拟南芥VQ3基因在调控植物生长发育中的作用及机制研究

论文摘要

VQ蛋白是一类与生长发育以及响应环境胁迫相关的植物特异性转录调控辅助因子,其氨基酸序列仅在VQ结构域处高度保守。并且大多数拟南芥VQ基因不含内含子,其编码的蛋白质氨基酸残基的数目大多都少于300。研究表明,含有VQ（FxxxVQxLTG）结构域的蛋白质与WRKY转录因子互作,进一步的分析表明,VQ结构域中保守的V和Q残基对于与WRKY蛋白的互作特别重要。另外,VQ蛋白并非与所有的WRKY家族成员互作,而是仅与Ⅰ亚族和Ⅱc亚族的WRKY蛋白互作。VQ蛋白与WRKY蛋白结合后,形成蛋白复合体共同对下游靶基因进行调控。本研究对拟南芥中功能尚属未知的VQ3基因开展了相关研究,取得的主要结果如下:1.拟南芥AtVQ3基因的功能分析构建了带有GFP报告基因的pCAMBIA2300GFP-AtVQ3载体,然后注射烟草利用瞬时表达系统进行研究发现,该蛋白定位于细胞核内。之后利用CRISPR/Cas9基因编辑系统获得了atvq3突变体植株,对F1代进行表型鉴定,发现功能缺失突变体相比于野生型拟南芥植株发生矮化现象并且莲座叶叶片呈椭圆形。2.拟南芥AtVQ3基因的表达模式分析对不同器官中的AtVQ3基因的表达模式分析发现:AtVQ3在果荚中表达最多,在莲座叶及根中的表达相对较多,在茎及茎生叶中的表达量相对较低,在花中表达最少。对不同处理条件下的AtVQ3基因的表达模式分析发现:AtVQ3基因的表达受到PEG、NaCl、低温（4℃）、高温（37℃）的诱导,尤其在PEG处理时其诱导表达量最高。3.VQ3蛋白与WRKY蛋白的互作分析首先构建pGBKT7-VQ3载体作为酵母筛选的诱饵对38个WRKY蛋白进行筛选并获得了5个与VQ3互作的WRKY蛋白,分别为WRKY3、WRKY4、WRKY8、WRKY25以及WRKY33。然后通过双分子荧光互补实验（BiFC）对上述5个WRKY互作蛋白进行验证,结果表明其均可与VQ3互作,且互作定位于细胞核内。4.AtVQ3候选靶基因（At2g18680）的功能分析构建带有GFP报告基因的pCAMBIA2300GFP-At2g18680载体,然后注射烟草利用瞬时表达系统进行研究发现At2g18680蛋白同时定位于细胞膜和细胞核内,之后利用CRISPR/Cas9基因编辑系统获得了at2g18680基因功能缺失突变体植株,发现突变株的生长发育变得迟缓,生长期明显延长,且叶片肥大不规则,相比于野生型拟南芥叶柄变短。5.AtVQ3候选靶基因（At2g18680）的表达模式分析对At2g18680基因的表达模式分析发现,At2g18680在茎生叶中表达最高、在莲座叶和果荚及茎中的表达量相对较高,在花中的表达量最低。另外,At2g18680基因的表达同样受到PEG、Nacl、高温（37℃）及低温（4℃）的诱导,尤其在低温（4℃）处理时其诱导表达量最高。

论文目录

• 摘要
• Abstracts
• 第一章 文献综述
•   1.1 VQ蛋白及其编码基因的研究进展
•     1.1.1 VQ蛋白及其编码基因的结构特点
•     1.1.2 VQ蛋白生物学功能研究
•     1.1.3 VQ蛋白的作用机制
•   1.2 WRKY转录因子及其编码基因的研究进展
•     1.2.1 WRKY转录因子及其编码基因的结构特点
•     1.2.2 WRKY转录因子生物学功能研究
•   1.3 本研究的目的和意义
• 第二章 拟南芥AtVQ3 基因的功能分析
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料及菌株
•     2.1.2 载体质粒及引物
•     2.1.3 试剂
•     2.1.4 实验仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 拟南芥基因组DNA提取
•     2.2.2 拟南芥RNA提取
•     2.2.3 拟南芥c DNA的合成
•     2.2.4 目的片段的扩增
•     2.2.5 琼脂糖凝胶电泳
•     2.2.6 目的片段的回收
•     2.2.7 克隆载体的连接
•     2.2.8 双元表达载体的构建
•     2.2.9 大肠杆菌感受态转化
•     2.2.10 质粒提取
•     2.2.11 农杆菌GV3101 感受态制备
•     2.2.12 农杆菌GV3101 感受态转化
•     2.2.13 pCAMBIA2300GFP-AtVQ3 亚细胞定位载体的构建
•     2.2.14 pCAMBIA2300GFP-AtVQ3 的荧光信号检测
•     2.2.15 pCAMBIA1300-pYAO-cas9-AtVQ3 载体构建
•     2.2.16 拟南芥花序浸染法及转基因植株的筛选
•     2.2.17 AtVQ3 基因在不同组织及不同胁迫下的表达水平
•   2.3 实验结果与分析
•     2.3.1 pCAMBIA2300GFP-AtVQ3 载体构建
•     2.3.2 AtVQ3 的亚细胞定位
•     2.3.3 pCAMBIA1300-pYAO-cas9-AtVQ3 载体构建
•     2.3.4 转基因植株的筛选及表型鉴定
•     2.3.5 不同组织中AtVQ3 的表达模式分析
•     2.3.6 不同处理AtVQ3 的表达量分析
• 第三章 VQ3 蛋白与WRKY转录因子的作用机制
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 植物材料及菌株及载体质粒
•     3.1.2 载体质粒及引物
•     3.1.3 试剂
•     3.1.4 实验仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 基因扩增至农杆菌转化
•     3.2.2 酵母Y2H Gold感受态制备
•     3.2.3 AtVQ3-BD自激活验证
•     3.2.4 筛选与AtVQ3 互作的WRKY转录因子
•     3.2.5 双分子荧光互补实验进行植物体内验证
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 AtVQ3-BD蛋白的自激活验证
•     3.3.2 酵母双杂筛选VQ3 的互作蛋白
•     3.3.3 双分子荧光体内验证蛋白质相互作用
• 第四章 AtVQ3 候选靶基因（At2g18680）的功能分析
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 植物材料及菌株
•     4.1.2 载体质粒及引物
•     4.1.3 试剂
•     4.1.4 实验仪器
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 基因扩增至农杆菌转化
•     4.2.2 拟南芥pCAMBIA2300GFP-At2g18680 亚细胞定位载体构建
•     4.2.3 pCAMBIA2300GFP-At2g18680 的荧光信号检测
•     4.2.4 pCAMBIA1300-pYAO-cas9-At2g18680 载体构建
•     4.2.5 Pcambia2300-35S-At2g18680 载体构建
•     4.2.6 拟南芥花序浸染法及转基因植株的筛选
•     4.2.7 At2g18680 基因在不同组织及不同胁迫下的表达水平
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 pCAMBIA2300GFP-At2g18680 载体构建
•     4.3.2 At2g18680 的亚细胞定位
•     4.3.3 pCAMBIA1300-pYAO-cas9-At2g18680 载体构建
•     4.3.4 转基因植株的筛选及表型鉴定
•     4.3.5 不同组织中At2g18680 的表达量分析
•     4.3.6 不同处理At2g18680 的表达量分析
• 第五章 讨论与结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论著
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 崔冰

导师: 范海,高建伟,王凤德

关键词: 拟南芥,表达模式,亚细胞定位,蛋白质互作,酵母双杂

来源: 山东师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 山东师范大学

分类号: Q943.2

总页数: 69

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