一、华广虻肠道溶纤活性蛋白的纯化和性质(英文)（论文文献综述）
李飞[1]（2013）在《重组人抗PAI抑制作用的新型纤溶酶原激活剂突变体的表达与活性研究》文中研究指明血栓性急性心脑血管病是严重威胁人类健康的疾病。目前在治疗这类疾病方面已经取得了重大进展,溶栓治疗是其中最为重要的技术之一。据世界卫生组织统计,全世界每年死于该类疾病的患者大约有1600万人,我国每年患有这类疾病的人数也有500万人。因此,研发出新的高效的溶栓药物受到越来越多研究机构的重视。组织型纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator,t-PA）是纤溶系统的生理性激活剂,由于t-PA与血栓基质纤维蛋白有很强的特异性亲和力,能有效地在血栓局部激活纤溶酶原为纤溶酶而使血栓溶解。重组t-PA是利用基因工程技术开发出的用于治疗心脑血管病的特效药,与链激酶、尿激酶等溶栓剂比较具有作用快、不造成全身的纤维蛋白溶解、疗效高等优点,但是在临床应用中也有很多不足,如在体内可被肝细胞迅速清除,在血浆中存在纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）可快速抑制其活性。t-PA在血中的半衰期很短（1～5min）使临床溶栓治疗时为维持有效浓度需大剂量（100～150mg）,增加了系统性纤溶引起出血的危险。由德国的勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）制药公司生产的瑞替普酶（rt-PA）和阿替普酶（CHO-t-PA）,已经成功投放市场用于治疗血栓性疾病。首先它们在体内的半衰期延长到了18min,且增强了与纤维蛋白的结合力,并且还是可逆结合,大大提高了激活纤溶酶原的活性。其次可通过静脉给药,且降低了用药剂量。但是它们的分子结构中有PAI-1的结合位点,血液中的PAI-1与其结合从而抑制纤溶活性。有国外文献报道血栓性疾病患者血中PAI-1浓度高于正常人,体外实验也证实了5U·mL-1的PAI-1可以使5ng·mL-1rt-PA和天然CHO-t-PA失活,所以临床用量仍较高。因此研制半衰期长且活性不受PAI-1抑制、用量小、成本低、副作用小的t-PA突变体成为当务之急,本实验室在重组t-PA的基础上使PAI-1位点的碱基突变,去除了指状区、表皮生长因子区和Kringle1区,使含有373-384PAI-1结合位点的rt-PA的基因序列AAG CAC AGGAGG突变为GCG GCC GCG GCG,氨基酸KHRR相应变为AAAA,构建了新的t-PA突变体,并克隆于大肠杆菌表达载体。本研究构建pBV220-t-PA重组表达质粒,经DNA测序确认后,转化至大肠杆菌DH5α,温控诱导表达,凝胶过滤法对包涵体蛋白进行初步纯化,复性后,过刺桐胰蛋白酶亲和层析柱纯化,酶动力学分析其活性。测序证实t-PA突变体的DNA序列正确,表达蛋白占总菌体蛋白30%,比活性为4.2×105IU·mg-1, t-PA突变体与PAI-1反应后其活性未受到抑制。t-PA突变体酶的米氏常数Km为0.3298μmol·L-1,最大水解速度Vmax为0.0476μmol·min-1·g-1。经生物学活性测定,表达蛋白能够明显抵抗PAI的抑制作用,并具有良好的生物活性,该突变体有可能成为用量更少、疗效更佳的新型溶栓药物。
汪威[2]（2011）在《斑蝥纤溶活性蛋白的提取纯化及其作用性质研究》文中进行了进一步梳理本文首次从斑蝥体内提取纯化得到一种活性蛋白,并对其抗血栓和抗癌作用进行了初步的研究。采用硫酸铵盐析法对其蛋白质进行提取,用DEAE-32纤维素层析柱对所分离斑蝥蛋白粗提液进行纯化,得到相对分子质量约为95.5kD的单一组分蛋白。经检测,斑蝥活性蛋白具有纤溶活性,每毫克斑蝥活性蛋白相当于14.7尿激酶国际标准活力单位,其蛋白浓度为10mg.mL-1,糖含量为11.084%。本实验还研究了不同理化因素对斑蝥活性蛋白的影响。该活性成分在35℃下最稳定,65℃及以上活性丧失,金属离子K+、Na+对其活力无影响,Mn2+、Ca2+对其有明显抑制作用,1%的SDS和1%的巯基乙醇则可完全抑制其活力。最适pH为6.0-7.0。实验还对斑蝥活性蛋白进行了红外吸收检测,结果表明,斑蝥虫活性蛋白可能是一种含有糖结构的蛋白质。实验还采用急性毒性实验对斑蝥活性蛋白的安全性进行初步研究,结果表明斑蝥活性蛋白安全。同时对斑蝥活性蛋白的溶血性做了检测,其溶血率小于5%,不引起体外红细胞的明显溶血,安全性好。对斑蝥活性蛋白进行体外溶栓实验,结果表明其具有溶栓作用,并且血凝块的溶解率随着斑蝥活性蛋白浓度的增加而增加。血栓与恶性肿瘤转移关系密切。因此,本文通过斑蝥活性蛋白对乳腺癌细胞（MCF-7）,肺癌细胞（A549）和小鼠腹水瘤细胞（S180）的抑制作用实验,MTT法测定斑蝥纤溶活性蛋白对以上细胞体外增殖的影响,纤溶活性蛋白按照不同浓度分别作用于细胞24h和48h,结果显示其中对S180、A549细胞细胞的抑制效果较好,对MCF-7细胞抑制作用不明显,由此显示斑蝥纤溶活性蛋白对于肿瘤细胞的抑制作用具有选择性。然而它含有的溶栓活性蛋白组分是否有直接杀伤肿瘤细胞的作用、其抑制作用机理等尚待进一步研究。另外,它的抑制血管生成作用具体途径及其机制也还需进一步研究加以证实。
姚天赐[3]（2010）在《短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂对动物凝血、循环、呼吸和中枢神经系统功能的影响》文中研究表明蛇毒中含有较多的影响血液系统功能的活性组分,如:凝血酶样酶、解离素、纤溶酶、纤溶酶原激活剂、凝血Ⅹ因子激活剂等,特别是在蝮科和蝰科蛇毒中尤为突出。1993年,中科院昆明动物研究所的张云等[1]首先报道从竹叶青蛇（Trimeresurus stejnegeri）蛇毒中分离纯化出具有激活纤溶酶原作用的蛋白酶（TSV-PA）,并对TSV-PA的大量后续研究,为新型溶栓药物的开发提供了新的思路。本实验室已成功从江浙短尾蝮（Gloydius brevicaudus）蛇毒中分离纯化出短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂（plasminogen activator of Gloydius brevicaudus venom, GBV-PA）,并通过动物实验发现它对动物实验性血栓具有治疗和预防作用。为了全面了解GBV-PA的药理学特点,本课题拟研究GBV-PA对动物凝血系统的影响和并观察其一般药理学作用,为进一步的开发研究提供资料。1. GBV-PA的分离纯化及部分理化性质测定1.1 GBV-PA的分离纯化短尾蝮蛇粗蛇毒用苯甲脒-琼脂糖凝胶（Benzamide SepharoseTM 4 Fast Flow）亲和层析,得到两个蛋白峰,收集具有酶活性的第二峰,经浓缩后再用Superdex G-30凝胶过滤层析进一步纯化,得到2个蛋白峰,纤维蛋白平板法鉴定第Ⅱ峰的降支具有激活纤溶酶原,间接溶解纤维蛋白的作用,该组分再过Lichrospher C18 4.6/250反相色谱柱,得到2个蛋白峰,经纤维蛋白平板法鉴定得到第Ⅱ峰具有间接溶解纤维蛋白作用,既GBV-PA。1.2 GBV-PA的理化性质GBV-PA经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,在β-巯基乙醇还原和非还原条件下,均显示单一条带,即其为单一肽链的蛋白质,分子量为40kDa左右。1.3 GBV-PA对小鼠的急性毒性按照化学药物急性毒性试验技术指导原则测定GBV-PA对小鼠的急性毒性。做了一个初始剂量360μg.kg-1小鼠预试验,观察期内小鼠不出现急性毒性,以2倍的倍数递增剂量,128倍剂量时小鼠仍不出现急性毒性。给予小鼠最大给药浓度、最大给药体积剂量,进行最大耐受量（Maximal tolerance dose, MTD）实验,小鼠未见其他异常反应。表明GBV-PA静脉注射给药不能获得对小鼠的LD50,单次给药也无明显毒性反应。2. GBV-PA对家兔凝血功能的影响取健康家兔30只,雌雄各半,随机分为5组即:GBV-PA 75μg.kg-1、150μg.kg-1、300μg.kg-1、生理盐水阴性对照组和UK阳性对照组。分别于用药前,用药后60min取血2ml,以3.8%枸橼酸钠（9:1）抗凝。制备贫血小板血浆（PPP）,测定兔血浆的PT、APTT、TT及凝血时间CT。结果家兔静脉注射不同剂量的GBV-PA后,家兔的凝血时间CT从原来的108s左右延长到120s158s,家兔的APTT从原来的40s左右延长到68s153s,家兔的PT从原来的16s左右延长到48s93s,TT则从原来的20s左右延长到98s150s,并且呈现一定的剂量依赖性。3.GBV-PA对动物循环、呼吸和中枢神经系统功能的影响3.1 GBV-PA对小鼠神经系统的影响观察GBV-PA对小鼠自主行为活动、自发活动、协调运动和阀下戊巴比妥钠催眠实验的影响。结果小鼠静脉注射GBV-PA90、360和720μg.kg-1后,与NS组比较,小鼠自主行为活动基本正常;与NS组比较, GBV-PA对小鼠自发活动次数影响无显着性差异（p>0.05）;与NS对照组和氯丙嗪阳性对照组比较,GBV-PA对小鼠的协调运动无影响;与安定阳性对照组和空白对照组比较,GBV-PA对各剂量组小鼠阈下剂量戊巴比妥钠催眠亦无协同作用;表明静脉注射GBV-PA90、360和720μg.kg-1对小鼠的神经系统和精神系统均无明显影响。3.2 GBV-PA对大鼠血压和心率的影响采用多导生物信号记录仪观察记录麻醉大鼠给药前后收缩压（SAP）、舒张压（DAP）、心率（HR）的变化。结果与NS对照组相比,静脉注射GBV-PA90、360、720μg.kg-1后大鼠的SAP、DAP、MAP和HR变化无显着性差异。3.3 GBV-PA对麻醉大鼠呼吸功能的影响将张力传感器用手术线连接并固定于动物剑突皮肤处,信号连接于多导生物信号记录仪,测定麻醉大鼠给药前后的呼吸频率和呼吸幅度,同时用Ⅱ导联心电电极测定大鼠的心电图。结果与NS对照组相比,静脉注射GBV-PA 75、150和300μg.kg-1对大鼠呼吸频率和呼吸幅度和心电图无明显影响。结论:小鼠静脉注射GBV-PA 46mg/kg未见明显毒性;家兔iv GBV-PA 75、150和300μg.kg-1血浆的PT、APTT、TT、CT显着延长,呈现一定的剂量依赖性;静脉注射GBV-PA 90、360和720μg.kg-1对小鼠的自发活动、自主行为活动、协调运动等神经和精神系统活动无明显影响;大鼠iv 75、150和300μg.kg-1对血压、心率、呼吸频率和呼吸幅度亦无明显影响。
朱琦[4]（2009）在《单环刺螠纤溶酶分离纯化、免疫原性及其基因克隆的初步研究》文中研究表明目的:血栓栓塞性疾病（thrombotic disease,TD）是一种常见病和多发病,发病率、致残率、致死率皆高。药物溶栓是目前临床最有效的治疗手段。迄今为止,溶栓剂已发展了三代,但仍然存在一定的缺陷,有待研究开发出安全有效的新型溶栓剂。本研究旨在从海洋动物单环刺螠（Urechis unicinctus）体内提取纯化出一种新型的生物溶栓剂,在此基础上确定其分子特征、酶免疫原性,并克隆部分编码区cDNA,为进一步开展基因工程菌的构建,重组活性蛋白的表达的深入研究奠定基础。方法:将单环刺螠体腔液经离心,经分子量8,000Da和30kD截留分子量滤膜超滤、Sephadex G-75、DE 52阴离子交换层析柱和Sephacryl S-100HR凝胶柱分离等步骤进行酶的分离纯化。SDS-PAGE电泳和HPLC鉴定纯度,测定其分子量。N端测序及质谱从头测序（de novo）确定该酶的部分氨基酸序列。为研究单环刺螠纤溶酶作为一种潜在药物,其对药物安全性评价的影响和动物体内过敏反应,对该纤溶酶进行了初步免疫原性研究,以天然纤溶酶和加热变性纤溶酶分别免疫新西兰兔,采用背部皮下和后腿肌肉多点注射进行免疫,琼脂双向扩散法测定纤溶酶抗体效价。采用RT-PCR的方法,根据N端及另外3段氨基酸序列设计10条简并引物,组成18种组合,以单环刺螠消化道组织总RNA为模板,用RT-PCR的方法尝试克隆该种纤溶酶组分的cDNA片段。结果:通过酶的纯化最终获得一种纯酶组分,在SDS-PAGE电泳图谱上显示一条蛋白区带,经HPLC鉴定呈现单一峰,说明为纯品。蛋白质分子量测定为约26.4kDa。酶纯化倍数为10.2,回收率为13.9%,比活力达421.9U/mg。经专一性水解酶降解,N端测序及质谱分析,获取酶分子中5段多肽链的氨基酸序列,分别为:N端:ICGGSPADIT;中间部分序列:DMKR;RNRLPHACMPZR;ACVWYFVH;BNEGGYLDACM。经Blastp比对分析,没有发现同源性较高的序列,说明此酶为一种新发现的蛋白酶。琼脂双向扩散平板未出现免疫沉淀线,表明该酶免疫原性低,在兔体内未产生可检测的抗体量。本实验中克隆得到了3个基因片段,经Blastp搜索分析,其中2个片段与蚯蚓、白蚁等动物来源的内切葡聚糖酶相似性较高,1个与septin基因家族成员septin 11相似性较高。但设计引物所依据的氨基酸序列是根据质谱图推算出的,这种方法鉴定的可靠性有待进一步确定。可能需要再结合传统化学方法进行末端氨基酸序列测定,再分离基因。数据库所给出的结果虽然显示了一定的相似性,但尚不能确定获得的序列与搜索到的基因是同一类基因,也有可能是一种全新的具有纤溶活力的蛋白质。要最终证明其是否为纤维蛋白溶解酶,需要通过克隆全长cDNA序列,在原核或真核生物中表达,获得重组蛋白,测定是否具有纤溶活力。
崔莉[5]（2008）在《蛹虫草纤溶酶的分离纯化、酶学性质及溶栓抗栓作用研究》文中认为血栓性疾病包括急性心肌梗死,缺血性心脏病,心血管疾病,心脏瓣膜病,周边血管疾病,心律失常,高血压等,日渐成胁着人类的健康。世界卫生组织（WHO）2000年的统计数据表明,心血管疾病已经占全世界死亡率的29%。鉴于此,溶栓抗栓药物的研制开发已成为国内外研究热点之一。目前用于血栓性疾病治疗的药物都不同程度具有纤维蛋白特异性差、体内半衰期短、生产成本高、需大剂量连续用药等缺点。于是,国内外专家学者,逐渐将目光投向寻找一些安全性好、副作用小、疗效好的天然来源的溶栓药物。虫草菌是我国传统名贵中药,属子囊菌门（Ascomycota）、子囊菌纲（Ascomycetes）、粪壳菌亚纲（Sordariomycetidae）、肉座菌目（Hypocreales）、麦角菌科（Clavicipitaceae）、虫草菌属（Cordyceps（Frey）Link.）,是一种虫生真菌;在民间,常常被称为冬虫夏草。药理学研究表明在增强免疫力,抗肿瘤,抗细菌和抗真菌等方面具有良好功效;蛹虫草因与冬虫夏草有着相似的结构和功能,近年来备受各界关注。迄今为止,蛹虫草是否具有纤溶功能还未见报道。本研究首次筛选到一株产生高活性纤溶酶的SN-18菌株,进行了形态和分子鉴定;优化了培养条件和培养基组成,进而对蛹虫草纤溶酶进行分离纯化,研究了酶学性质以及体内和体外的溶栓抗栓功能,为进一步研究与应用开发提供了必要的工作基础和科学依据。主要研究结果如下:一、纤溶活性菌株SN-18的分离鉴定及产纤溶酶发酵特性研究1.根据菌丝形态,分生孢子形态以及人工培养产生的子座形态对分离筛选到的具有最强的纤溶活性编号为SN-18菌株进行鉴定,初步推测为蛹虫草。2.对基因组DNA的ITS1-5.8S-ITS2区域的PCR产物测序,将测序结果运用Blastn程序与GenBank中的核酸序列进行比对分析,筛选与SN-18同源性较高的典型菌株构建系统发育进化树。根据序列相似性分析结果得知:菌株SN-18与蛹虫草C.miitarisAY899258和蛹虫草拟青霉Paecilomgces militaris DQ342250、DQ342248具有相当高的同源性,相似性达100%,结合形态鉴定的结果可以判断SN-18就是蛹虫草。3.采用单因素试验法确定了SN-18产纤溶酶的最佳培养基组成和培养条件:培养基组成为面粉1%,蚕蛹粉5%,接种量10%;培养条件为转速160r/m,装液量30mL/250mL,温度25℃,培养时间为6天。发酵液纤溶酶活力达到32.34U/ml,是未优化前的PDA液体培养基的2.31倍。二、蛹虫草纤溶酶的分离纯化和酶学性质1.蛹虫草液体发酵液离心,获得粗酶液,粗酶液经硫酸铵分级沉淀后,收集活性成份,经凝胶层析达到电泳纯。2.酶活最适pH和最适温度为pH 6.0和25℃。Mg2+和Fe2+促进酶活,EDTA和Cu2+抑制酶活。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,得出单一条带,其近似分子量为27.3kDa。N端氨基酸序列为IVGGVSVAIE（Swiss prot登录号P85318）三、蛹虫草纤溶酶溶栓、抗栓作用研究1.溶栓作用实验表明:蛹虫草纤溶酶具有直接降解纤维蛋白的纤溶活性。体外对毛细管血凝块溶解实验结果为:毛细管血凝块于37℃培养3h后,蛹虫草纤溶酶（12U/ml）组的溶解率为29.49%,与生理盐水空白对照组（3.01%）差异显着（P＜0.01）。注入蛹虫草纤溶酶的毛细管由于其中的血凝块被溶解而使管内的溶液变红,血凝块明显变短变细,而且在管内随液体滑动,阻塞消除。而空白对照则保持阻塞状态。体外对血凝块溶解实验结果为:蛹虫草纤溶酶分别取24U/ml、24U/ml、12U/ml、6U/ml四个浓度,以尿激酶12U/ml为阳性对照和生理盐水为空白对照,各取8ml,在37℃,90r/min条件下,12小时之内,考察对0.5g的血凝块的溶解率。结果为24U/ml、12U/ml、6U/ml三个浓度对血凝块的溶解率分别为99%、53.4%、14.2%、8.6%和4.4%,且三个浓度组呈量效关系。24U/ml浓度组在12h后,试管中完全看不到血凝块,其溶解后的微粒悬浮在试管中,使试管内液体由澄清变混浊。而尿激酶12U/ml阳性对照组,还可以看到成型的血凝块,溶液的颜色和做为空白的生理盐水组相近,还较澄清。2.抗栓作用实验表明:蛹虫草纤溶酶粗制液在体内8 min之内就对大鼠血小板性动脉血栓形成具有明显的抑制作用,蛹虫草纤溶酶中剂量组（ⅳCMase 12 U/kg）在体内对大鼠血小板性动脉血栓形成的抑制作用与尿激酶（ⅳ250U/kg）相当,二者差异不显着;中（ⅳCMase 12 U/kg）、高剂量（ⅳCMase 18 U/kg）给药组与空白对照组有显着差异（P＜0.01）,并且三个给药组呈量效关系。蛹虫草纤溶酶粗制液在体内8 min之内就对ADP诱导的大鼠血小板聚集具有明显的抑制作用,蛹虫草纤溶酶中剂量组（ⅳCMase 12 U/kg）对ADP诱导的大鼠血小板聚集的抑制作用与尿激酶（ⅳ500U/kg）相当,二者差异不显着。中（ⅳCMase 12U/kg）、高剂量（ⅳCMase 18 U/kg）给药组与空白对照组有显着差异（P＜0.01）,并且三个给药组呈量效关系。
李兴暖[6]（2007）在《地鳖虫纤溶活性蛋白抗血栓、抗肿瘤及其基因克隆与表达的研究》文中研究表明地鳖虫（Eupolyphaga sinensis walker），为《中华人民共和国药典》（2000版）记载的正品药材，是传统的活血化瘀类动物药，其功效主要为逐瘀、破积、通络、理伤。现代药理试验已充分证明地鳖虫具有溶解静脉血栓、抑制血小板聚集和抗凝血等药用功效。但是传统中医用药均以全虫入药，对其药效成分不明确，且对其作用机理研究不充分，本文从地鳖虫体内提取出纤溶活性蛋白（Eupolyphaga sinesis Walker Hbrinolytic Protein，EFP）成分进行实验，首先研究它在抗血栓形成、抗凝血和增强纤溶方面的作用。抗肿瘤血管生成的研究是当前抗肿瘤研究的热门课题，随着中药抗肿瘤研究的不断深入，发现某些中药，特别是一些具有活血化瘀作用的中药均具有抗肿瘤功效，其抗肿瘤的机制在于抑制肿瘤血管的生成。基于此，本文还研究了地鳖虫纤溶活性蛋白在抑制抑制血管生成和抗肿瘤方面的作用。为深入研究地鳖虫纤溶活性蛋白，本文还克隆了地鳖虫纤溶活性蛋白基因cDNA序列，并用大肠杆菌和毕赤酵母表达系统进行了表达。本文主要研究结果如下：（1）用地鳖虫纤溶活性蛋白（ig.）作用于角叉菜胶所致血栓的小鼠模型和正常小鼠，结果表明地鳖虫纤溶活性蛋白能够抑制角叉菜胶所致的小鼠尾部血栓的形成，能明显延长正常小鼠凝血酶时间，增强其组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）的活性、抑制其组织型纤溶酶原激活剂抑制剂（PAI）的活性。显示了地鳖虫纤溶活性蛋白具有良好的体内抗血栓作用。（2）以MTT法检测地鳖虫纤溶活性蛋白对体外培养的人微血管内皮细胞（MVEC）增殖的影响，结果表明EFP能有效抑制MVEC的增殖，实验浓度（0.02-200μg/ml）范围内最高抑制率达45.93％，且呈剂量依赖关系。（3）利用Annexin V-FITC/PI双荧光染色法和单细胞凝胶电泳（SCGE）法检测了EFP对MVEC凋亡的影响，结果表明EFP能显着促进MVEC细胞的凋亡。（4）通过流式细胞术检测了EFP对MVEC细胞周期的影响，结果EFP可将MVEC细胞阻滞在S期和G2/M期，使细胞不能进行分裂，抑制其增殖。（5）用鸡胚尿囊膜（CAM）模型检测EFP对血管形成的抑制作用，结果发现EFP能显着抑制鸡胚尿囊膜的血管生成，且具有一定的量应关系。（6）体内抑瘤实验结果表明，EFP能显着抑制S180和H22荷瘤小鼠实体瘤的生长，最高抑制率分别达48.54％和42.16％。（7）检测H22荷瘤小鼠肝脏丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，结果表明，EFP还能够增强小鼠体内抗氧化能力；检测H22荷瘤小鼠血清抗H22抗体水平和测量小鼠脾脏系数，结果表明EFP还能增强小鼠机体的体液免疫能力。（8）分析多种动物纤溶酶氨基酸序列，根据其同源性，获得保守序列，利用保守序列设计简并引物，进行PCR扩增。由于多种动物纤溶酶成熟肽N端具有一段非常保守的序列，在设计兼并引物时选取了该段保守序列，所以PCR扩增得到是具有完整5’末端的cDNA序列。然后利用3’末端快速扩增法（RACE）获得了该序列的3’末端，经拼接得到了完整的EFP基因cDNA序列。（9）利用大肠杆菌表达系统对EFP基因进行表达，首先构建了原核表达载体pET28a-EFP，转化表达菌株Rossetta，用IPTG进行诱导表达，结果经SDS-PAGE和Western blot鉴定，表明目的蛋白获得了表达，最高表达量约占细菌总蛋白的10％。但目的蛋白以包涵体的形式表达，无生物学活性。（10）将EFP cDNA基因与分泌型酵母表达载体pPICZαA进行重组，转化毕赤酵母表达菌株GS115，得到的转化子经甲醇诱导后，诱导表达上清经SDS-PAGE和Western blot分析证明目的蛋白获得了表达，经纤维蛋白平板法检测，发现目的蛋白具有纤溶活性。上述研究结果从不同方面表明地鳖虫纤溶活性蛋白具有抗血栓、抗肿瘤和抗肿瘤血管生成的作用；另外，成功克隆了EFP cDNA基因，并用毕赤酵母表达系统表达出了具有纤溶活性的蛋白。
陈少鹏[7]（2007）在《蜈蚣纤溶酶的提取纯化及其抗血栓研究》文中进行了进一步梳理血栓疾病是目前严重危害人类健康的疾病之一，蜈蚣作为中医一味活血化淤的中药，常用于治疗血栓性疾病，但其作用机制尚未有报道。本文首次从蜈蚣体内提取纯化得到一种纤溶酶，并对其抗血栓作用进行了初步的研究。采用离子交换层析和分子筛等制备方法从少棘蜈蚣中纯化到蜈蚣纤溶酶（Scolopendra subspinipes mutilans L．Koch fibrinolytic enzyme，SSFE），用纤维蛋白平板追踪检测纯化过程中的酶活力，PAGE检测纤溶酶的纯度，SDS-PAGE检测分子量，常规方法检测了SSFE急性毒性、溶血性和出血性，进行了SSFE体外溶栓和体内溶栓实验，并检测了凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血酶时间（AZTT）和凝血酶时间（TT）三个标准化指标，vwf鉴定人微血管内皮细胞（MVEC），MTT法检测SSFE对人微血管内皮细胞的生长影响。结果PAGE显示SSFE为单一组分，具有纤溶活性；证明SSFE无致出血性且无致溶血活性，低、中、高剂量SSFE使小鼠APTT和TT均显着延长，中剂量SSFE对PT有延长作用，而高剂量作用不显着，MTT检测表明SSFE对mvc的生长具有促进作用，24h促进作用比48h明显，最佳作用浓度为15mg／L。结论蜈蚣纤溶酶具有抗血栓作用。
张云龙[8]（2007）在《沙蚕纤溶蛋白酶的生化与分子生物学研究》文中认为血栓栓塞性疾病（thrombotic disease, TD）已成为目前严重的医学问题,发病率、致残率、致死率皆高。药物溶栓是目前临床应用最广泛、最有效的治疗手段。迄今为止,溶栓剂已发展了三代,但依然存在一定的缺陷,有待开发出一种安全有效的新型溶栓剂。本研究旨在从中国渤海湾海洋环节动物沙蚕（Nereis virens）体内开发出一种新型的海洋生物溶栓剂,确定其分子特征、酶学特性及溶栓机制,并构建此生物cDNA表达型文库筛选其克隆基因,为进一步分子生物学方面的深入研究奠定基础。本研究成功地从中国渤海湾沙蚕（Nereis virens）体内发现并提纯出一种电泳纯的新型海洋纤溶活性成分——沙蚕纤溶酶,又名N-V蛋白酶,并明确其主要富集于沙蚕（Nereis virens）的体腔液和内脏组织中。此酶的纯化工艺非常稳定,每升组织粗提液约可获得0.2mg活性蛋白,回收率为28.9%。该酶及其纯化工艺已获取国家发明专利（沙蚕蛋白酶及其分离提取纯化方法和应用,申请号:02144828.0,公开号:CN 1500873A）。证实此酶为一种单链蛋白,属丝氨酸蛋白酶家族新成员,具有类胰蛋白酶特性,表观分子量为29,000Da,等电点为4.5。经专一性水解酶降解,MALDI-TOF质谱分析,获取酶分子中10段多肽链的N-端氨基酸序列,Swiss-Prot数据库申请登录号为P83433,经分析比对,证实此酶为一种新发现的蛋白酶。该酶的纤溶活力和体外溶栓效果明显,比活力达116280U/mg,且具有良好的热稳定性和pH稳定性。溶栓机制分析发现,该酶为一种类尿激酶作用位点的纤溶酶,并发现与蚓激酶相似,既具有直接纤溶活性,也具有激酶活性,即通过激活纤溶酶原,使其转化为纤溶酶的间接纤溶活性。其能高特异性水解纤维蛋白原的Aα-链,而对Bβ-和γ-链的水解活性较低（Aα>Bβ>γ）,且能有效地水解纤维蛋白的α-链,而对β-和γ-γ链的水解活性较低（α>β>γ-γ）,并经胶内蛋白酶水解活性实验证实此蛋白水解活性与29,000Da电泳蛋白带相关。此外,还成功构建了沙蚕（Nereis virens）虫体的完整性cDNA表达型文库,为进一步基因克隆和表达研究奠定了良好基础。
隋玉杰[9]（2006）在《纤溶酶产生菌的筛选、鉴定及其液体发酵条件的研究》文中指出目的:分离筛选具有较高纤溶活性的产酶菌株,对产酶菌株进行初步鉴定,并进一步对产酶菌株的溶栓机制及液体发酵条件进行初步研究。方法:用生理盐水浸提实验菌固体发酵的大豆制备纤溶酶粗酶,通过纤维蛋白平板法筛选具有较高纤溶活性的产酶菌株,并进一步对菌株的菌落形态、菌体特征和生理生化特征进行鉴定。同时采用加热纤维蛋白平板法对菌株产生的纤溶酶在体外水解纤维蛋白的方式进行研究。以C1A-01为出发菌株,对其进行液体发酵培养。结果:从采集的多个样品中分离筛选到两株具有较高纤溶活性的产酶菌株C1A-01和C1A-03,初步确定这两个菌株均属于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。体外溶栓实验表明,C1A-01和C1A-03所产的纤溶酶通过直接溶解纤维蛋白的方式发挥溶栓作用,而不是通过激活纤溶酶原间接起作用。C1A-01液体发酵培养最适产酶条件为:碳源为葡萄糖,浓度为2%;氮源为豆粉,浓度为6%;初始pH值为7.0:接种量为10%。发酵第三天产酶最高,最大产酶量可达到394IU/ml。结论:获得了两株具有较高纤溶酶活性的枯草芽孢杆菌菌株C1A-01和C1A-03,而且其所产的纤溶酶溶纤方式特殊,有望开发成新一代的抗栓溶栓药物。
李张伟[10]（2006）在《土鳖虫纤溶成分的提取和基因克隆的研究》文中认为土鳖虫为传统活血化淤类中药，首载于《神农本草经》，被广泛用于治疗血滞经闭、淤血腹痛和因跌打损伤引起的血淤不通等病症，治疗效果显着。然而迄今，未见到对土鳖虫抗血栓机理的深入研究，土鳖虫体内的纤溶活性成分也未被完全分离纯化出来，这对充分开发祖国医学这一宝贵动物药材，研制高效低副作用抗血栓药物造成了极大困难。本文通过生化分离手段，从土鳖虫体内提取纯化出三种具有纤溶活性的物质，并对其中一种进行了生化性质的研究，并在此基础上深入至分子水平，对土鳖纤溶活性成分进行了基因克隆和分析。 本研究中，首先通过硫酸铵分段沉淀、DEAE—纤维素柱和Sephadex G-75柱层析从活雌性地鳖体内分离纯化得到一种纤溶酶原激活物（EFF-1），该激活物经SDS-PAGE电泳检测，显示为一条带，其分子量为41.3KD，含糖量为10.5％。其水解纤维蛋白的比活力为547.9U／mg，进一步研究表明，该成分属于丝氨酸蛋白酶类。此外，通过制备电泳法，从活雌性土鳖体内分离纯化到另外两种纤溶成分：EFF-2、EFF-3，分子量分别为32.9KD和30.6KD，比活力为234.0U／mg和148.5U／mg，EFF-2和EFF-3均具有直接纤溶酶活性，提示它们为新的具有纤溶酶活性的蛋白酶。 其次根据已登陆NCBI网站的蚯蚓纤溶酶、蜈蚣纤溶激酶和人的激肽释放酶的氨基酸保守序列设计出一对简并引物，用RT-PCR的方法从土鳖体内克隆到一段长度为434bp基因序列，共编码144个氨基酸，经蛋白质Blastp比对，证实获得的氨基酸序列为胰蛋白酶家族成员，与多种动物的胰蛋白酶有较高的同源性，与蚯蚓纤溶酶、蜈蚣纤溶酶激酶及人类激肽释放酶的蛋白质序列有一定的同源性，保守序列也一致，证明所克隆出来的cDNA序列是土鳖胰蛋白酶的一段核苷酸序列，为首次发现的基因，记为序列一，命名为ET-Ⅰ；再跟据上述蚯蚓纤溶酶、蜈蚣纤溶激酶的成熟肽N端氨基酸保守序列和序列一设计出一对简并引物，从土鳖虫体内克隆到一段长度为535bp基因，其氨基酸序列与序列一有81％的一致性，为另一种胰蛋白酶家族成员，同样与多种动物的胰蛋白酶有较高的同源性。根据序列二，运用3′末端快速扩增法（3′RACE）法成功克隆出序列二的3′端序列，记为序列三。将序列二和序列三进行拼接，得出完整成熟肽，记为序列四，命名
二、华广虻肠道溶纤活性蛋白的纯化和性质(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、华广虻肠道溶纤活性蛋白的纯化和性质(英文)（论文提纲范文）
（1）重组人抗PAI抑制作用的新型纤溶酶原激活剂突变体的表达与活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）斑蝥纤溶活性蛋白的提取纯化及其作用性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| Catalogue |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 斑蝥研究现状 |
| 1.2.1 斑蝥虫 |
| 1.2.2 斑蝥素及其衍生物的作用机制 |
| 1.2.3 临床应用 |
| 1.3 血栓形成机理 |
| 1.3.1 血栓的简介 |
| 1.3.2 血栓形成的机理 |
| 1.4 抗血栓药物 |
| 1.4.1 生理来源的抗血栓药物 |
| 1.4.2 动物性来源的抗血栓药物 |
| 1.5 恶性肿瘤与血栓形成关系 |
| 1.5.1 恶性肿瘤患者发生血栓的机制 |
| 1.5.2 恶性肿瘤引起血栓的临床表现 |
| 1.5.3 恶性肿瘤并发血栓的抗栓治疗 |
| 1.6 论文研究意义及主要研究内容 |
| 1.6.1 研究意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 第二章 斑蝥活性蛋白提取分离及纯化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要实验材料和试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 斑蝥活性蛋白分离 |
| 2.2.2 斑蝥活性蛋白纯化 |
| 2.2.3 活性蛋白纯度的鉴定 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 斑蝥活性成分分离纯化 |
| 2.3.2 DEAE-32纤维素柱纯化结果 |
| 2.3.3 纯度测定结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 斑蝥活性蛋白性质鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要实验仪器 |
| 3.1.2 主要实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 纤溶活性的测定 |
| 3.2.2 斑蝥活性蛋白分子量测定 |
| 3.2.3 目的蛋白的蛋白含量测定 |
| 3.2.4 目的蛋白的糖含量测定 |
| 3.2.5 物化因子对斑蝥活性蛋白活性影响的研究 |
| 3.2.6 红外光谱仪检测 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 纤溶活性的测定 |
| 3.3.2 斑蝥纤溶活性成分纤溶反应机制 |
| 3.3.3 斑蝥活性蛋白分子量的测定 |
| 3.3.4 斑蝥活性蛋白中蛋白质含量测定 |
| 3.3.5 斑蝥活性蛋白中糖含量测定 |
| 3.3.6 不同物化因子对斑蝥活性蛋白的影响 |
| 3.3.7 斑蝥活性蛋白红外谱图分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 斑蝥活性蛋白急性毒性及溶血溶栓实验 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要实验试剂 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 急性毒性实验 |
| 4.2.2 溶血性实验 |
| 4.2.3 体外纤溶 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 急性毒性实验 |
| 4.3.2 溶血性实验 |
| 4.3.3 体外纤溶 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 斑蝥活性蛋白对肿瘤细胞作用的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 主要实验仪器 |
| 5.1.2 主要实验试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞培养准备工作 |
| 5.2.2 细胞培养实验方法 |
| 5.2.3 统计学处理 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 斑蝥目的蛋白对S180细胞增殖的抑制作用 |
| 5.3.2 斑蝥目的蛋白对A549细胞增殖的抑制作用 |
| 5.3.3 斑蝥目的蛋白对MCF-7细胞增殖的抑制作用 |
| 5.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 1 结论与讨论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（3）短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂对动物凝血、循环、呼吸和中枢神经系统功能的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| Ⅰ. 短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂的分离纯化、部分理化性质及活性测定 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 2.1 短尾蝮蛇蛇毒纤溶酶原激活剂（GBV-PA）的分离纯化 |
| 2.1.1 Benzamide SepharoseTM 4 Fast Flow 亲和层析 |
| 2.1.2 Superdex G30 凝胶过滤 |
| 2.1.3 活性组分C18 反相层析 |
| 2.1.4 分离组分的活性鉴定 |
| 2.2 短尾蝮蛇蛇毒纤溶酶原激活剂（GBV-PA）的理化性质 |
| 2.2.1 蛋白质浓度的测定 |
| 2.2.2 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定纯度及测定分子量 |
| 2.2.3 GBV-PA LD50 的测定 |
| 3. 结果 |
| 4 讨论 |
| Ⅱ. 短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂对凝血功能的影响 |
| 1. 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物分组与取血 |
| 2.2 GBV-PA 对凝血时间（CT）的影响 |
| 2.3 GBV-PA 对家兔血浆凝血酶原时间（PT）的影响 |
| 2.4 GBV-PA 对家兔活化部分凝血活酶时间（APTT）的影响 |
| 2.5 GBV-PA 对凝血酶时间（TT）的影响 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| Ⅲ.短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂对动物循环、呼吸和中枢神经系统功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 GBV-PA 对小鼠中枢神经系统部分功能的影响 |
| 2.1.1 GBV-PA 对小鼠自主行为活动影响观察实验 |
| 2.1.2 小鼠自发活动试验 |
| 2.1.3 GBV-PA 对小鼠协调运动的影响 |
| 2.1.4 小鼠阀下戊巴比妥钠催眠实验 |
| 2.2 短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂(GBV-PA)对循环系统和呼吸系统的影响 |
| 2.2.1 GBV-PA 对麻醉大鼠血压的影响 |
| 2.2.2 GBV-PA 对麻醉大鼠呼吸频率和呼吸幅度及心电图的影响 |
| 2.3 统计方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
（4）单环刺螠纤溶酶分离纯化、免疫原性及其基因克隆的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 血栓性疾病及其危害 |
| 1.1.2 血栓形成 |
| 1.1.3 血栓病治疗方法 |
| 1.1.4 抗血栓药物研究进展 |
| 1.1.5 天然来源溶栓剂 |
| 1.1.6 溶栓酶基因克隆表达研究进展 |
| 1.1.7 单环刺螠研究概况 |
| 1.2 立题依据及研究目标 |
| 1.2.1 立题依据 |
| 1.2.2 研究目标 |
| 第二章 单环刺螠纤溶酶的分离纯化 |
| 2.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 单环刺螠纤溶酶活力测定方法 |
| 2.2.2 蛋白质浓度的测定 |
| 2.2.3 纤溶酶粗品的制备 |
| 2.2.4 纤溶酶的纯化 |
| 2.2.5 蛋白质纯度鉴定及分子量测定 |
| 2.2.6 蛋白质测序 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 粗酶制备 |
| 2.3.2 Sephadex-G-75凝胶过滤层析 |
| 2.3.3 DE 52阴离子交换柱层析 |
| 2.3.4 Sephacryl S-100HR凝胶过滤层析 |
| 2.3.5 纤溶酶纯化总结 |
| 2.3.6 纤溶酶纯度鉴定 |
| 2.3.7 纤溶酶分子量测定 |
| 2.3.8 氨基酸序列测定及比对 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 单环刺螠纤溶酶免疫原性的初步研究 |
| 3.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂与仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 抗原的准备 |
| 3.2.2 免疫动物 |
| 3.2.3 血清中抗体效价的测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 单环刺螠纤溶酶基因cDNA的克隆 |
| 4.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂与仪器 |
| 4.1.3 常用液体配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实验材料及器材的预处理: |
| 4.2.2 总RNA提取 |
| 4.2.3 RNA质量鉴定 |
| 4.2.4 cDNA第一链的合成 |
| 4.2.5 引物设计与合成 |
| 4.2.6 Touchdown PCR |
| 4.2.7 目的片段的回收及克隆 |
| 4.2.8 测序 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 总RNA提取 |
| 4.3.2 纤溶酶基因cDNA片段的克隆与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 总结 |
| 1.主要研究结论与创新点 |
| 2.不足之处与未来展望 |
| 参考文献 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（5）蛹虫草纤溶酶的分离纯化、酶学性质及溶栓抗栓作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 表格索引 |
| 图形索引 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 血栓性药物的研究概况 |
| 1.1 抑制血栓形成的药物 |
| 1.1.1 肝素 |
| 1.1.2 水蛭素 |
| 1.2 抑制血小板聚集的药物 |
| 1.3 溶解血栓药物 |
| 1.3.1 第一代溶栓药物 |
| 1.3.2 第二代溶栓药物 |
| 1.3.3 第三代溶栓药物 |
| 1.3.4 新一代溶栓药物 |
| 2 纤溶活性测定方法 |
| 2.1 纤维蛋白平板法 |
| 2.2 纤维蛋白块溶解时间测定法 |
| 2.3 全血凝块溶解试验法 |
| 2.4 四肽底物法 |
| 2.5 血清板法 |
| 2.6 酶联免疫吸附法(ELISA) |
| 2.7 水解酪蛋白测定法 |
| 3 实验动物血栓模型的建立 |
| 3.1 体外血栓形成法 |
| 3.2 血小板性血栓形成法 |
| 3.3 体内血栓形成法 |
| 3.3.1 机械性损伤法 |
| 3.3.2 电流损伤法 |
| 3.3.4 结扎法 |
| 3.3.5 光化学法 |
| 3.3.6 化学药物致血栓形成法 |
| 4 蛹虫草研究概况 |
| 4.1 古代有关蛹虫草的研究 |
| 4.2 蛹虫草的生物学特性 |
| 4.2.1 自然分布 |
| 4.2.2 形态特征 |
| 4.2.3 生活史 |
| 4.3 蛹虫草的主要化学成分及其药理功能 |
| 4.3.1 虫草素 |
| 4.3.2 虫草多糖 |
| 4.3.3 虫草酸 |
| 参考文献 |
| 第二章 纤溶活性菌株SN-18的分离鉴定及产纤溶酶发酵特性研究 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌种 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.1.4 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 纤溶活性的测定 |
| 1.2.2 产纤溶酶蛹虫草菌株的筛选 |
| 1.2.3 SN-18的菌株形态观察 |
| 1.2.4 SN-18的菌株DNA的提取 |
| 1.2.5 PCR扩增和测序 |
| 1.2.6 分子解析 |
| 1.2.7 产纤溶酶发酵特性研究 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 产纤溶酶蛹虫草菌株的分离筛选 |
| 2.2 SN-18的菌落和子座形态特征 |
| 2.3 基于ITS序列的分子鉴定 |
| 2.4 产纤溶酶发酵特性研究 |
| 2.4.1 培养基组分对SN-18产纤溶酶的影响 |
| 2.4.2 培养条件对SN-18产纤溶酶的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 蛹虫草纤溶酶的分离纯化和酶学性质 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌种 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 蛋白质浓度的测定 |
| 1.2.2 蛋白酶活性测定 |
| 1.2.3 纤溶活性的测定 |
| 1.2.4 酶的盐析 |
| 1.2.5 透析脱盐 |
| 1.2.6 凝胶层析 |
| 1.2.7 纤溶酶纯度和分子量的测定 |
| 1.2.8 N端氨基酸序列测定 |
| 1.2.9 酶活最适温度的测定 |
| 1.2.10 酶活最适pH的测定 |
| 1.2.11 金属离子和蛋白酶抑制剂对酶活的影响的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 粗酶提取用缓冲液的选择 |
| 2.2 硫酸铵盐析 |
| 2.3 尿激酶标准曲线的测定 |
| 2.4 蛋白质浓度测定标准曲线 |
| 2.5 凝胶色谱层析 |
| 2.6 纤溶酶纯度和分子量的测定 |
| 2.7 纯化方案的评价 |
| 2.8 酶活最适pH的测定 |
| 2.9 酶活最适温度的测定 |
| 2.10 金属离子和蛋白酶抑制剂对酶活的影响 |
| 2.11 酶的N端氨基酸序列测定 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 蛹虫草纤溶酶溶栓抗栓作用研究 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 蛹虫草纤溶酶加热平板法考察溶栓作用机理 |
| 2.2 蛹虫草纤溶酶体外对毛细管血凝块的溶解作用 |
| 2.3 蛹虫草纤溶酶体外对血凝块溶解实验 |
| 2.4 蛹虫草纤溶酶对大鼠颈动脉血栓形成的影响 |
| 2.5 蛹虫草纤溶酶对ADP诱导的大鼠血小板聚集功能的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 附录一 蛹虫草纤溶酶N端10个氨基酸序列 |
| 附录二 蛹虫草SN-18的ITS序列 |
| 附录三 SN-18与AY899258.1,DQ642248.1,DQ342248.1,AY899258.1的ITS序列相似性比较 |
| 博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）地鳖虫纤溶活性蛋白抗血栓、抗肿瘤及其基因克隆与表达的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 目录 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 血栓与溶栓药物 |
| 1.1.1 血栓的形成及危害 |
| 1.1.2 溶栓药物的研究历史 |
| 1.1.3 溶栓药物的主要来源 |
| 1.1.4 地鳖虫溶栓作用的研究 |
| 1.2 抗肿瘤及抗肿瘤血管生成的研究 |
| 1.2.1 血管生成与肿瘤血管生成 |
| 1.2.2 肿瘤血管生成的调控因子 |
| 1.2.3 中药抗肿瘤血管生成的研究 |
| 1.3 大肠杆菌表达系统 |
| 1.3.1 宿主细胞 |
| 1.3.2 表达载体 |
| 1.3.3 影响外源蛋白表达的因素 |
| 1.4 巴斯德毕赤酵母表达系统 |
| 1.4.1 巴斯德毕赤酵母的生物学特性 |
| 1.4.2 毕赤酵母表达载体的类型 |
| 1.4.3 质粒在毕赤酵母中的整合 |
| 1.4.4 影响外源基因在毕赤酵母中表达的因素 |
| 1.5 本文研究的主要内容及意义 |
| 第2章 地鳖虫纤溶活性蛋白抗血栓的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 地鳖虫纤溶活性蛋白的制备及纤溶活性测定方法 |
| 2.2.2 地鳖虫纤溶活性蛋白对小鼠KPTT、TT、PT、t-PA和PAI的影响 |
| 2.2.3 地鳖虫纤溶活性蛋白对角叉菜胶致小鼠尾部血栓形成的影响 |
| 2.2.4 数据处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 地鳖虫纤溶活性蛋白对小鼠KPTT、TT和PT的影响 |
| 2.3.2 地鳖虫纤溶活性蛋白对小鼠t-PA、PAI活性的影响 |
| 2.3.3 地鳖虫纤溶活性蛋白对角叉菜胶所致小鼠尾部血栓形成的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 地鳖虫纤溶活性蛋白抗血管生成及抗肿瘤的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物、细胞、瘤株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 地鳖虫纤溶活性蛋白的提取与纤溶活性测定 |
| 3.2.2 细胞培养 |
| 3.2.3 EFP对人微血管内皮细胞增殖的影响 |
| 3.2.4 EFP对人微血管内皮细胞凋亡的作用 |
| 3.2.5 流式细胞仪分析EFP对MVEC细胞周期的影响 |
| 3.2.6 EFP对鸡胚尿囊膜(CAM)血管生成的影响 |
| 3.2.7 地鳖虫纤溶活性蛋白对S180和H22荷瘤小鼠的体内抗肿瘤作用 |
| 3.2.8 数据处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 EFP对人微血管内皮细胞增殖的影响 |
| 3.3.2 EFP对人微血管内皮细胞凋亡的作用 |
| 3.3.3 流式细胞仪分析EFP对人微血管内皮细胞周期的影响 |
| 3.3.4 EFP对鸡胚尿囊膜(CAM)血管生成的影响 |
| 3.3.5 地鳖虫纤溶活性蛋白对S180和H22荷瘤小鼠的体内抗肿瘤作用 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 抗肿瘤血管生成的研究 |
| 3.4.2 抗肿瘤的研究 |
| 第4章 地鳖虫纤溶活性蛋白基因的cDNA克隆 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌种和载体 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 引物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 地鳖虫总RNA的提取 |
| 4.2.2 地鳖虫纤溶活性蛋白基因cDNA5’端序列的合成 |
| 4.2.3 3’RACE 法合成地鳖虫纤溶活性蛋白基因 cDNA 序列的3’端 |
| 4.2.4 地鳖虫纤溶活性蛋白基因cDNA的克隆 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 总RNA的提取 |
| 4.3.2 PCR扩增合成地鳖虫纤溶活性蛋白基因cDNA5’端序列 |
| 4.3.3 地鳖虫纤溶活性蛋白基因cDNA3’末端的合成 |
| 4.3.4 地鳖虫纤溶活性蛋白基因cDNA序列的获得及PCR扩增与序列测序 |
| 4.3.5 地鳖虫纤溶活性蛋白基因cDNA的序列分析及氨基酸序列同源性分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 地鳖虫纤溶活性蛋白的大肠杆菌表达 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株和质粒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 培养基和溶液 |
| 5.1.4 主要仪器和设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 引物的设计与合成 |
| 5.2.2 PCR扩增 |
| 5.2.3 PCR产物的胶回收与纯化 |
| 5.2.4 目的基因克隆至pUCm-T载体 |
| 5.2.5 酶切鉴定 |
| 5.2.6 DNA序列测序 |
| 5.2.7 表达载体pET28a和pUCm-T-EFP的制备和酶切 |
| 5.2.8 连接反应 |
| 5.2.9 转化大肠杆菌DH5a |
| 5.2.10 重组转化子的鉴定 |
| 5.2.11 重组质粒的测序 |
| 5.2.12 重组质粒转化表达菌株E.coli Rossetta(DE3)plysS |
| 5.2.13 工程菌的诱导表达 |
| 5.2.14 表达蛋白的可溶性分析 |
| 5.2.15 Western-blot分析 |
| 5.2.16 工程菌的优化表达 |
| 5.2.17 重组表达蛋白抗血清的制备 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 地鳖虫纤溶活性蛋白基因的PCR扩增及pUCm-T-EFP载体的构建和酶切鉴定 |
| 5.3.2 pET28a-EFP的构建、酶切鉴定和测序 |
| 5.3.3 工程菌的诱导表达 |
| 5.3.4 表达蛋白的可溶性分析 |
| 5.3.5 表达蛋白的Western-blot分析结果 |
| 5.3.6 工程菌的优化表达 |
| 5.3.7 重组表达蛋白抗血清的制备 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 地鳖虫纤溶活性蛋白的毕赤酵母表达 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 菌株和质粒 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 培养基和溶液 |
| 6.1.4 主要仪器和设备 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 引物的设计与合成 |
| 6.2.2 PCR扩增 |
| 6.2.3 PCR产物的胶回收及纯化 |
| 6.2.4 回收产物的双酶切和纯化 |
| 6.2.5 质粒载体pPICZa-A的制备和酶切 |
| 6.2.6 连接反应 |
| 6.2.7 转化大肠杆菌DH5a |
| 6.2.8 重组转化子的鉴定 |
| 6.2.9 重组质粒的测序 |
| 6.2.10 重组表达质粒导入酵母和阳性转化子的筛选 |
| 6.2.11 甲醇利用型的鉴定 |
| 6.2.12 转化菌株的诱导表达 |
| 6.2.13 表达蛋白的检测 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 重组质粒pPICZaA-EFP的构建和鉴定 |
| 6.3.2 pPICZaA-EFP转化毕赤酵母GS115和阳性克隆的鉴定 |
| 6.3.3 阳性转化子甲醇利用型的鉴定 |
| 6.3.4 重组酵母的诱导表达及SDS-PAGE电泳分析 |
| 6.3.5 重组表达蛋白的活性测定 |
| 6.3.6 Western blot分析诱导表达蛋白 |
| 6.4 讨论 |
| 本文主要结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历和论文情况 |
| 致谢 |
（7）蜈蚣纤溶酶的提取纯化及其抗血栓研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 1.前言 |
| 1.1 血栓栓塞性疾病的现状 |
| 1.2 血栓形成的机理 |
| 1.2.1 机体的凝血系统和抗凝血系统 |
| 1.2.2 血栓的形成 |
| 1.3 抗血栓药物 |
| 1.3.1 纤溶酶原激活剂 |
| 1.3.1.1 纤溶系统的组成 |
| 1.3.1.2 生理来源的抗血栓药物 |
| 1.3.1.3 动物性来源的抗血栓药物 |
| 1.4 蜈蚣抗血栓的研究进展 |
| 1.5 本课题研究内容及意义 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 2.主要仪器与试剂 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 实验动物 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 蜈蚣纤溶酶的分离纯化 |
| 3.1.1 纤溶活性测定 |
| 3.1.2 蛋白质含量测定 |
| 3.1.3 蜈蚣纤溶酶分离纯化 |
| 3.1.4 样品纯度鉴定与分子量检测 |
| 3.2 安全性实验 |
| 3.2.1 急性毒性实验 |
| 3.2.2 溶血性实验 |
| 3.2.3 出血性实验 |
| 3.3 抗血栓活性 |
| 3.3.1 体外溶栓 |
| 3.3.2 体内溶栓 |
| 3.3.2.1 对静脉血栓的影响 |
| 3.3.2.2 对动脉血栓的影响 |
| 3.4 蜈蚣纤溶酶抗血栓机理的初步探讨 |
| 3.4.1 对凝血功能的影响 |
| 3.4.2 蜈蚣纤溶酶对人微血管内皮细胞(MVEC)的影响 |
| 3.4.2.1 细胞培养体系 |
| 3.4.2.2 细胞鉴定:VWF鉴定人微血管内皮细胞 |
| 3.4.2.3 细胞传代 |
| 3.4.2.4 MTT法检测人微血管内皮细胞对蜈蚣纤溶酶的敏感性 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 蜈蚣纤溶酶的分离纯化 |
| 4.1.1 纤溶活性测定 |
| 4.1.2 bradford标准曲线 |
| 4.1.3 DEAE纤维素柱层析和SephadexG150、G75柱层析 |
| 4.1.4 PAGE检测纯度和分子量测定 |
| 4.1.4.1 PAGE检测纯度 |
| 4.1.4.2 SDS-PAGE测分子量 |
| 4.2 蜈蚣纤溶酶的安全性实验 |
| 4.2.1 急性毒性实验 |
| 4.2.2 出血性实验 |
| 4.2.3 溶血性实验 |
| 4.3 蜈蚣纤溶酶的溶栓效果 |
| 4.3.1 体外溶栓实验 |
| 4.3.2 体内溶栓 |
| 4.3.2.1 对静脉血栓的影响 |
| 4.3.2.2 对动脉血栓的影响 |
| 4.4 蜈蚣纤溶酶抗血栓机制得初步探讨 |
| 4.4.1 蜈蚣纤溶酶对凝血功能的影响 |
| 4.4.2 蜈蚣纤溶酶对人源性微血管内皮细胞的生长影响 |
| 4.4.2.1 VWF鉴定 |
| 4.4.2.2 MTT法检测人微血管内皮细胞对蜈蚣纤溶酶的敏感性 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附图 |
（8）沙蚕纤溶蛋白酶的生化与分子生物学研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 第一篇 绪论 |
| 第一章 研究背景 |
| 引言 |
| 第一节 血栓的形成及溶解机制 |
| 1 血栓形成机制 |
| 2 溶解血栓机制 |
| 第二节 生物溶栓剂的概况及前景展望 |
| 1. 生物溶栓剂的概况 |
| 1.1 天然生物溶栓剂的来源 |
| 1.2 溶栓剂的分类和作用途径 |
| 2. 新型溶栓剂的开发及发展趋势 |
| 2.1 现有溶栓剂的主要缺陷 |
| 2.2 新型溶栓剂的来源、开发途径及发展趋势 |
| 第三节 海洋生物抗血栓活性成分的研究概况 |
| 1. 海洋生物抗血栓活性成分研究热点 |
| 1.1 经典回顾 |
| 1.2 今日热点 |
| 1.3 未来展望 |
| 2. 国内研究现状 |
| 第四节 海洋环节动物沙蚕（Nereis virens）的研究概况 |
| 1. 生物学特性方面的研究 |
| 2. 生物活性成分的研究情况及其潜在开发前景 |
| 第二章 立题依据及研究目标 |
| 1. 选题依据和背景情况 |
| 2. 研究目标和意义 |
| 第二篇 研究工作 |
| 第一章 中国渤海湾沙蚕（Nereis virens）纤溶酶的探寻及分离纯化研究 |
| 摘要 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二章 沙蚕（Nereis virens）纤溶酶分子特征的研究 |
| 摘要 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第三章 沙蚕（Nereis virens）纤溶酶的酶学特性及溶栓机制研究 |
| 摘要 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第四章 沙蚕（Nereis virens）虫体cDNA 表达型文库构建及其鉴定 |
| 摘要 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（9）纤溶酶产生菌的筛选、鉴定及其液体发酵条件的研究（论文提纲范文）
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
（10）土鳖虫纤溶成分的提取和基因克隆的研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 1.前言 |
| 1.1 血栓栓塞性疾病的现状 |
| 1.2 血栓的形成 |
| 1.2.1 机体的凝血系统和抗凝血系统 |
| 1.2.2 血栓的形成 |
| 1.3 抗血栓药物 |
| 1.3.1 纤溶酶原激活剂 |
| 1.3.1.1 纤溶系统的组成 |
| 1.3.1.2 生理来源的抗血栓药物 |
| 1.3.1.3 动物性来源的抗血栓药物 |
| 1.4 土鳖虫抗血栓的实验研究进展 |
| 1.5 本课题研究内容及意义 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 2.主要仪器与试剂 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要试剂 |
| 3.实验材料 |
| 4.实验方法 |
| 4.1 土鳖纤溶酶原激酶成分的分离纯化 |
| 4.1.1 纤溶活性测定 |
| 4.1.2 土鳖纤溶酶原激活物的分离纯化 |
| 4.1.3 样品纯度鉴定和分子量测定 |
| 4.1.4 蛋白质含量测定 |
| 4.1.5 土鳖激酶性质的研究 |
| 4.1.6 含糖量的测定 |
| 4.2 土鳖纤溶成分的分离纯化和活性测定(制备电泳法) |
| 4.2.1 土鳖纤溶成分(EFF)的分离纯化 |
| 4.2.2 聚丙烯酰胺垂直板电泳 |
| 4.2.3 样品纯度鉴定和分子量测定 |
| 4.2.4 蛋白质含量的测定 |
| 4.3 土鳖纤溶酶基因的cDNA的克隆 |
| 4.3.1 土鳖总RNA提取 |
| 4.3.2 简并引物的设计与合成 |
| 4.3.3 RT-PCR合成土鳖纤溶酶cDNA |
| 4.3.4 目的条带回收 |
| 4.3.5 土鳖纤溶酶cDNA的克隆和测序 |
| 4.3.6 土鳖纤溶酶DNA的比对分析 |
| 4.3.7 土鳖纤溶酶成熟肽N段基因的克隆 |
| 4.3.8 土鳖纤溶酶基因3’端序列的获取 |
| 5 结果与分析 |
| 5.1 土鳖纤溶酶原激酶成分的分离纯化 |
| 5.1.1 尿激酶标准曲线 |
| 5.1.2 蛋白曲线的制作 |
| 5.1.3 土鳖硫酸铵沉淀段的选取 |
| 5.1.4 土鳖激酶的分离纯化 |
| 5.1.5 土鳖激酶的性质研究 |
| 5.2 土鳖纤溶成分的分离纯化和活性测定(制备电泳法) |
| 5.2.1 土鳖纤溶成分的分离纯化结果 |
| 5.3 土鳖虫纤溶酶基因的cDNA克隆 |
| 5.3.1 土鳖虫总RNA纯度和完整性检测 |
| 5.3.2 RT-PCR结果 |
| 5.3.3 克隆测序结果 |
| 5.3.4 Blastp序列分析 |
| 5.3.5 土鳖纤溶酶成熟肽N段基因的克隆结果 |
| 5.3.6 土鳖纤溶酶基因3’RACE结果 |
| 6 讨论 |
| 6.1 生物纤溶物质的探讨 |
| 6.2 土鳖纤溶组分的分离纯化分析 |
| 6.3 土鳖激酶的性质研究 |
| 6.4 制备电泳法分离纯化土鳖纤溶酶 |
| 6.5 土鳖纤溶酶基因引物的设计 |
| 6.6 克隆测序结果分析 |
| 6.6.1 ET-Ⅰ结果分析 |
| 6.6.2 ET-Ⅱ结果分析 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、华广虻肠道溶纤活性蛋白的纯化和性质(英文)（论文参考文献）
- [1]重组人抗PAI抑制作用的新型纤溶酶原激活剂突变体的表达与活性研究[D]. 李飞. 河北北方学院, 2013(05)
- [2]斑蝥纤溶活性蛋白的提取纯化及其作用性质研究[D]. 汪威. 广东工业大学, 2011(12)
- [3]短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂对动物凝血、循环、呼吸和中枢神经系统功能的影响[D]. 姚天赐. 福建医科大学, 2010(02)
- [4]单环刺螠纤溶酶分离纯化、免疫原性及其基因克隆的初步研究[D]. 朱琦. 中国海洋大学, 2009(11)
- [5]蛹虫草纤溶酶的分离纯化、酶学性质及溶栓抗栓作用研究[D]. 崔莉. 南京农业大学, 2008(08)
- [6]地鳖虫纤溶活性蛋白抗血栓、抗肿瘤及其基因克隆与表达的研究[D]. 李兴暖. 汕头大学, 2007(09)
- [7]蜈蚣纤溶酶的提取纯化及其抗血栓研究[D]. 陈少鹏. 汕头大学, 2007(S2)
- [8]沙蚕纤溶蛋白酶的生化与分子生物学研究[D]. 张云龙. 吉林大学, 2007(03)
- [9]纤溶酶产生菌的筛选、鉴定及其液体发酵条件的研究[D]. 隋玉杰. 吉林大学, 2006(10)
- [10]土鳖虫纤溶成分的提取和基因克隆的研究[D]. 李张伟. 汕头大学, 2006(12)