导读:本文包含了贝氏柯克斯体论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:柯克,多糖,载体,免疫,立克次体,蛋白,质粒。
贝氏柯克斯体论文文献综述
张雪飞,王明贵[1]（2019）在《贝氏柯克斯体感染——寻常与不寻常》一文中研究指出1991-2016年,法国国家Q热参改中心的研究人员根据实验室证据以及相关临床资料确诊2434例贝氏柯克斯体感染。这些患者的平均年龄为51.8岁,男性患者人数是女性的2.2倍。1806例(74.2%)患者为急性Q热,其中766例有局灶感染伴或不伴持续性感染症状(>3个月);138例急(本文来源于《中国感染与化疗杂志》期刊2019年06期）
何泽民,孙志会,于永慧,罗声栋,王益清[2]（2019）在《贝氏柯克斯体九里株Ⅱ相突变体的克隆与鉴定》一文中研究指出目的:克隆分离国内贝氏柯克斯体九里株Ⅱ相突变体,并利用基因组测序方法进行鉴定,为贝氏柯克斯体研究提供参考依据。方法:用半固体平板法克隆分离贝氏柯克斯体,对随机选择的克隆株CB01进行全基因组测序分析,将测序结果与国外贝氏柯克斯体不同克隆株的基因组进行比较分析。结果:CB01的基因组全长2.024 Mb,包含1个1.987 Mb的环状染色体和1个37.321 kb的质粒。与九里株Ⅰ相菌(RSA 493克隆)基因组相比,CB01多出5个重复序列,有1个25 997 bp的删除区,23个单核苷酸多态性位点(SNP)差异。与九里株Ⅱ相菌(RSA 439克隆)基因组相比,CB01同样多出5个重复序列,但仅有6个SNP差异。CB01与RSA 439的CBU_0533基因序列完全相同,可解释CB01缺失O抗原从而成为Ⅱ相菌。结论:贝氏柯克斯体九里株Ⅱ相菌克隆CB01与国外Ⅱ相菌RSA 439高度同源,CB01可用做国内贝氏柯克斯体研究用参考菌株。(本文来源于《生物技术通讯》期刊2019年02期）
何泽民[3]（2019）在《贝氏柯克斯体兼性好氧突变体的分离与鉴定》一文中研究指出贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,Cb)是人类Q热的病原体,主要通过气溶胶传播,对人和动物感染性强。人类感染Q热主要表现为急性流感样症状,以发热、头痛为主,可能会引起慢性感染~([1]),最常见的是心内膜炎~([2])。贝氏柯克斯体九里株源自美国~([3]),是Q热研究中常用的参考菌株~([4])。九里株在体外传代培养时易发生变异,由有毒的I相菌变异为弱毒的Crazy相~([5])或无毒的II相~([6,7])。过去几十年里一直认为贝氏柯克斯体是专性胞内寄生菌,不能在细胞外培养。传统的培养方法主要是感染动物、鸡胚培养和细胞培养,2009年美国NIH落基山实验室发明了贝氏柯克斯体无细胞培养方法~([8])。无细胞培养技术提高了贝氏柯克斯体的培养效率,并简化了遗传操作的方法~([8,9])。国外的研究发现贝氏柯克斯体是严格微好氧菌,无细胞培养需要一定浓度的氧气,但是氧浓度不超过10%~([8,9,10])。本研究第一部分是对九里II相株进行克隆分纯和全基因组序列分析。贝氏柯克斯体培养周期长,体外培养时易发生适应性变异,个别情况下同时培养不同分离株时还可能发生交叉污染从而误导研究结果,有必要对研究用九里II相菌株进行遗传学鉴定。参考国外贝氏柯克斯体遗传操作方法~([9]),用半固体平板法克隆分纯贝氏柯克斯体九里II相株。随机选择一个单克隆CB01,对其扩大培养后提取基因组,进行二代和叁代全基因组测序分析。将测序结果与国外贝氏柯克斯体不同克隆株的基因组进行比较分析,了解我室保存的九里II相菌株和国外九里菌株的异同。将二代数据拼接并用叁代测序数据清洗拼接结果,得到CB01的全基因组序列。通过对测序数据的分析和比对,CB01的基因组全长为2.024 Mb,包含一个1.987Mb的环状染色体和一个37.321 Kb的质粒。与九里I相菌(RSA 493克隆)基因组~([11])相比,CB01多出5个重复序列,有1个25997 bp的删除区,23个单核苷酸多态性位点(SNP)差异。与九里II相菌(RSA 439克隆)基因组~([12])相比,CB01同样多出5个重复序列,但仅有6个SNP差异。CB01与RSA 439的CBU_0533基因序列完全相同,可解释CB01缺失O抗原从而成为II相菌。可见贝氏柯克斯体九里II相克隆株CB01与国外II相株RSA 439高度同源,CB01可用作国内贝氏柯克斯体研究用参考菌株。本研究第二部分是分离鉴定九里II相株兼性好氧突变体,鉴定不同菌株在不同培养基和不同氧气浓度等条件下的生长繁殖。我们在培养一株九里II相转化菌的过程中,发现该转化菌可在20%氧气浓度条件下静置培养时可正常生长。该菌是通过电转化的方法~([13]),向野生九里II相菌中转入一个外源质粒构建而成。该质粒以pMMB207质粒为基础,基于RSF1010 ori而构建,包含绿色荧光蛋白(GFP)基因,抗生素筛选标记和质粒复制调控区,能在贝氏柯克斯体中稳定传代~([13])。首先通过转化得到转化菌NM IIpMMGK并对该转化菌进行克隆分纯。然后以野生九里II相菌和野生Henzerling I相菌为对照,测试了两种培养基,即ACCM-2和ACCM-2+0.5 mM色氨酸(Tryptophan,Trp);两种氧气浓度,分别为20%和2.5%,以及叁种接种浓度下贝氏柯克斯体的生长情况。分别收集初始接种物和培养7天后的产物,提取DNA并用qPCR定量的方法对贝氏柯克斯体基因组进行定量。转化菌NM IIpMMGK可以在20%氧气浓度条件下正常生长,但是并不稳定,需要适宜的起始浓度和新鲜菌种。转化菌NM IIpMMGK在20%氧浓度条件下生长依然需要5%二氧化碳(CO_2)。另外,本研究发现野生型九里II相菌在20%氧浓度条件下也可进行有限的生长,也需要适宜的起始浓度,新鲜培养物和5%CO_2,同时需要ACCM-2培养基中含有0.5mM色氨酸。在上述所有条件下,Henzerling I相菌均不能生长。本实验用贝氏柯克斯体九里II相株CB01克隆与国外发表的九里II相株高度同源,两者的基因组序列只有个别微小差异。我们发现不同菌株对氧气的耐受程度存在区别。贝氏柯克斯体转化菌NM IIpMMGK在一定条件下可以在20%氧浓度条件下正常生长,野生型九里II相菌在20%氧气中可有限增殖,而野生型Henzerling I相菌只能在微氧浓度条件下生长。贝氏柯克斯体在20%氧浓度条件下的生长机制有待进一步研究。本实验证实了我室保存的贝氏柯克斯体九里株II相菌与国外九里株II相菌基因组差异较小,可以作为贝氏柯克斯体研究用标准菌株,有利于今后实验的继续进行。同时发现并分离出兼性好氧突变体,为贝氏柯克斯体的培养提供了新的思路。本研究对贝氏柯克斯体在20%氧浓度条件下的生长特性做了鉴定,对探索贝氏柯克斯体氧气代谢机制的研究具有参考意义。(本文来源于《军事科学院》期刊2019-03-20）
张小娟,钱沁清,张晓金,孙爱静,俞樟森[4]（2018）在《检测山羊贝氏柯克斯体抗体的间接ELISA方法的建立》一文中研究指出以贝氏柯克斯体Ⅱ相全菌病原体沉淀作为抗原包被酶标板,建立检测山羊贝氏柯克斯体的间接ELISA (i ELISA)方法,用该方法和美国爱德士贝氏柯克斯体检测试剂盒同时对445份临床山羊血清样品进行检测,评价二者的符合率。通过对i ELISA方法的关键反应条件进行优化,最终确定该方法的抗原包被浓度是0.5μg/mL,包被条件是4℃过夜;封闭液是10 g/L酪蛋白,封闭时间是45 min;血清稀释度是1∶400,反应时间是45 min;酶标二抗稀释度是1∶5 000,反应时间是30 min。经验证,建立的方法敏感性、特异性和重复性良好,与爱德士试剂盒的符合率为97.98%,证明该方法可用于山羊贝氏柯克斯体抗体的临床筛查。(本文来源于《畜牧与兽医》期刊2018年12期）
王涛[5]（2018）在《贝氏柯克斯体类脂A生物学作用及菌体耐高渗透压机制研究》一文中研究指出贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,简称C.burnetii)是一类世界范围广泛分布的革兰阴性胞内寄生菌,该菌通常以气溶胶吸入的方式传播感染人,引起人类急性或慢性Q热病。传统上,由于贝氏柯克斯体与立克次体具有相似的生物学特性,因而又俗称Q热立克次体。近年来研究发现贝氏柯克斯体与立克次体科内其他成员的亲缘关系较远,在第二版的《伯杰氏系统细菌学手册》中该菌归属于军团菌目、柯克斯体科、柯克斯体属。值得注意的是,该病原体对高渗透压、干燥脱水等环境具有极强的抵抗存活特性,是一类经典的生物战剂与生物恐怖剂。脂多糖(Lipopolysaccharide,简称LPS)是大多数革兰阴性细菌菌体外膜的主要结构,是一种重要的毒力因子。除少数菌例外如沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,简称Ct)等,均由类脂A、核心糖、多糖(O抗原)叁部分组成,是重要的毒力因子与保护性抗原。类脂A是革兰阴性菌的内毒素,葡萄糖胺结构的双糖脂,脂多糖的基础组分。目前除少数菌如脑膜炎奈瑟氏菌、卡他莫拉菌和鲍曼不动杆菌之外,Kdo-lipid A为大多数革兰阴性菌正常生长繁殖的必需结构。LpxC是类脂A合成途径中催化第一步脱乙酰化反应的保守酶,该反应不可逆,常被用作革兰阴性菌抗生素的设计靶点。新型小分子化合物抑制剂如LPC-011、CHIR-90能够特异性结合抑制LpxC的活性,从而有效抑制类脂A的合成,达到化学法敲除类脂A的目的。近年来,关于贝氏柯克斯体脂多糖的研究中,类脂A的生物学作用与功能目前仍不明确。我们通过使用新型小分子LpxC抑制剂LPC-011、CHIR-90等,在无细胞培养基(ACCM-2)、猴肾细胞系(Vero、BGMK)、巨噬样THP-1细胞等多种贝氏柯克斯体的培养环境内研究了类脂A对于菌体生长繁殖的重要性,初步分析了其生物学功能。此外,以无细胞培养体系为研究平台,利用双向电泳结合质谱技术筛选出多个与菌体耐高渗透压适应性存活特性相关的蛋白。首先,初步研究发现:初始加入单一高浓度的抑制剂LPC-011并不影响I相、II相贝氏柯克斯体在Vero细胞内生长繁殖,这提示类脂A对于贝氏柯克斯体在该环境下的生长繁殖过程可能并不重要。然而,由于缺乏有效的类脂A检测方法以及贝氏柯克斯体LpxC对于抑制剂的敏感性未知,因此并不能得出关于类脂A必要性的准确结论。为了进一步评价贝氏柯克斯体LpxC对于抑制剂LPC-011的敏感性(MIC),利用遗传操作将贝氏柯克斯体lpxC基因引入大肠埃希菌(E.coli,简称大肠杆菌),同时敲除大肠杆菌内源染色体上的lpxC完成构建大肠杆菌替代测试模型。在大肠杆菌替代模型中对比测试发现,抑制剂LPC-011对贝氏柯克斯体LpxC的最低抑制浓度小于0.05μg/ml,且小于LPC-011对大肠杆菌的最小抑菌浓度。这提示我们可以利用大肠杆菌作为参考指标,判断抑制剂的稳定性与抑制效果。考虑到贝氏柯克斯体的培养周期长达7天,且抑制剂LPC-011在动物体内实验中不稳定等特点,利用大肠杆菌的生长指标OD_(550)作为参照,评价抑制剂LPC-011的抑制效果。发现在细胞环境中,初始加入大肠杆菌致死剂量(2μg/ml>40×MIC)的LPC-011能够在48 h内保持稳定的大肠杆菌抑菌浓度。因此间隔48 h更换含有2μg/ml LPC-011的培养液可保持大肠杆菌抑菌浓度。然而,在无细胞培养体系中,初始加入5μg/ml LPC-011经培养7天后,仍可维持大肠杆菌抑菌浓度。由于缺乏类脂A检测手段,实验构建了穿梭载体pMMBGK,进而引入衣原体kdtA成功构建穿梭质粒pMMBGKkdt A。以上两种质粒均具有RSF1010复制起始位点。将质粒pMMBGKkdt A电转化进入贝氏柯克斯体九里II株,使衣原体Kdo转移酶Kdt A表达,催化合成衣原体属特异性Kdo侧链,修饰贝氏柯克斯体类脂A,将Kdo_2-lipid A修饰形成Kdo_3-lipid A,在贝氏柯克斯体外膜形成可被抗衣原体属特异性单抗识别的α-Kdo-(2→8)-α-Kdo表位结构。在抑制剂LPC-011作用下,通过间接免疫荧光染色验证了贝氏柯克斯体类脂A的合成确实受到显着抑制,同时亲代转化菌在非吞噬细胞、无细胞生长环境内的拷贝数产量下降。经抑制剂培养所得子代菌体能够正常感染吞噬、非吞噬细胞,但在LPC-011的作用下几乎不能在吞噬细胞THP-1中进行生长繁殖。然而,类脂A修饰菌的实验结果并不能完全替代野生型贝氏柯克斯体的测试结果。在对野生型I相、II相贝氏柯克斯体的测试研究中发现,在BGMK细胞培养体系中,LPC-011降低了囊泡数量(约60%~70%),但是已发育成熟囊泡内菌体的生长繁殖未受影响。有意思的是,经LPC-011处理的I相菌体,其囊泡内菌体的生长表型仍表现为分散的布朗运动,这提示完整的脂多糖可能并不是导致I相菌体亲水性的唯一原因。在经抑制剂LPC-011处理的THP-1细胞中,贝氏柯克斯体仅可形成缺陷生长的小囊泡,同时菌体拷贝数下降显着。经LPC-011培养所得子代菌仍可感染THP-1细胞、在胞内正常生长。由于贝氏柯克斯体发育过程中包含形态迥异的小贝氏体(SCV,直径0.2~0.5μm)、大贝氏体(LCV,直径>1μm)的双相发育周期,因此使用透射电子显微镜(TEM)分析类脂A对于菌体的形态学发育变化的生物学作用,发现在LPC-011处理的吞噬、非吞噬细胞中,类脂A并不是大贝氏体向小贝氏体发育变化的必需结构。另外,通过改变无细胞培养体系中Na~+与Cl~-浓度来大量获取不同渗透压梯度下的菌体,并分别对叁组:超高渗、正常高渗、低渗环境所得菌体蛋白进行双向电泳分析银染显色。基于蛋白点灰度值,用软件对比分析得出叁组渗透压条件下表达量具有显着性差异的13个蛋白,进行质谱(Maldi-TOF-MS)分析。其中,超高渗组中Gro ES、EF-Tu、RopC、IcmK、RplL蛋白以及假定蛋白(CBU_0632)的表达量均升高10倍以上。低渗组中,蛋白GcvH、Bcp、Dot C、、RuvB、鸟氨酸脱羧酶、以及假定蛋白(CBU_0658)的灰度变化均达10倍以上。综上所述,本研究通过使用抑制剂LPC-011在多种培养体系内鉴定了贝氏柯克斯体类脂A的生物学作用,利用大肠杆菌替代模型测试了贝氏柯克斯体LpxC对于LPC-011的敏感性,建立了一个基于间接免疫荧光染色的贝氏柯克斯体类脂A检测报告系统,进而提出证据证明贝氏柯克斯体类脂A在叁种培养环境下(猴肾成纤维细胞、吞噬细胞、无细胞培养基),具有不同的生物学作用。另外,通过蛋白质组学分析鉴定得出与菌体耐高渗透压特性相关的蛋白及其编码基因。本研究为下一步构建贝氏柯克斯体类脂A无痕删除突变株奠定了基础,为更加深入分析类脂A的生物学功能提供了实验依据。对临床上治疗急性、慢性Q热提供了新的思路。也为进一步在转录水平研究贝氏柯克斯体耐高渗透压的遗传学机制、验证相关基因的生物学功能提供了实验基础。(本文来源于《军事科学院》期刊2018-05-30）
焦俊[6]（2017）在《贝氏柯克斯体表面蛋白和T细胞表位的鉴定及免疫原性研究》一文中研究指出贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)是一种革兰阴性、专性胞内寄生小球杆菌,为重要的人兽共患病——Q热(Q fever)的病原菌。贝氏柯克斯体感染人,可引起急性Q热和慢性Q热,贝氏柯克斯体感染家畜,主要引起牛、羊孕畜流产,而感染家畜也为人群Q热最主要的传染源。急性Q热用抗生素治疗有效,但未及时治疗而发展为慢性Q热后则难以治愈。疫苗接种是预防人、畜贝氏柯克斯体感染的最有效措施。虽然接种灭活贝氏柯克斯体全菌疫苗能够诱导机体有效对抗贝氏柯克斯体感染,但免疫后引起机体严重副反应使得其难以在人群中推广使用。目前,国内外学者力图采用先进的分子生物学技术对贝氏柯克斯体抗原分子进行研究,以期发现保护性抗原分子去研发安全有效的Q热分子疫苗。近十多年来,Q热分子疫苗的研究仅仅局限于少数几种贝氏柯克斯体外膜蛋白,研究证明它们的特异性保护效果有限且明显弱于灭活贝氏柯克斯体全菌抗原。我们采用生物素-链亲和素亲和层析从贝氏柯克斯体菌体裂解液中提取表面蛋白,采用等电聚焦和SDS-PAGE电泳分离提取的表面蛋白,采用电喷雾串联质谱鉴定分离的表面蛋白,结果发现37种贝氏柯克斯体表面蛋白。生物信息学将37种表面蛋白分为11个功能类型;8种蛋白具有经典的N端信号肽或非经典的分泌信号,提示可能为分泌蛋白;10种蛋白可能定位于细胞外膜,4种蛋白可能定位于非细胞质(包括外膜、内膜、周质),6种蛋白亚细胞定位未知。采用基因克隆技术成功在大肠埃希菌表达30个贝氏柯克斯体重组表面蛋白,再用镍离子亲和层析从表达菌中分离纯化重组表面蛋白,并将其点制一张贝氏柯克斯体表面蛋白芯片。用贝氏柯克斯体感染小鼠血清和Q热患者血清分析表面蛋白芯片,结果有23个表面蛋白与半数以上的贝氏柯克斯体感染小鼠4周血清反应阳性,其中15个表面蛋白与半数以上的Q热患者血清反应阳性并且具有较好的血清学特异性。该结果提示这15个主要血清反应表面蛋白可以作为Q热血清学检测的候选诊断抗原和研发Q热亚单位疫苗的候选免疫原。通过T细胞表位在线预测软件分析贝氏柯克斯体7个表面蛋白的H2-Ab限制型CD4~+T细胞表位,预测出121条15氨基酸长的CD4~+T细胞表位肽,并人工合成这些表位肽。将这7个重组表面蛋白分别免疫C57BL/6小鼠,再从免疫小鼠脾脏中分离CD4~+T细胞,然后将121条CD4~+T细胞表位肽分别与相应重组表面蛋白免疫小鼠CD4~+T细胞共孵育,最后用酶联斑点(ELISPOT)法分析每条表位肽诱导CD4~+T细胞的IFN-γ分泌水平。结果发现其中34条表位肽能够诱导CD4~+T细胞分泌较高水平的IFN-γ。剔除氨基酸序列高度相似的表位肽,最后选择其中22条为有效贝氏柯克斯体CD4~+T细胞表位肽。将这22条CD4~+T细胞表位肽分别体外刺激贝氏柯克斯体全菌抗原免疫C57BL/6小鼠的CD4~+T细胞,最后选出源自7个不同蛋白抗原、可诱导CD4~+T细胞分泌高水平IFN-γ的7条CD4~+T细胞表位肽。将这7条CD4~+T细胞表位肽单独或混合刺激贝氏柯克斯体全菌抗原免疫C57BL/6小鼠的CD4~+T细胞,用流式细胞术分析CD4~+T细胞的IFN-γ和TNF-α表达,结果发现它们都能诱导较高比例CD4~+T细胞表达IFN-γ,其中3条表位肽也能诱导较高比例CD4~+T细胞表达TNF-α。此外,ELISPOT法分析发现这7条表位肽混合诱导CD4~+T细胞分泌IFN-γ的水平显著高于单条表位肽,提示多条CD4~+T细胞表位肽混合激活CD4~+T细胞的效能显着好于单条表位肽。将这7条CD4~+T细胞表位肽单独或混合免疫C57BL/6小鼠,免疫后用贝氏柯克斯体攻毒评价其免疫保护效能。结果多条CD4~+T细胞表位肽混合免疫小鼠的脾重和贝氏柯克斯体载量均显着低于单条表位肽免疫小鼠,证明多条CD4~+T细胞表位肽混合免疫保护效果显着好于单条表位肽。通过T表位在线预测软件分析贝氏柯克斯体的24个分泌蛋白和6个外膜蛋白的CD8~+T细胞表位,预测出157条H2-Kb、Db限制型9氨基酸长的CD8~+T细胞表位,并人工合成这些表位肽。将这157条CD8~+T细胞表位肽体外分别刺激贝氏柯克斯体感染C57BL/6小鼠的脾脏CD8~+T细胞,用ELISPOT分析每条表位肽诱导CD8~+T细胞的IFN-γ分泌水平。结果显示29条表位肽均能诱导CD8~+T细胞分泌较高水平IFN-γ。其中22条表位肽的源蛋白为分泌蛋白,它们并非主要血清反应蛋白。将这29条CD8~+T细胞表位肽分别刺激贝氏柯克斯体感染C57BL/6小鼠的CD8~+T细胞,流式细胞术分析显示所有表位肽均能单独诱导CD8~+T细胞表达IFN-γ,表达IFN-γ的CD8~+T细胞比例为0.44%~3.78%。将29条CD8~+T细胞表位肽基因串联后连接至原核表达质粒,将重组表达质粒电转入单核细胞增生性李斯特杆菌疫苗菌(LM),构建表达贝氏柯克斯体CD8~+T细胞表位肽的疫苗菌(LM-Cb)。用LM-Cb免疫C57BL/6小鼠,免疫后用贝氏柯克斯体攻击免疫小鼠评价其免疫保护效能。结果LM-Cb免疫小鼠的脾重和贝氏柯克斯体载量均显着地低于空质粒转化菌免疫小鼠或非免疫小鼠,证明贝氏柯克斯体CD8~+T细胞表位肽在LM-Cb中表达并诱导机体产生有效抗贝氏柯克斯体感染特异性免疫。综上所述,我们分离、鉴定了37个贝氏柯克斯体表面蛋白,制备了30个贝氏柯克斯体重组表面蛋白并用其构建贝氏柯克斯体表面蛋白芯片。用贝氏柯克斯体感染血清分析表面蛋白芯片,发现15个血清学反应阳性且有良好血清学特异性的表面蛋白。计算机软件分析贝氏柯克斯体外膜蛋白和分泌蛋白的氨基酸序列,预测并人工合成121条贝氏柯克斯体CD4~+T细胞表位肽和157条CD8~+T细胞表位肽,筛选出能够激活相应T细胞的CD4~+T细胞表位肽7条和CD8~+T细胞表位肽29条。研究进一步证明7条CD4~+T细胞表位肽混合激活CD4~+T细胞和29条CD8~+T细胞表位肽混合激活CD8~+T细胞的能力均显着高于单条表位肽。将7条贝氏柯克斯体CD4~+T细胞表位肽单独或混合免疫小鼠,再用贝氏柯克斯体攻击免疫小鼠评价免疫保护效能,结果7条CD4~+T细胞表位肽混合免疫小鼠的贝氏柯克斯体载量显着低于单条表位肽免疫小鼠。将29条贝氏柯克斯体CD8~+T细胞表位肽基因串联后插入原核表达质粒,将重组表达质粒转化李斯特菌免疫小鼠,结果表达CD8~+T细胞表位肽的疫苗菌免疫小鼠的贝氏柯克斯体载量显着低于空质粒转化菌免疫。这些结果证明多条贝氏柯克斯体CD4~+T细胞表位肽或CD8~+T细胞表位肽联合免疫能够显着增强机体特异性免疫应答、有效对抗贝氏柯克斯体感染。我们的研究结果为Q热血清学诊断试剂和Q热分子疫苗的研制奠定了良好的理论与工作基础。(本文来源于《中国人民解放军军事医学科学院》期刊2017-05-25）
罗声栋[7]（2017）在《贝氏柯克斯体质粒生物学作用与功能研究》一文中研究指出贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,简称Cb)是一种革兰氏阴性、专性胞内寄生菌,是引起人类Q热的病原体[1-3]。Cb主要通过气溶胶[4]、蜱虫叮咬等途径,在人与动物之间进行传播,是已知的感染性最强的病原体之一,也是一种潜在的生物战剂[5]和生物恐怖剂[6]。研究发现:已知的Cb分离株中均含有一种质粒(QpH1[7]、QpRS[8]、QpDG[9]、QpDV[10,11])或者整合到Cb基因组的质粒同源序列(IPS[8,12]);Cb质粒编码多个IV型分泌系统效应蛋白[13,14],这些蛋白分泌到宿主细胞质后,参与调控细胞功能[15]。长期以来,Cb质粒(包括IPS)被认为可能是菌体生长或胞内寄生所需的关键因子,又或者可能跟Cb的环境耐受和所引起的疾病种类(急性Q热或慢性Q热)相关。由于培养困难及缺少Cb质粒的遗传操作方法,Cb质粒及其编码基因的生物学功能和致病机制均缺乏研究。近年来,无生命培养基ACCM[16,17]培养Cb方法的建立,推动了Cb的遗传学研究进展,为研究Cb基因的功能创造了机遇。本论文参考国外已有的Cb遗传操作方法[18,19],通过基因工程技术构建Cb穿梭载体,建立了Cb的遗传转化方法;利用质粒相似不兼容机制[20-22],成功构建了Cb内源质粒QpH1缺失突变体,并在体内、外对Cb质粒缺失突变体的表型和毒力变化等进行了初步的探讨;利用基因敲除和定点突变等技术,对Cb内源质粒QpH1的复制与分裂调控区进行了深入的探讨。第一章,基于E.coli质粒pMMB207[23],构建含RSF1010 ori的贝氏柯克斯体自主穿梭载体,建立贝氏柯克斯体转化系统。首先,利用PCR技术分别扩增绿色荧光蛋白基因(eGFP)、卡那霉素抗性基因(KanR)、Cb组成型表达基因启动子P311和P1169四段序列,以及含RSF1010 ori的载体骨架p207;然后,用融合PCR技术将四段序列融合为“P311-eGFP-P1169-KanR”串联序列;最后,用限制性核酸内切酶Kpn I和Xho I酶切“P311-eGFP-P1169-KanR”串联序列,连接至同样双酶切的载体骨架p207上,构建穿梭载体p207GK。将穿梭载体p207GK电转化至Cb Grita II相株,用无生命培养基ACCM-2进行连续传代培养,利用倒置荧光显微镜观察e GFP基因的表达,传代至eGFP基因高表达时,用单层半固体“ACCM-2/Kan/琼脂”平板克隆分纯Cb转化株;结果成功构建了自主的Cb穿梭载体,获得了稳定表达eGFP的Cb转化株,并完成了克隆分纯。表明我们成功建立了Cb遗传转化系统,为后续用遗传学方法研究Cb奠定了基础。第二章,生物信息学分析本室Cb Grita II相株质粒全长序列,确定该质粒为QpH1(GeneBank Accession No.AE016829),BLAST比对分析发现该质粒的CBUA0036~CBUA0039a序列片段在IPS中缺失,但在4种质粒(QpH1,QpRS,QpDG,QpDV)中存在且高度保守,推测该段序列可能是调控Cb质粒复制与分裂的功能区,包含复制起始位点序列和相关质粒分裂调控蛋白基因。利用PCR扩增技术,从质粒QpH1上扩增获得包含CBUA0036~CBUA0039a序列的片段,作为同源型质粒的骨架(命名为pQ);同时利用融合PCR扩增技术,使eGFP基因、KanR基因、P311和P1169启动子,以及p UC ori序列融合,形成“P311-eGFPP1169-KanR-pUC ori”串联序列;把串联序列亚克隆至载体骨架pQ上,构建新型穿梭载体p QGK。将新型穿梭载体pQGK电转化至Cb Grita II相菌中,用含Kan的无生命培养基ACCM-2进行连续传代培养,通过荧光显微镜进行观察。结果发现新型穿梭载体pQGK能在Cb中稳定地传代,荧光激发下使Cb转化菌呈现绿色荧光,这说明新型穿梭载体pQGK上的CBUA0036~CBUA0039a序列片段含有pQGK质粒的复制起始位点序列(ori)。对转化菌克隆分纯后,用QpH1质粒特异性引物对Cb克隆株进行PCR鉴定,未能检测到QpH1质粒,说明Cb克隆株中的QpH1质粒已经丢失,获得了Cb内源质粒QpH1缺失突变株Cb Grita II/p QGK;利用SYBR Green绝对定量Q-PCR技术分别测定Cb野生株中QpH1质粒和突变株Cb Grita II/pQGK中pQGK质粒的相对拷贝数,发现Qp H1与pQGK质粒都只有单拷贝;以上数据说明QpH1与pQGK质粒具有相同的复制与分裂调控机制,两者在Cb中不能共存,表明CBUA0036~CBUA0039a这段序列能严格地调控质粒QpH1的复制、分裂及相似不兼容。用Q-PCR技术测定突变株Cb Grita II/pQGK在细胞外(ACCM-2)和细胞内(BGM)的增殖能力,发现突变株和野生株无论是在囊泡形成与生长,还是在Cb菌体增殖方面,均无明显无差别,这结果提示Cb质粒QpH1的大部分序列(CBUA0001~CBUA0034a,>85%)与Cb在胞内和胞外的正常生长无关。通过体内(SCID小鼠)和体外(THP-1细胞)实验发现突变株的毒力下降,提示QpH1质粒是Cb的一个毒力因子。第叁章,以穿梭载体pQGK为基础,深入探索CBUA0036~CBUA0039a这段序列调控QpH1质粒复制和分裂的机制。通过基因敲除或序列删除的方法,对穿梭质粒pQGK上的CBUA0036~CBUA0039a这段序列进行不同程度地删减,构建一系列穿梭载体pQGK的突变体,命名为pQGK-D1~pQGK-D17。将这些穿梭载体分别电转化至Cb Grita II,用含Kan的ACCM-2培养基进行连续传代培养,通过荧光显微镜进行观察,当eGFP基因高表达时,对Cb转化菌进行克隆分纯;之后对Cb克隆株进行PCR鉴定分析。结果发现只有14个穿梭载体(pQGK-D1~pQGK-D14)能成功转化Cb并稳定传代;序列比较分析显示,只需含最短为600 bp的序列(介于CBUA0036和CBUA0037之间)即可使穿梭载体pQGK-D14在Cb内稳定地传代,而含更短序列片段的穿梭载体(pQGK-D15~pQGKD17)无法获得Cb转化菌,说明这段600 bp的序列包含Cb质粒QpH1的复制起始位点序列(ori)。随后对已经克隆分纯的Cb克隆菌进行PCR鉴定,发现穿梭载体pQGK-D1和pQGK-D5均能敲除Cb Grita II内源质粒QpH1;穿梭载体pQGK-D7~-D8、pQGK-D11~-D14与QpH1质粒共存,到目前为止,以上结果表明QpH1质粒的复制、分裂和相似不兼容,除了复制起始位点(ori)外,还受到其它未知因子的调控(实验进行中,详细结果待补充)。第四章,在前期研究的基础上,利用基因克隆技术,把穿梭载体pQGK上的KanR基因替换成RifR基因,构建新型穿梭载体pQGR,并电转化Cb Grita II及克隆分纯。在ACCM-2培养基中培养时,发现在相同时间内,pQGR转化株Cb Grita II/pQGR的增殖能力比pQGK转化株Cb Grita II/pQGK要明显下降;感染BGM后,结果发现在胞内只能形成细小的空泡,未能进一步发展成经典的大空泡,且Cb菌体增殖能力明显下降;感染THP-1细胞后,无空泡形成,亦未能检测到Cb菌体在细胞内增殖。上述结果说明,RifR基因的表达产物ADP-核糖基化酶在Cb内可能具有核糖基化作用,影响Cb正常的生物合成,使Cb减毒,对Cb感染细胞后空泡的发展和菌体增殖具有显着的抑制作用,表明RifR基因不适合作为Cb遗传转化研究中的药物筛选标记。综上所述,本研究成功构建了基于RSF1010 ori的自主穿梭载体p207GK,并利用该穿梭载体建立了Cb的遗传转化系统;随后,成功构建了与Cb质粒QpH1具有同源序列(CBUA0036~CBUA0039a)的新型穿梭质粒pQGK,并利用该穿梭载体成功敲除Cb内源质粒QpH1,获得QpH1质粒缺失突变体;对CBUA0036~CBUA0039a这段序列进行深入的研究后,发现QpH1质粒的复制起始位点序列区;此外,实验过程中还发现RifR基因编码产物ADP-核糖基化酶对Cb的生物合成具有显着的影响,不适合用来作为Cb遗传转化的药物筛选标记。本研究为进一步深入研究Cb质粒的生物学功能和致病机制提供新的遗传学工具和方法。(本文来源于《中国人民解放军军事医学科学院》期刊2017-05-20）
罗声栋,卢姗姗,胡燕,王涛,于永慧[8]（2016）在《贝氏柯克斯体穿梭载体构建及转化方法建立》一文中研究指出目的:基于大肠杆菌质粒pMMB207,构建贝氏柯克斯体穿梭载体,建立贝氏柯克斯体转化系统。方法:利用PCR分别扩增eGFP基因、Kan~R抗性基因、贝氏柯克斯体组成型表达启动子P311和P1169等4段序列,然后用融合PCR技术将4段序列融合为P311-eGFP-P1169-Kan~R串联序列,经KpnⅠ和XhoⅠ酶切后,连接至经同样双酶切的pMMB207骨架上,构建穿梭载体p207-GK;将穿梭载体电转化至贝氏柯克斯体,用ACCM-2培养基进行传代培养或感染BGM细胞;利用倒置荧光显微镜观察eGFP基因的表达,传代至eGFP基因高表达时,用半固体平板培养法克隆分纯贝氏柯克斯体转化株。结果:构建了贝氏柯克斯体穿梭载体,获得了稳定表达eGFP的贝氏柯克斯体转化株,并完成了克隆分纯。结论:建立了完整的贝氏柯克斯体转化系统,为后续用遗传学方法研究贝氏柯克斯体奠定了基础。(本文来源于《生物技术通讯》期刊2016年05期）
王涛,于永慧,宋立华[9]（2016）在《贝氏柯克斯体的相变异与脂多糖研究进展》一文中研究指出贝氏柯克斯体(Cb)为一类兼性细胞内寄生的革兰阴性小杆菌,归属于军团菌目,柯克斯体科,柯克斯体属。传统上,因为Cb有类似立克次体的生物学特征,Cb被归类到立克次体目中,俗称为Q热立克次体,但其与立克次体目内各种菌株的亲缘关系相距较远。Cb地理分布广泛,在羊、牛等家畜中感染率高~([1-2])。Cb通过气溶胶感染人可导致急性或慢性Q热病,在部分患者中引起肺炎、肝炎、心内膜炎和脊髓炎等重症疾病。由于易于获得及具有很强的感染性,Cb被列为生物战剂和生(本文来源于《国际检验医学杂志》期刊2016年17期）
汪鹏程,熊小路,焦俊,龚文平,杨小梅[10]（2015）在《贝氏柯克斯体5种重组表面蛋白抗原包被酶联免疫吸附试验的特异性和敏感性分析》一文中研究指出目的使用贝氏柯克斯体5种重组表面蛋白作为包被抗原的酶联免疫吸附试验用于血清学检测的特异性和敏感性分析。方法本研究建立由贝氏柯克斯体的Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL重组表面蛋白抗原分别包被的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,然后分别检测贝氏柯克斯体实验感染小鼠血清和Q热患者血清中IgG特异性抗体。结果 8份贝氏柯克斯体感染小鼠血清中除1份血清与RplL反应为阴性外其它均为阳性;11份Q热患者血清中除1份血清与RplL、1份血清与OmpH反应为阴性外,其它血清反应均为阳性。将这5种重组蛋白分别与莫氏立克次体、黑龙江立克次体、恙虫病东方体实验感染小鼠血清反应,除1份黑龙江立克次体感染小鼠血清与GroEL反应为阳性外,其它血清反应均为阴性。另外,Com1对斑疹伤寒、斑点热、恙虫病患者血清的阳性反应率平均为22.2%,GroEL为25.0%,Mip为25.0%,OmpH为25.0%,RplL为13.9%。结论这些结果证明这5种重组蛋白抗原均可被贝氏柯克斯体感染血清所识别。所建立的ELISA方法具有良好特异性和敏感性,可用作Q热血清学诊断。(本文来源于《中国人兽共患病学报》期刊2015年12期）
贝氏柯克斯体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:克隆分离国内贝氏柯克斯体九里株Ⅱ相突变体,并利用基因组测序方法进行鉴定,为贝氏柯克斯体研究提供参考依据。方法:用半固体平板法克隆分离贝氏柯克斯体,对随机选择的克隆株CB01进行全基因组测序分析,将测序结果与国外贝氏柯克斯体不同克隆株的基因组进行比较分析。结果:CB01的基因组全长2.024 Mb,包含1个1.987 Mb的环状染色体和1个37.321 kb的质粒。与九里株Ⅰ相菌(RSA 493克隆)基因组相比,CB01多出5个重复序列,有1个25 997 bp的删除区,23个单核苷酸多态性位点(SNP)差异。与九里株Ⅱ相菌(RSA 439克隆)基因组相比,CB01同样多出5个重复序列,但仅有6个SNP差异。CB01与RSA 439的CBU_0533基因序列完全相同,可解释CB01缺失O抗原从而成为Ⅱ相菌。结论:贝氏柯克斯体九里株Ⅱ相菌克隆CB01与国外Ⅱ相菌RSA 439高度同源,CB01可用做国内贝氏柯克斯体研究用参考菌株。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
贝氏柯克斯体论文参考文献
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