嗜热细菌Anaerobaculum hydrogeniforman Pif1解旋酶的异源表达与解旋反应特性

论文摘要

【目的】原核表达与纯化源自嗜热细菌Anaerobaculum hydrogeniforman的Pif1解旋酶,从而探究其解旋反应特性。【方法】将重组载体pET21a-AnaPif1-TEV/SUMO导入大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,并进行Ni-NTA亲和层析、Superdex200凝胶过滤层析等一系列纯化手段;再利用快速停留监测技术系统地研究Ana.Pif1的解旋反应特性,包括解旋极性、最佳ATP浓度、最佳金属辅因子、最佳解旋温度以及解旋复制中间体DNA的底物特异性。【结果】通过异源表达与纯化,获得了无任何标签序列、分子量59 kDa的Ana.Pif1蛋白,纯度达97%,产率为9.5 mg/L。本研究首先验证Ana.Pif1具有5’’-3’’的解旋极性,并发现其解旋反应最佳ATP浓度为2 mmol/L,其最佳二价金属辅因子为Mg2+,最适反应温度为55°C。解旋复制中间体的底物特异性显示,Y-S型复制叉的解旋速率最高,为0.127s–1;而12 nt-bubble底物的解旋幅度最大,达到78.8%;暗示这些底物可能是Ana.Pif1的天然底物。【结论】本文首次较为系统地分析了Ana.Pif1解旋酶的解旋反应特性,为阐明此类嗜热细菌Pif1解旋酶的分子作用机制奠定了基础。

论文目录

• 1 材料和方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 质粒、引物及菌株:
•     1.1.2 DNA底物:
•     1.1.3主要试剂及工具酶:
•   1.2 Ana.Pif1解旋酶的表达载体构建
•   1.3 Ana.Pif1蛋白的原核表达与纯化
•   1.4 基于Stopped-flow FRET技术检测Ana.Pif1解旋反应
•   1.5 统计学分析
• 2 结果和分析
•   2.1 Ana.Pif1表达载体的构建
•   2.2 Ana.Pif1重组蛋白的表达与纯化
•   2.3 Ana.Pif1解旋酶的解旋极性
•   2.4 ATP浓度对Ana.Pif1解旋反应的影响
•   2.5 不同金属辅离子对Ana.Pif1解旋反应的影响
•   2.6 Ana.Pif1解旋反应的嗜热特性
•   2.7 Ana.Pif1解旋不同复制中间体的底物特异性
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 段晓雷,刘娜女,张涛,曹睿,姜钧耀,闵迅,奚绪光

关键词: 解旋酶,嗜热厌氧棒菌,快速停留检测,解旋特征参数

来源: 微生物学报 2019年03期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 遵义医学院附属医院检验科,西北农林科技大学生命科学学院,河南科技大学动物科技学院

基金: 国家自然科学基金(31660241),贵州省科技合作基础研究项目(黔科合基础[2018]1196),遵义医学院博士科研启动资金[院字(2017)05],遵义医学院大学生创新创业训练计划(ZKDC2018005)~~

分类号: Q936

DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20180214

页码: 566-577

总页数: 12

文件大小: 1523K

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