植物ABA与TOR信号互作的分子机理研究

论文摘要

植物在生长发育过程中,要遭受各种各样的生物或非生物胁迫。为了适应环境的改变和抵抗病原菌入侵,植物相应的进化出了一套精确的调控机制来抵抗环境胁迫。ABA是植物抵抗非生物胁迫一个关键的植物激素,ABA通过调节气孔的关闭和增加ABA应答基因的表达来提高植物对非生物胁迫的抵抗能力。ABA信号与TOR信号、BR信号和JA信号都存在相互作用以此来调控植物的生长和胁迫应答,其中ABA信号通路的转录因子ABI4和ABI5在ABA信号与其他植物激素信号交叉互作中发挥着关键的作用。TOR信号通路是调控植物生长和发育的一个关键枢纽,解析TOR信号通路和ABA信号通路之间的交叉互作对理解植物协调生长和抵抗外界环境胁迫之间的动态平衡具有重要的意义,特别是目前还未见植物ABI4和ABI5是否参与调控TOR信号通路的报道。本文通过遗传学、生物化学和分子生物学以及转录组测序的方法,揭示了ABI4和ABI5与TOR信号和自噬信号存在相互作用以此来调控植物生长和胁迫应答之间的平衡。本研究主要得到了以下的结果和结论:（1）通过使用TOR抑制剂AZD首次从EMS突变体库中筛选获得对TOR抑制剂AZD不敏感的突变体trin1,精细定位和测序结果表明TRIN1是ABI4的等位基因。进一步功能分析表明ABI4在叶绿体发育和叶绿素代谢方面发挥着重要的作用,过表达ABI4的转基因拟南芥对AZD高度敏感,表现为抑制拟南芥幼苗下胚轴的延伸和子叶的伸展,导致子叶不能变绿。GUS染色结果表明用AZD抑制TOR的活性后导致ABI4蛋白大量积累,从而抑制叶绿体的发育和植物的生长。以上结果表明在拟南芥中TOR通过促进TRIN1/ABI4的降解来正向调控叶绿体的发育和植物的生长。（2）使用TOR的特异性抑制剂雷帕霉素RAP和AZD能够抑制拟南芥的生长发育;同时,发现ABA生物合成和ABA应答基因的表达水平显著上调。在TOR抑制的情况下拟南芥体内ABA的含量显著上升,表明TOR的抑制诱导ABA的生物合成,从而激活ABA应答基因的表达。将半抑制浓度GI50的RAP和ABA同时处理BP12-2时,BP12-2拟南芥的种子萌发后子叶不能扩展变绿、下胚轴和根不能伸长,幼苗几乎停止生长。进一步测试和计算药物效应联合指数CI值,发现RAP+ABA的CI值明显小于1,表明RAP和ABA能够产生强的协同效应来抑制BP12-2拟南芥幼苗的生长。在植物中TOR的抑制相当于模拟植物遭受非生物胁迫,植物因此产生ABA激活ABA应答基因的表达来抵抗该胁迫。这些结果暗示着TOR和ABA信号之间可能存在交叉互作来协同调控植物的生长和胁迫应答。（3）药物敏感性实验发现abi5-1突变体拟南芥对AZD不敏感,过表达AtABI5转基因拟南芥对AZD高度敏感。AZD抑制TOR的活性后,使得过表达AtABI5转基因拟南芥的子叶不能变绿和扩展、下胚轴和根不能伸长,从而严重阻碍幼苗的生长发育。GUS染色结果表明用AZD抑制TOR的活性后导致ABI5蛋白大量积累,从而抑制拟南芥的生长和发育。酵母双杂实验发现AtS6K2与AtABI5全长以及含有bZIP结构域的AtABI5-C端存在相互作用,进一步的双分子荧光互补实验（BiFC）确认了AtS6K2与AtABI5的相互作用,并且AtABI5和AtS6K2主要是在细胞核内存在互作。这些结果表明TOR和ABA信号之间通过AtS6K2与AtABI5的相互作用来调控植物的生长和发育。（4）在黑暗条件下,abi5-1突变体与野生型相比较能够显著的减缓叶片的衰老和黄化,然而过表达AtABI5的转基因拟南芥加速了叶片的衰老和黄化过程。Western blot和MDC染色观察发现,abi5-1突变体在黑暗处理后自噬体明显少于野生型对照,而过表达AtABI5的拟南芥叶片在黑暗处理后的自噬体显著地多于野生型对照组;并且过表达AtABI5的拟南芥叶片在黑暗处理后自噬相关基因的表达水平也显著的高于野生型对照,表明在黑暗条件下AtABI5参与调控自噬过程。酵母双杂交和双分子荧光互补实验发现AtABI5和AtKIN10/11存在相互作用,而且在AtABI5蛋白序列上含有保守的SnRK1α磷酸化位点,暗示着AtKIN10/11可能通过磷酸化AtABI5来调控其蛋白活性,以此来介导自噬和ABA信号。（5）对StABI5进行基本的生物信息学分析发现和拟南芥一样StABI5也包含有保守的C1、C2、C3、bZIP和C4结构域,并且StABI5在马铃薯的大部分组织都有表达。亚细胞定位分析发现在烟草瞬时表达中StABI5主要定位于细胞核中。过表达StABI5转基因马铃薯株系明显比野生型Desiree更早的成熟和衰老,转基因马铃薯叶片表现出黄化和早衰的表型;并且转基因StABI5的马铃薯叶片在黑暗处理下进一步加速了叶片的黄化和衰老,表明StABI5参与叶绿体和自噬调控,这与拟南芥AtABI5的功能是一致的。（6）对过表达StABI5转基因马铃薯进行转录组测序分析表明StABI5在调节马铃薯光合作用、叶绿体发育、蛋白质合成和自噬中具有重要的作用。转录组数据表明在过表达StABI5转基因马铃薯植株中参与光合作用和碳固定的绝大部分基因都显著下调,说明在马铃薯中StABI5负调控光合作用相关基因的表达。此外,参与auxin、CKs、GA、BRs、ET和JA等植物激素信号传导通路的许多基因都发生了改变,意味着在马铃薯中StABI5参与调控这些植物激素信号,这些结果表明StABI5与植物激素信号通路之间存在紧密而复杂的调控机制。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 1 绪论
•   1.1 问题的提出及研究意义
•   1.2 国内外研究现状
•     1.2.1 ABA信号通路研究进展
•     1.2.2 ABA信号通路中的转录因子
•     1.2.3 ABI4 在植物生长发育过程中的功能研究
•     1.2.4 ABI5 在植物生长发育过程中的功能研究
•     1.2.5 TOR信号通路
•     1.2.6 自噬
• 2 TRIN1（TOR-inhibitor insensitive-1）调控拟南芥子叶变绿
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 实验试剂和仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 拟南芥种子消毒和培养条件
•     2.2.2 EMS诱变拟南芥种子
•     2.2.3 EMS诱变拟南芥种子突变体库的筛选
•     2.2.4 突变体定位群体的构建
•     2.2.5 SSR分子标记
•     2.2.6 载体的构建和拟南芥转化
•     2.2.7 定量PCR分析基因表达水平
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 TOR抑制剂AZD阻止拟南芥子叶变绿
•     2.3.2 trin1 突变体的筛选和定位
•     2.3.3 TRIN1 整合ABA和 TOR信号来调控种子到幼苗的转变
•     2.3.4 在光合自养阶段TOR通过TRIN1 来调控叶绿素代谢
•     2.3.5 TOR信号负调控TRIN1/ABI4 蛋白的稳定性
•   2.4 分析与讨论
•     2.4.1 AZD是一个高特异性的TOR抑制剂
•     2.4.2 TRIN1/ABI4是TOR信号的下游组分
•     2.4.3 TOR通过TRIN1/ABI4 来调控子叶变绿和下胚轴延伸
• 3 拟南芥AtABI5 介导TOR和 ABA信号
•   3.1 材料和方法
•     3.1.1 植物材料
•     3.1.2 实验试剂和仪器
•     3.1.3 TOR抑制剂和ABA联合处理拟南芥
•     3.1.4 联合指数CI值的计算
•     3.1.5 ABA含量的测定
•     3.1.6 定量PCR分析ABA合成和应答基因的表达水平
•     3.1.7 GUS染色和定量分析
•     3.1.8 酵母双杂交
•     3.1.9 双分子荧光互补（BiFC）实验
•   3.2 实验结果
•     3.2.1 TOR抑制剂和ABA协同抑制拟南芥幼苗的生长
•     3.2.2 TOR调控ABA生物合成和应答基因的表达
•     3.2.3 ABI5 介导TOR信号的传递
•     3.2.4 TOR调控ABI5 的稳定性
•     3.2.5 在拟南芥中AtABI5和AtS6K2 存在互作
•   3.3 分析与讨论
• 4 在拟南芥中AtSnRK1.1/1.2 激活AtABI5 来调控自噬
•   4.1 材料和方法
•     4.1.1 植物材料
•     4.1.2 实验试剂
•     4.1.3 ABI5 过表达拟南芥植株黑暗处理
•     4.1.4 叶片黑暗处理
•     4.1.5 MDC染色检测自噬体
•     4.1.6 酵母双杂交
•     4.1.7双分子荧光互补实验
•     4.1.8 Western blot
•   4.2 实验结果
•     4.2.1 在黑暗条件下ABI5 调控叶绿素代谢
•     4.2.2 ABI5 参与自噬调控
•     4.2.3 AtKIN10 参与调控自噬
•     4.2.4 AtKIN10/11和AtABI5 存在相互作用
•     4.2.5 AtABI5 保守的AtKIN10/11 磷酸化位点分析
•   4.3 分析与讨论
• 5 马铃薯StABI5 的生物信息学分析和功能鉴定
•   5.1 材料和方法
•     5.1.1 植物材料
•     5.1.2 实验试剂
•     5.1.3 StABI5 的生物信息学分析
•     5.1.4 马铃薯StABI5 的表达模式分析
•     5.1.5 马铃薯的遗传转化
•     5.1.6 Western blot检测StABI5 转基因株系
•     5.1.7 叶片黑暗处理
•     5.1.8 用于转录组测序所需的总RNA的提取
•     5.1.9 文库构建和上机测序
•     5.1.10 序列比对到参考基因组
•     5.1.11 基因差异表达分析和差异基因富集分析
•     5.1.12 qRT-PCR验证转录组数据
•   5.2 实验结果
•     5.2.1 StABI5 的生物信息学分析
•     5.2.2 StABI5 在马铃薯中的表达模式分析
•     5.2.3 StABI5 转基因马铃薯的鉴定
•     5.2.4 在黑暗条件下StABI5 转基因株系能够加速叶片的黄化和衰老
•     5.2.5 转录组用的总RNA提取结果
•     5.2.6 转录组测序结果基本信息
•     5.2.7 差异表达基因分析
•     5.2.8 差异表达基因的GO功能富集分析
•     5.2.9 差异表达基因的KEGG pathway富集分析
•     5.2.10 在马铃薯中StABI5 参与调控光合作用
•     5.2.11 StABI5 参与自噬调控
•     5.2.12 StABI5 参与植物激素信号传导
•     5.2.13 qRT-PCR验证转录组数据
•   5.3 分析与讨论
• 6 全文结论与展望
•   6.1 主要结论
•   6.2 本论文的创新点
•   6.3 后续的研究与展望
• 参考文献
• 附录
•   A.作者在攻读博士学位期间发表的论文目录
•   B.作者在攻读学位期间取得的科研成果目录
•   C.附表
•   D.学位论文数据集
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 李林宣

导师: 李正国,任茂智

关键词: 信号,自噬,叶绿体发育

来源: 重庆大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 重庆大学

分类号: Q943

总页数: 128

文件大小: 11041K

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