小鼠及巨噬细胞中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 结核分枝杆菌与结核病 |
| 1.1.1 结核病 |
| 1.1.2 结核分枝杆菌 |
| 1.2 巨噬细胞与Mtb的相互作用研究进展 |
| 1.2.1 巨噬细胞在Mtb感染中的作用 |
| 1.2.2 巨噬细胞的异质性与Mtb感染 |
| 1.2.3 巨噬细胞凋亡在Mtb感染中的作用 |
| 1.2.4 巨噬细胞自噬在Mtb感染中的作用 |
| 1.2.5 巨噬细胞炎性反应在Mtb感染中的作用 |
| 1.3 胆固醇代谢在Mtb感染中的作用 |
| 1.3.1 宿主代谢与免疫细胞功能 |
| 1.3.2 Mtb感染与宿主代谢 |
| 1.3.3 Mtb感染与脂代谢 |
| 1.3.4 胆固醇代谢在Mtb感染中的作用 |
| 1.4 ACAT1在疾病发生发展中的作用 |
| 1.5 科学问题和研究目的意义 |
| 第二章 BCG感染牛肺泡巨噬细胞转录组测序分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞与菌株来源 |
| 2.2.2 试剂耗材 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 PCR引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 PBAMs的分离培养 |
| 2.3.2 RAW264.7细胞培养 |
| 2.3.3 BCG培养 |
| 2.3.4 BCG感染巨噬细胞 |
| 2.3.5 荧光定量PCR |
| 2.3.6 RNA-Seq分析 |
| 2.3.7 Western blot检测 |
| 2.3.8 数据统计分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 PBAMs分离培养结果 |
| 2.4.2 RNA-Seq分析部分结果 |
| 2.4.3 qRT-PCR结果 |
| 2.4.4 Westen blot检测结果 |
| 2.4.5 细胞内游离胆固醇检测结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 ACAT1对BCG诱导细胞凋亡的调控作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞与菌株来源 |
| 3.2.2 试剂耗材 |
| 3.2.3 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞复苏、传代、冻存和计数 |
| 3.3.2 BCG培养 |
| 3.3.3 BCG感染巨噬细胞 |
| 3.3.4 细胞凋亡率的检测 |
| 3.3.5 总活性氧水平的检测 |
| 3.3.6 钙离子水平的检测 |
| 3.3.7 抑制ACAT1与BCG共处理小鼠模型的建立 |
| 3.3.8 过表达ACAT1与BCG共处理小鼠模型的建立 |
| 3.3.9 TUNEL法检测肺组织细胞凋亡小体 |
| 3.3.10 数据统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 BCG感染巨噬细胞不同时间凋亡率检测 |
| 3.4.2 BCG感染巨噬细胞不同时间凋亡相关蛋白的表达 |
| 3.4.3 过表达/干扰ACAT1的RAW264.7细胞株功能验证 |
| 3.4.4 过表达ACAT1对BCG感染巨噬细胞凋亡的调控作用 |
| 3.4.5 干扰ACAT1对BCG诱导巨噬细胞凋亡的调控作用 |
| 3.4.6 抑制ACAT1对BCG诱导巨噬细胞凋亡的调控作用 |
| 3.4.7 各处理组小鼠肺组织ACAT1的表达 |
| 3.4.8 过表达ACAT1对BCG感染小鼠肺组织细胞凋亡的调控作用 |
| 3.4.9 抑制ACAT1对BCG感染小鼠肺组织细胞凋亡的调控作用 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 ACAT1对BCG感染后炎性反应的调控作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞与菌株来源 |
| 4.2.2 试剂耗材 |
| 4.2.3 主要仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 BCG培养 |
| 4.3.3 BCG感染巨噬细胞 |
| 4.3.4 炎性因子的ELISA检测 |
| 4.3.5 Westen blot检测 |
| 4.3.6 抑制ACAT1与BCG共处理小鼠模型的建立 |
| 4.3.7 过表达ACAT1与BCG共处理小鼠模型的建立 |
| 4.3.8 小鼠肺部组织病理学观察 |
| 4.3.9 小鼠肺组织炎性因子抗体芯片检测 |
| 4.3.10 蛋白质组学分析 |
| 4.3.11 数据统计分析 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 BCG感染巨噬细胞不同时间TLR2、TLR4蛋白的表达 |
| 4.4.2 BCG感染巨噬细胞不同时间促炎因子的释放 |
| 4.4.3 BCG感染过表达/干扰ACAT1的巨噬细胞后促炎因子的释放 |
| 4.4.4 BCG感染过表达/干扰ACAT1的巨噬细胞后TLR信号相关蛋白的表达 |
| 4.4.5 抑制ACAT1对BCG感染小鼠肺组织炎性反应的调控 |
| 4.4.6 过表达ACAT1对BCG感染小鼠肺组织炎性反应的调控 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 ACAT1对BCG诱导细胞自噬的调控作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 细胞与菌株来源 |
| 5.2.2 试剂耗材 |
| 5.2.3 主要仪器设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞培养 |
| 5.3.2 BCG培养 |
| 5.3.3 BCG感染巨噬细胞 |
| 5.3.4 自噬流的检测 |
| 5.3.5 自噬溶酶体的电镜检测 |
| 5.3.6 抑制ACAT1与BCG共处理小鼠模型的建立 |
| 5.3.7 过表达ACAT1与BCG共处理小鼠模型的建立 |
| 5.3.8 Western blot检测 |
| 5.3.9 细菌载量检测 |
| 5.3.10 数据统计分析 |
| 5.4 实验结果与分析 |
| 5.4.1 抑制ACAT1与BCG共处理的巨噬细胞自噬相关蛋白的表达 |
| 5.4.2 抑制ACAT1与BCG共处理的巨噬细胞自噬流的检测 |
| 5.4.3 抑制ACAT1与BCG共处理的巨噬细胞自噬溶酶体的电镜检测 |
| 5.4.4 ACAT1对BCG感染小鼠肺组织自噬的调控 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 结论和展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）Asprosin负调控海马METTL3-m6A-YTHDF1轴：糖尿病认知功能障碍新机制（论文提纲范文）
| 课题资助 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略语中英文索引 |
| 第一章 绪论 |
| 第二章 糖尿病大鼠同时存在认知障碍、海马Asprosin升高和METTL3-m~6A-YTHDF1轴紊乱 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 海马过表达Asprosin可诱导大鼠认知功能障碍和海马METTL3-m~6A-YTHDF1轴紊乱 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第四章 沉默海马Asprosin可逆转糖尿病大鼠海马METTL3-m~6A-YTHDF1轴紊乱、改善其认知功能 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 总结与结论 |
| 参考文献 |
| 综述 m~6A甲基化在神经系统疾病的作用 |
| 参考文献 |
| 作者攻读学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（3）Hox基因Antennapedia对昆虫翅发育的功能探究及机制解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 概述 |
| 1.1.1 昆虫翅的发生及起源 |
| 1.1.2 昆虫翅形态的多样性 |
| 1.2 Hox基因与昆虫翅发育的研究进展 |
| 1.2.1 Hox基因的概述 |
| 1.2.2 Hox基因对翅发育的影响 |
| 1.2.3 其他基因对昆虫翅发育的影响 |
| 1.3 20E调控昆虫变态发育 |
| 1.3.1 20E合成通路研究 |
| 1.3.2 20E对昆虫变态发育的调控机制研究 |
| 1.3.3 20E对昆虫翅发育的调控机制研究 |
| 1.4 蛋白质组学在昆虫翅发育中的应用 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景与目的意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 Antp对昆虫翅发育的功能探究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 昆虫饲养 |
| 3.1.2 实验材料 |
| 3.1.3 主要试剂、溶液配制及引物序列 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 主要实验步骤 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 Wes突变体表型分析 |
| 3.2.2 Antp对昆虫翅发育的功能探索 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 3.3.1 在家蚕翅原基中上调Antp的表达后对翅发育的影响 |
| 3.3.2 Antp对昆虫翅的发育不可或缺 |
| 第四章 Antp在昆虫翅发育过程中的机制解析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 启动子序列信息及分析工具 |
| 4.1.3 主要试剂、溶液配制及引物序列 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 主要实验步骤 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 Antp通过调控Shade的转录表达影响20E的合成 |
| 4.2.2 20E诱导BmAntp基因在家蚕翅中的表达 |
| 4.2.3 BmAntp转录激活翅发育基因的表达 |
| 4.2.4 Antp调控表皮蛋白的表达影响家蚕翅的发育 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 4.3.1 Antp与20E之间的双向调节作用 |
| 4.3.2 Antp调控翅表皮蛋白基因在翅中表达 |
| 第五章 综合与结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表论文及课题参研情况 |
| 致谢 |
（4）下调乙酰辅酶A羧化酶A基因表达通过调控线粒体功能抑制前列腺癌进展（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词简表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 前列腺癌概述 |
| 1.2 肿瘤细胞能量代谢改变 |
| 1.3 脂代谢与肿瘤 |
| 1.4 ACACA的一般特点 |
| 1.5 ACACA的功能区划分 |
| 1.6 ACACA的生理功能 |
| 1.6.1 ACACA的生理功能 |
| 1.6.2 ACACB的生理功能 |
| 1.7 ACACA调控肿瘤的分子机制及相关信号通路 |
| 1.7.1 ACACA调控肿瘤的分子机制 |
| 1.7.2 肿瘤中ACACA相关信号通路 |
| 1.8 靶向ACACA基因在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.8.1 TOFA |
| 1.8.2 ND-630 |
| 1.8.3 ND-646 |
| 1.8.4 BAY ACC002 |
| 1.8.5 ACACA活性的新型调节剂 |
| 1.9 ACACA与脂代谢在肿瘤细胞中的调节 |
| 1.9.1 阻止脂肪酸合成 |
| 1.9.2 阻断脂肪酸合成基因的表达 |
| 1.9.3 增加脂肪酸降解 |
| 1.9.4 将脂肪酸转移到储存中或阻止脂肪酸从储存中释放 |
| 1.10 目前ACACA在肿瘤中的研究现状 |
| 1.10.1 ACACA在头颈细胞癌中的研究 |
| 1.10.2 ACACA在非小细胞肺癌中的研究 |
| 1.10.3 ACACA在乳腺癌中的研究 |
| 1.10.4 ACACA与p-ACACA在乳腺癌中的研究 |
| 1.10.5 ACACA在胃癌中的研究 |
| 1.10.6 ACACA在肝癌中的研究 |
| 1.10.7 ACACA在前列腺癌中的研究 |
| 1.11 本研究拟解决的问题 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 前列腺癌患者组织芯片 |
| 2.1.2 实验细胞株 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 主要试剂和耗材 |
| 2.1.5 实验主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 免疫组织化学实验及评分方法 |
| 2.2.2 细胞培养冻存和复苏 |
| 2.2.3 载体设计和细胞系构建 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR (qRT-PCR) |
| 2.2.5 免疫印迹(Western blot) |
| 2.2.6 细胞功能实验 |
| 2.2.7 液相色谱-质谱检测(LC-MS)细胞代谢组学检测 |
| 2.2.8 海马线粒体压力检测 |
| 2.2.9 海马XF-ATP效率实时检测 |
| 2.2.10 海马XF糖酵解速率检测 |
| 2.2.11 荧光显微镜及流式细胞术检测线粒体示踪 |
| 2.2.12 比色法检测NAD+/NADH水平 |
| 2.2.13 流式细胞术检测细胞内活性氧水平 |
| 2.2.14 动物实验构建裸鼠肿瘤模型 |
| 2.2.15 统计分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 ACACA在前列腺癌组织中上调其表达与TNM分期有关 |
| 3.2 ACACA基因低表达的前列腺癌细胞系(DU145和PC3)构建 |
| 3.3 敲低ACACA基因抑制前列腺癌细胞(DU145和PC3)功能 |
| 3.4 ACACA基因对前列腺癌细胞(DU145和PC3)凋亡的影响 |
| 3.5 抑制ACACA基因影响DU145和PC3细胞ATP水平 |
| 3.6 PC3细胞中敲低ACACA基因后降低L-棕桐酰肉碱和硬脂肉碱水平及代谢途径相关蛋白表达 |
| 3.7 敲低前列腺癌细胞系ACACA基因抑制线粒体-ATP水平和线粒体潜能 |
| 3.8 ACACA能影响线粒体MTDNA及染色情况 |
| 3.9 ACACA基因影响前列腺癌细胞系NAD+/NADH比值和ROS水平 |
| 3.10 敲低ACACA基因后将抑制裸鼠皮下移植瘤形成 |
| 第四章 讨论 |
| 结论 |
| 本研究的不足之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 31种肿瘤简称 |
| 博士研究生期间所取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）GDF-15通过孤儿受体GFRAL促进胰腺癌增殖及侵袭转移的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 GDF-15在胰腺癌中的表达情况及与临床的相关性 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 GDF-15对胰腺癌细胞增殖及侵袭转移的影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 GFRAL在胰腺癌中表达情况、临床意义及其与GDF-15 表达的相关性 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 GDF-15 通过与孤儿受体GFRAL直接结合促进胰腺癌进展 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 生长分化因子GDF-15的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）鲤春病毒血症病毒的受体捕获及初步筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 鲤春病毒血症病毒的研究进展 |
| 1.1 鲤春病毒血症概述 |
| 1.2 SVC的临床症状 |
| 1.3 SVC的流行特点 |
| 1.4 SVCV的生物学特征 |
| 1.5 SVCV的基因组及其蛋白产物的特征 |
| 1.6 SVCV的诊断与防治 |
| 2 病毒受体概述 |
| 2.1 免疫球蛋白超家族 |
| 2.2 糖蛋白受体 |
| 2.3 其他受体 |
| 3 RNA干扰 |
| 3.1 RNA干扰作用的概述 |
| 3.2 RNAi的发现 |
| 3.3 RNAi的作用机制 |
| 3.4 RNAi的应用 |
| 3.5 siRNA的制备方法 |
| 3.5.1 化学合成siRNA |
| 3.5.2 体外转录法 |
| 3.5.3 RNaseⅢ体外消化dsRNA法 |
| 3.5.4 体内载体表达法 |
| 3.5.5 siRNA表达框架法 |
| 4 本论文的研究目的及意义 |
| 第二章 鲤春病毒血症病毒的纯化 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 生物实验材料及来源 |
| 2.2 实验主要试剂及试剂盒 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 主要试剂的配方 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 SVCV病毒的扩培 |
| 3.2 蔗糖密度梯度离心法纯化病毒颗粒 |
| 3.3 SDS-PAGE检测病毒纯化结果 |
| 3.3.1 制胶 |
| 3.3.2 加样与电泳 |
| 3.4 纯化结果的质谱鉴定 |
| 3.5 Native-PAGE检测病毒的纯度 |
| 3.5.1 配制非变性胶 |
| 3.5.2 加样与电泳 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 鲤春病毒血症病毒的纯化 |
| 4.2 质谱鉴定 |
| 4.3 Native-PAGE检测所纯化病毒的纯度 |
| 5 讨论 |
| 6 本章小结 |
| 第三章 SVCV受体捕获 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 主要材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 EPC的转录组分析 |
| 3.1.1 EPC总RNA提取 |
| 3.1.2 转录组测序 |
| 3.2 使用Sulfo-SBED捕获SVCV受体 |
| 3.2.1 使用Sulfo-SBED标记SVCV病毒粒子 |
| 3.2.2 提取EPC膜蛋白 |
| 3.2.3 标记SVCV与EPC膜蛋白孵育捕获受体 |
| 3.3 使用ASB标记SVCV捕获SVCV受体 |
| 3.3.1 配制相关试剂溶液 |
| 3.3.2 使用ASB标记纯化的SVCV病毒粒子 |
| 3.3.3 标记SVCV与EPC孵育捕获受体 |
| 3.3.4 分离生物素化的蛋白 |
| 3.3.5 质谱鉴定捕获蛋白 |
| 3.4 初步分析捕获蛋白 |
| 3.5 蛋白的跨膜预测 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 EPC的转录组分析 |
| 4.1.1 EPC转录组测序分析 |
| 4.1.2 NR注释物种分布分析 |
| 4.2 受体捕获的结果 |
| 4.3 捕获蛋白的类型分析 |
| 4.4 Blast分析捕获蛋白 |
| 5 讨论 |
| 6 本章小结 |
| 第四章 SVCV受体的初步筛选 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 主要材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 体外转录法制备siRNA |
| 3.1.1 提取EPC细胞的总RNA |
| 3.1.2 RNA的反转录 |
| 3.1.3 制备DNA模板 |
| 3.1.4 制备目的基因dsRNA |
| 3.1.5 纯化dsRNA |
| 3.1.6 RNaseⅢ消化dsRNA |
| 3.1.7 纯化siRNA mix |
| 3.2 建立绝对定量标准曲线 |
| 3.2.1 SVCV核蛋白N核酸序列获取及验证 |
| 3.2.2 SVCV核蛋白N基因qPCR引物的设计 |
| 3.2.3 实时荧光定量PCR作标曲 |
| 3.3 RNAi检测基因沉默效果 |
| 3.3.1 所研究基因的qPCR引物设计 |
| 3.3.2 siRNA mix转染EPC |
| 3.3.3 RNA反转录 |
| 3.3.4 检测各基因沉默效果 |
| 3.4 SVCV攻毒后病毒增殖检测 |
| 3.4.1 siRNA mix转染EPC后攻毒 |
| 3.4.2 检测病毒增殖情况 |
| 3.5 统计学分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 绝对定量标准曲线的建立 |
| 4.1.1 SVCV-N基因的扩增 |
| 4.1.2 菌落PCR验证 |
| 4.1.3 SVCV-N基因测序结果 |
| 4.1.4 绝对定量标准曲线的建立 |
| 4.2 制备含T7启动子序列的DNA模板 |
| 4.2.1 PCR扩增含T7启动子序列的DNA模板 |
| 4.2.2 测序分析 |
| 4.3 siRNA mix制备结果 |
| 4.4 siRNA mix纯化结果 |
| 4.5 RNAi后检测基因沉默效果 |
| 4.6 SVCV攻毒后病毒增殖检测 |
| 5 讨论 |
| 6 本章小结 |
| 第五章 结论 |
| 1 主要研究结论 |
| 2 创新点 |
| 参考文献 |
| 导师评语 |
| 答辩委员会决议书 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 硕士期间学术成果 |
| 附件 |
（7）桔小实蝇细胞色素P450全基因组注释及CYP4G亚家族基因功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 昆虫P450及其特异性CYP4G亚家族 |
| 2 昆虫表皮碳氢化合物 |
| 2.1 化学组成 |
| 2.2 合成途径与运输 |
| 2.3 主要生理学功能与应用 |
| 3 环裂亚目围蛹的发育 |
| 4 研究目的、意义及内容 |
| 第二章 桔小实蝇P450基因注释与表达模式分析 |
| 第一节 桔小实蝇P450基因注释 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第二节 桔小实蝇P450基因表达模式分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第三节 桔小实蝇CYP4G亚家族基因克隆与表达模式分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第三章 桔小实蝇CYP4G100调节表皮烃类物质合成 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第四章 桔小实蝇CYP4G188调节蛹-成虫蜕皮 |
| 第一节 桔小实蝇蛹期转录组测序 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第二节 桔小实蝇围蛹发育阶段划分 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第三节 桔小实蝇CYP4G188介导蛹-成虫蜕变过程 |
| 1 材料方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第五章 CYP4G100和CYP4G188 的异源表达与活性检测 |
| 第一节 CYP4G100与CYP4G188 原核表达 |
| 1 材料方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第二节 CYP4G100与CYP4G188 真核表达 |
| 1 材料方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第六章 主要结果和结论、创新点及研究展望 |
| 1 主要结果和结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间发表论文及参加科研课题情况 |
| 致谢 |
（8）基于核酸纳米凝胶的功能性核酸递送系统研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 基因治疗 |
| 1.1.1 基因治疗的概念 |
| 1.1.2 基因治疗的分类 |
| 1.2 核酸药物递送系统 |
| 1.2.1 核酸药物递送屏障 |
| 1.2.2 质粒类核酸药物递送系统 |
| 1.2.3 mRNA类核酸药物递送系统 |
| 1.2.4 siRNA/miRNA类核酸药物递送系统 |
| 1.2.5 基因编辑类核酸药物递送系统 |
| 1.3 DNA纳米结构在核酸药物递送领域的应用 |
| 1.3.1 DNA纳米结构的发展 |
| 1.3.2 DNA纳米结构在核酸药物递送领域的应用 |
| 1.4 纳米凝胶在核酸药物递送领域中的应用 |
| 1.4.1 纳米凝胶的概述 |
| 1.4.2 纳米凝胶在核酸药物递送领域中的应用 |
| 1.5 本论文的研究目的、主要内容和意义 |
| 第二章 核酸纳米凝胶有效递送siRNA用于肿瘤治疗 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验药品、仪器及设备 |
| 2.2.2 核酸纳米凝胶的制备 |
| 2.2.3 核酸纳米凝胶的表征 |
| 2.2.4 细胞实验 |
| 2.2.5 动物实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 ethyl-poly(α-N3-εCL)的合成与表征 |
| 2.3.2 DNA-g-PCL的合成与表征 |
| 2.3.3 核酸纳米凝胶的制备与表征 |
| 2.3.4 核酸纳米凝胶的稳定性表征 |
| 2.3.5 RNase H介导的功能性核酸片段siRNA释放行为研究 |
| 2.3.6 核酸纳米凝胶细胞内摄行为研究 |
| 2.3.7 细胞层次核酸纳米凝胶基因沉默行为研究 |
| 2.3.8 动物层次核酸纳米凝胶基因沉默行为研究 |
| 2.3.9 核酸纳米凝胶药代动力学以及皮下肿瘤聚集行为研究 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 核酸纳米凝胶共递送Cas9与sgRNA用于基因编辑 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验药品、仪器以及设备 |
| 3.2.2 包载Cas9/sgRNA的核酸纳米凝胶制备 |
| 3.2.3 包载Cas9/sgRNA的核酸纳米凝胶表征 |
| 3.2.4 细胞实验 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 包载Cas9/sgRNA的核酸纳米凝胶合成与表征 |
| 3.3.2 包载Cas9/sgRNA的核酸纳米凝胶稳定性表征 |
| 3.3.3 DNaseⅠ介导的Cas9/sgRNA释放行为研究 |
| 3.3.4 包载Cas9/sgRNA的核酸纳米凝胶体外基因剪切研究 |
| 3.3.5 包载Cas9/sgRNA的核酸纳米凝胶内摄行为研究 |
| 3.3.6 包载Cas9/sgRNA的核酸纳米凝胶细胞层次基因编辑行为研究 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 负载聚多巴胺涂层的核酸纳米凝胶用于siRNA介导的低温光热治疗 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验药品、仪器及设备 |
| 4.2.2 聚多巴胺涂层的核酸纳米凝胶的制备 |
| 4.2.3 负载聚多巴胺涂层的核酸纳米凝胶表征 |
| 4.2.4 细胞实验 |
| 4.2.5 动物实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 负载聚多巴胺涂层的核酸纳米凝胶合成与表征 |
| 4.3.2 负载聚多巴胺涂层的核酸纳米凝胶光热性能表征 |
| 4.3.3 负载聚多巴胺涂层的核酸纳米凝胶稳定性表征 |
| 4.3.4 RNase H介导的功能性核酸片段siRNA释放行为研究 |
| 4.3.5 负载聚多巴胺涂层的核酸纳米凝胶细胞内摄行为研究 |
| 4.3.6 负载聚多巴胺涂层的核酸纳米凝胶细胞层次基因沉默行为研究 |
| 4.3.7 负载聚多巴胺涂层的核酸纳米凝胶细胞层次低温光热治疗研究 |
| 4.3.8 负载聚多巴胺涂层的核酸纳米凝胶药代动力学以及皮下肿瘤聚集行为研究 |
| 4.3.9 负载聚多巴胺涂层的核酸纳米凝胶动物层次光热性能研究 |
| 4.3.10 负载聚多巴胺涂层的核酸纳米凝胶动物层次低温光热治疗研究 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文的主要内容和结论 |
| 5.2 工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表或投寄的学术论文 |
（9）调控柑橘精油生物合成关键基因的挖掘（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 植物精油概述 |
| 1.2 植物萜类生物合成途径 |
| 1.3 萜类合成的转录调控 |
| 1.4 柑橘油胞与精油研究进展 |
| 第2章 引言 |
| 第3章 金柑油胞发育与精油成分分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 金柑果实及油胞性状测量 |
| 3.1.3 精油成分分析 |
| 3.1.4 数据分析与制图 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 金柑果实发育过程中果皮油胞性状调查 |
| 3.2.2 金柑果皮挥发性精油成分分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 金柑果实发育过程中油胞发育及果皮精油的积累特征 |
| 3.3.2 果实发育过程中果皮精油成分的变化 |
| 3.3.3 果皮精油含量的增加是由单萜和倍半萜含量增加造成的 |
| 第4章 基于RNA-Seq筛选调控精油合成的关键基因 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 叶片及果皮油胞观察与计数 |
| 4.1.3 果皮精油含量的测定 |
| 4.1.4 RNA的提取 |
| 4.1.5 RNA-seq |
| 4.1.6 qRT-PCR分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 HP和 RA叶片和果皮外观和油胞形态比较 |
| 4.2.2 HP和 RA果皮精油含量分析 |
| 4.2.3 RNA-seq数据比对分析 |
| 4.2.4 DEGs的 GO和 KEGG富集 |
| 4.2.5 萜类合成相关基因的分析 |
| 4.2.6 转录调控基因的分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 FcMYC2 的序列和表达特征 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 引物 |
| 5.1.2 FcMYC2 基因的克隆 |
| 5.1.3 FcMYC2 序列分析 |
| 5.1.4 FcMYC2 的亚细胞定位 |
| 5.1.5 FcMYC2 的表达特征分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 FcMYC2 全长序列的获得 |
| 5.2.2 FcMYC2 的碱基和氨基酸序列分析 |
| 5.2.3 FcMYC2 的亚细胞定位 |
| 5.2.4 FcMYC2的Me JA诱导 |
| 5.2.5 FcMYC2 的组织表达特征 |
| 5.2.6 FcMYC2 在不同柑橘品种果皮中的表达及精油含量分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 柑橘的FcMYC2 是一个序列特异性极高的MYC2型bHLH家族基因 |
| 5.3.2 FcMYC2 的表达水平与精油的合成密切相关 |
| 第6章 转基因验证FcMYC2 对柑橘精油合成的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 引物 |
| 6.1.2 FcMYC2 的表达载体构建 |
| 6.1.3 遗传转化 |
| 6.1.4 转基因材料表型分析 |
| 6.1.5 编辑位点测序分析 |
| 6.1.6 转基因材料的基因表达分析及挥发性精油成分分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 转基因植株的获得 |
| 6.2.2 转基因植株的表型变异 |
| 6.2.3 基因编辑植株的编辑特征分析 |
| 6.2.4 转基因植株材料的基因表达分析 |
| 6.2.5 转基因植株的挥发性精油成分分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 超表达FcMYC2 未能提高锦橙叶片精油的含量 |
| 6.3.2 转基因植株油胞分泌腔细小的原因 |
| 第7章 讨论与结论 |
| 7.1 讨论 |
| 7.2 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录 Ⅰ 缩略词 |
| 附录 Ⅱ PEG介导的拟南芥原生质体转化 |
| 致谢 |
| 发表论文及参与课题 |
（10）桃蚜Myzus persicae唾液蛋白Mp1与拟南芥PP2-A1互作促进侵袭（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 植物防卫反应 |
| 1 植物抗虫性的分类 |
| 1.1 组成抗性 |
| 1.2 诱导抗性 |
| 2 植物韧皮部防卫反应(phloem-based defense,PBD) |
| 2.1 植物韧皮部组分概况 |
| 2.2 植物韧皮部防卫反应 |
| 2.3 MYB调控PBD的信号传导 |
| 第二章 刺吸式昆虫唾液蛋白研究 |
| 1 蚜虫唾液概况 |
| 2 蚜虫唾液研究进展 |
| 2.1 蚜虫唾液鞘研究进展 |
| 2.2 蚜虫水溶性唾液研究进展 |
| 2.3 蚜虫唾液效应因子抑制植物防卫反应研究进展 |
| 2.4 桃蚜唾液效应因子Mp1可促进桃蚜侵袭 |
| 第三章 RNA干扰技术在昆虫研究中的应用 |
| 1 传统害虫防治方法 |
| 2 RNA干扰技术 |
| 3 饲喂法选用昆虫人工饲料的研究进展 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 下篇 研究内容 |
| 第一章 拟南芥PP2-A1与桃蚜唾液蛋白Mp1互作 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物品种与培养条件 |
| 1.2 菌株和载体 |
| 1.3 桃蚜与饲养条件 |
| 1.4 韧皮部相关基因PP2在MYB基因沉默植株中的表达水平测定 |
| 1.5 原核表达载体的构建 |
| 1.6 蛋白表达及测定 |
| 1.7 桃蚜唾液的提取 |
| 1.8 PP2-A1与桃蚜唾液总蛋白Pull-Down实验 |
| 1.9 BiFC验证A1与Mp1互作 |
| 1.10 Co-IP验证A1与Mp1互作 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 韧皮部相关基因PP2在MYB基因沉默植株中的表达水平 |
| 2.2 拟南芥PP2-A1原核表达载体的构建 |
| 2.3 拟南芥PP2-A1-His的Western blotting验证 |
| 2.4 桃蚜唾液蛋白提取 |
| 2.5 PP2-A1与桃蚜唾液总蛋白Pull-Down实验 |
| 2.6 BiFC验证PP2-A1与Mp1互作 |
| 2.7 Co-IP验证PP2-A1与Mp1互作 |
| 3 讨论 |
| 第二章 桃蚜唾液蛋白Mp1生物学功能验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 培养供试植物 |
| 1.2 饲喂供试蚜虫 |
| 1.3 Mp1在拟南芥叶片中的亚细胞定位 |
| 1.4 RNA干扰(RNA interference, RNAi) |
| 1.5 反转录反应 |
| 1.6 RNAi沉默效果的检测分析 |
| 1.7 Mp1对桃蚜繁殖率的影响检测 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 亚细胞定位实验 |
| 2.2 通过RNAi实验测定Mp1对桃蚜繁殖的影响 |
| 2.3 Mp1对桃蚜繁殖率的影响检测 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
四、RNAi的曲折经历与发展（论文参考文献）
- [1]酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶1在BCG感染小鼠及巨噬细胞中的作用研究[D]. 徐金瑞. 宁夏大学, 2021(02)
- [2]Asprosin负调控海马METTL3-m6A-YTHDF1轴：糖尿病认知功能障碍新机制[D]. 康璇. 南华大学, 2021
- [3]Hox基因Antennapedia对昆虫翅发育的功能探究及机制解析[D]. 方春燕. 西南大学, 2021(01)
- [4]下调乙酰辅酶A羧化酶A基因表达通过调控线粒体功能抑制前列腺癌进展[D]. 张慧. 华南理工大学, 2020(05)
- [5]GDF-15通过孤儿受体GFRAL促进胰腺癌增殖及侵袭转移的机制研究[D]. 赵志平. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [6]鲤春病毒血症病毒的受体捕获及初步筛选[D]. 香凤. 深圳大学, 2020(10)
- [7]桔小实蝇细胞色素P450全基因组注释及CYP4G亚家族基因功能研究[D]. 景田兴. 西南大学, 2020
- [8]基于核酸纳米凝胶的功能性核酸递送系统研究[D]. 丁飞. 上海交通大学, 2019
- [9]调控柑橘精油生物合成关键基因的挖掘[D]. 刘小丰. 西南大学, 2019(05)
- [10]桃蚜Myzus persicae唾液蛋白Mp1与拟南芥PP2-A1互作促进侵袭[D]. 周璇. 南京农业大学, 2019(08)