陈新
摘要：通过采用稳定过量表达T型钙通道α1H亚单位基因（CACNAIH）的HEK-293(humanembroyonickidney)细胞来研究α1H亚单位基因（CACNAIH）在细胞增殖中的作用。采用标准全细胞膜片钳来记录从mRNA转录水平和T型钙通道蛋白质功能水平来验证α1H亚单位基因的过量表达。通过实验结果表明T型钙通道α1H亚单位基因能够促进细胞的增殖，提高了与细胞周期有关基因的蛋白质表达水平，从而为开发治疗与细胞增殖异常有关的疾病提供有关的理论根据。
关键词：T型钙通道；亚单位基因；细胞增殖；作用
动脉粥样硬化（Atherosclerosis）是动脉硬化中最常见而重要的类型，主要的特点是受累动脉的内膜有类脂质的沉着，复合糖类的积聚，继而纤维组织增生和钙沉着，并有动脉中层的病变。这种病主要是累计大型以及中型的肌弹力型动脉，最为常见的是冠动脉以及主动脉，因此，把发生在冠动脉上的动脉粥样硬化称之为为冠状动脉粥样硬化（CoronaryAtherosclerotic）。目前最为创建的治疗冠状动脉粥样硬化的方法主要是经皮冠状动脉腔内成形术(Percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty,PTCA)。经皮冠状动脉腔内成形术的细胞再次狭窄主要是由于血管平滑肌的过度增殖，所以，要弄清楚血管平滑肌增殖的生物学机制是当前最重要[1]。在本文中主要是通过构建T型钙通道α1H亚单位基因的表达构件，利用HEK-293(humanembroyonickidney)细胞系来建立过量表达α1H亚单位基因的稳定细胞株，从而探讨T型钙通道α1H亚单位基因在细胞增殖与细胞周期有关基因的蛋白质表达关系，阐述其主要作用。
1、实验材料以及方法
1.1、实验材料
采用分析纯；太牛血清（FCS）以及培养基（DMEM）；人类T型钙通道α1H亚单位基因（CACNAIH）；pcDNA3.1(+)表达载体。
1.2、实验方法
1.2.1细胞培养
将T型钙通道α1H亚单位基因克隆到真核表达再体pcDNA3.1(+)的EcoRV-XbaI位点上[2],建成真核表达质粒pcDNA3.1(+)-humanα1H。通过利用浓度为1mg/ml的G418筛选阳性克隆从而得到的稳定过表达人类T型钙通道α1H亚单位基因的细胞——HEKα1H，HEKα1H对照着HEK-293细胞系在含有10%胎牛血清（FCS）以及培养基（DMEM）中，潮湿条件为5%的二氧化碳和95%的氧气的环境下，同时在HEKα1H中加入G418的浓度为1mg/ml。
1.2.2细胞增殖实验
在六孔的细胞培养板中每一个孔接种5×103个细胞，培养至三天、六天、八天以及十天后分别收获细胞，离心后的细胞重悬浮在6ml的osmocel溶液中，采用CorlterCounter细胞计数仪来计算细胞数量，每一种细胞，每一时间都通过计数3个培养孔的细胞，从而画出生长曲线，重复三次以上实验，将三次的综合数据用PrismGraphPad软件计算出细胞群体的倍增时间。
1.2.3全细胞膜片钳记录
通过采用标准的全细胞法记录钙通道的电流[3]，用计算机控制Axopatch200A膜片钳放大器，在22℃的温度下，微电极的电阻为1-2MΩ。钙通道的电流记录为：保持膜电位为-90mV，采用10mV的间距为-80到60mV,时间为两百毫秒区极化脉冲，记录不同牵制电压下得钙电流，电流值用pA/pF来表示。
1.3统计学分析
采用SPSS11.0软件统计分析数据,计数资料比较采用x检验,当P<0.05时，差异有统计学意义。
2、实验结果
2.1HEKα1H以及HEK-vector细胞增殖特点
HEKα1H以及HEK-vector细胞的生长曲线区下图1所示：在上图中我们可以看到，HEKα1H的细胞比HEK-vector细胞的增长速度要快，尽管在接种时细胞数目是相同的，然而在每一个时间点的细胞计数结果上可以看出，HEKα1H的细胞数目与HEK-vector细胞的数目要大。两者的差异具有统计学意义。通过数据的研究分析，得到过量表达α1H单位的细胞增殖速度明显加快。
图1HEKα1H以及HEK-vector细胞增殖对比
2.2全细胞膜片钳记录检测
全细胞膜片钳记录检测结果如下图2所示：
图2全细胞膜片钳记录检测在稳定传染的HEKα1H细胞上记录的钙电流
在上图2中结果表明，稳定的传染HEKα1H细胞具有明显的T型钙通道功能，同时还可以看出T型钙通道电流在稳定的传染型细胞上增加速度比较明显，从蛋白质的功能水平上也证明了α1H亚单位基因的过量表达。
3、T型钙通道α1H亚单位基因在细胞增殖中的作用
通过这次的实验研究表明，T型钙通道α1H亚单位基因能够直接促进细胞的增殖，从而使单个细胞群体的倍增时间缩短了八个小时。在没有特殊情况下，通常使用蛋白质对应抗体的特异性来检测表达的定量分析[4]，在这次的实验研究中，使用的是全细胞膜片钳记录的方法来证明HEKα1H细胞上的T型钙通道电流的增加。哺乳动物的细胞周期一般可以分为四个周期，分别是S期、M期、G1期以及G2期。细胞在细胞周期中依照顺序而完成其增殖。通常情况下，钙高峰期的出现是细胞周期的S期或者是从G1期到S期的过渡期，同时，这时侯也是T型钙通道α1H亚单位基因表达的最佳时期。
综上所述，T型钙通道α1H亚单位基因能够促进细胞的增殖，提高了与细胞周期有关基因的蛋白质表达水平，但是T型钙通道影响细胞周期的更为具体的分子机制还是有待进一步的研究。
参考文献：
[1]Fems,G.andT.Avades,2000.Themechanismsofcoronaryresencsis:insightsfromexperimentalmodes.Internat.J.Fxp.Pathal.81:63-88.
[2]Perez-Reyes,E.1998.Molecularcharacterizationofanovel.J.Bioemerget.andBiomemb.30:313-319.
[3]Akaike,N.,H.Kanaide,T.Kuga,M.NakemurasndJ.Sadoshima.1989.Low-volatage-activeatedcalciumcurrentinrataortesmoothmusclecellsinprimarycultureculture.J.Physial.416:141-160.
[4]Schmitt,R,J.P.Clozel,N.TbergandF.R.Buhler,1995.Mibefradilpreventsneointimaformationaftervascularinjuryinrats.Arterioscter,Thrumb,andVasculBial.15:1161-1165.