Shh和Ihh在小鼠器官发生中的功能替代

论文摘要

刺猬蛋白家族（Hedgehog,Hh）与细胞增殖、分化及细胞间沟通关系密切,在胚胎发育、成熟组织的稳态和肿瘤发生发展过程中有至关重要的作用。哺乳动物Hh有Sonic Hedgehog（Shh）,Indian Hedgehog（Ihh）,Desert Hedgehog（Dhh）三个同源基因,它们编码的蛋白质都具有Hh-N端、Hh-C端两个结构域。Shh基因作为重要的形态发生素,其与神经管、体节、消化道、颅面部、骨骼轴向、前后肢芽的发生发育以及肿瘤的形成等有密切联系。Shh基因在小鼠发育过程中首先表达于中、内胚层轴上,其发生突变会导致颅颌面形态产生异常,包括颅中线融合,独眼,小脑畸形等缺陷,这表明Shh在颅颌面形态发生及发育过程中具有极其重要的作用。Ihh主要与骨骼发育相关,尤其是与软骨的发育紧密相关,是软骨细胞增殖、分化和造骨细胞分化等骨发育过程所必需的。在蛋白质结构上,IHH与SHH的Hh-C末端有明显的区别,而Hh-N端结构有93%的一致性,Hh-N端主要参与Hh信号通路的激活与调节,故两者可能具有相似的生物学功能。但是,尚无相关研究证实,在小鼠的器官发生中,Ihh是否具有与Shh相同的生理功能,即Ihh是否能完全替代Shh发挥相应的功能作用。为探究这一问题,本研究首先利用Shh-Cre小鼠与Shhf/f小鼠交配,获得组织特异性敲除Shh基因的ShhCre/-小鼠,结果显示Shh基因敲除后导致小鼠个体变小,独眼畸形,轴向模式缺陷,神经管畸形等发育异常。pMes-Ihh转基因小鼠在正常情况下在组织细胞中不过表达Ihh基因,只有当特定的组织细胞中存在Cre重组酶时,Cre重组酶特异性识别并切割Loxp位点,β-actin启动子后面的Stop终止序列元件被切除、原序列同源重组后,可在特定的组织细胞中特异性过表达Ihh基因。然后利用pMes-Ihh;Shhf/f鼠和Shh-Cre小鼠进行交配,最终获得ShhCre/-;pMes-Ihh转基因小鼠,该小鼠在Shh基因被敲除的同时,让Ihh基因条件性过表达于敲除位置。结果显示,Shh敲除小鼠的表型可以部分被Ihh挽救,ShhCre/-;pMes-Ihh转基因小鼠出现了颅颌面中线结构,其四肢发育恢复正常,但过表达Ihh后神经管发育的异常并未得到挽救。为进一步探究其无法挽救神经管畸形的机制,我们将Shh-Cre小鼠与R26R-mTmG小鼠进行交配,获得在Shh表达的位置表达绿色荧光蛋白,用以示踪Shh的表达模式。结果显示,在ShhCre/-;pMes-Ihh转基因小鼠中,其神经底板区域没有Shh的表达,这说明Shh基因被敲除后,脊索处微弱表达SHH蛋白,因而无法诱导神经底板表达Shh,因此不能在神经底板异位过表达Ihh。此外,我们利用鸡胚体外移植技术进一步探究SHH与IHH对于神经管发育的影响。在鸡胚HH13期中,在其尾部的神经管未完全闭合时剥离脊索,在神经管两侧分别放置SHH、IHH蛋白,结果显示SHH蛋白能使神经管进一步闭合,但IHH蛋白则不能。另外,在鸡胚HH13期中其尾部的神经管未完全闭合时,在神经管周围两侧分别放置SHH、IHH蛋白后继续体内培养,结果显示SHH蛋白能使神经管管壁出现异常弯曲,弯曲处变薄,可能形成新的神经底板,但IHH蛋白则不能。神经底板的形成对于神经管的正常发育起着至关重要的作用,说明在神经管的发育过程中,Ihh不能替代Shh的功能。本研究为揭示Shh和Ihh在小鼠器官发生中的功能替代机理,以及对神经管的发育缺陷机制提供参考。神经管正常的闭合发育受多基因网络综合调控,对其深入的研究将可能对神经系统发育异常的机理提供有用资料和为临床治疗提供新的靶点。

论文目录

• 中文摘要
• abstract
• 绪论
• 第一章 材料与方法
•   1.1 实验材料
•     1.1.1. 实验动物
•     1.1.2 .菌株、质粒、载体与种蛋
•     1.1.3 .主要实验仪器与设备
•     1.1.4 主要实验试剂
•     1.1.5 实验试剂配制
•   1.2 实验方法
•     1.2.1 目的基因片段扩增
•     1.2.2 重组质粒构建
•     1.2.3 小鼠胚胎的收集与整理
•     1.2.4 转基因小鼠基因型鉴定
•     1.2.5 组织石蜡包埋与切片
•     1.2.6 组织冰冻切片
•     1.2.7 组织整体形态观察
•     1.2.8 组织HE（苏木精-伊红）染色
•     1.2.9 免疫荧光染色
•     1.2.10 整骨染色
•     1.2.11 整体原位杂交
•     1.2.12 鸡胚组织的培养
• 第二章 实验结果
•   2.1 Shh组织特异性敲除小鼠有效性的验证
•   2.2 Shh组织特异性敲除导致小鼠畸形
•   2.3 pMes-Ihh转基因小鼠的构建
•     2.3.1 pMes-Ihh-IRES-eGFP质粒的构建
•     2.3.2 pMes-Ihh-IRES-eGFP质粒酶切线性化
•     2.3.3 原核显微注射制备pMes-Ihh转基因小鼠
•     2.3.4 条件性过表达Ihh转基因小鼠的有效性验证
•   2.4 过表达Ihh可部分挽救Shh敲除型小鼠畸形
• Cre/-;pMes-Ihh转基因小鼠中过表达Ihh的验证'>    2.4.1 Shh^Cre/-;pMes-Ihh转基因小鼠中过表达Ihh的验证
• Cre/-;pMes-Ihh转基因小鼠的整体形态观察'>    2.4.2 Shh^Cre/-;pMes-Ihh转基因小鼠的整体形态观察
•     2.4.3 过表达Ihh可部分挽救Shh敲除小鼠缺失的口面部中线结构
•     2.4.4 过表达Ihh可完全挽救Shh敲除小鼠畸形的肢芽结构
•     2.4.5 过表达Ihh无法挽救Shh敲除小鼠神经管的缺陷
•   2.5 过表达Ihh无法挽救Shh敲除小鼠神经管发育缺陷的机制
•     2.5.1 Shh敲除后导致SHH无法分泌至神经管底板
•     2.5.2 Ihh在神经管发育过程中,无法替代Shh的功能
• 第三章 分析与讨论
• 第四章 结论
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 索引
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 韦亦泠

导师: 胡雪峰

关键词: 信号通路,功能替代,神经管,发育

来源: 福建师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 福建师范大学

分类号: Q344

DOI: 10.27019/d.cnki.gfjsu.2019.000174

总页数: 92

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