论文摘要
氮素是植物生长发育所需的最主要的大量元素之一,氮肥的施用是维持作物高产稳产的关键。农业上施加大量的氮肥以提高作物的产量,但由于作物对氮肥的吸收利用率低,使得未被植物吸收利用的氮素流失到环境中,造成了严重的面源污染。因此,必须加强对植物吸收利用氮素的分子规律和调控网络的研究,以提高作物的氮素利用率、推动农业的可持续发展。但由于植物体内调控氮素吸收利用的机制十分精细复杂,使得对氮素调控的研究进展十分缓慢。本研究利用RNA-seq技术检测到强烈响应NO3-的lncRNA T5120,同时还利用正向遗传学的方法克隆出1个NO3-负调控基因NSIG,并对它们在NO3-信号及代谢调控方面的功能进行了深入、系统的分析。一、LncRNA T5120调控NO3-信号及同化利用长链非编码RNA在各个生物学进程中都发挥重要的调控作用,但目前还未有其在硝态氮调控方面的报道。我们利用RNA-seq测序技术检测受NO3-处理影响的lncRNAs,结合qPCR技术的验证结果,鉴定出六个受NO3-强烈诱导的lncRNAs,其中T5120的NO3-诱导量最高;进一步的研究发现T5120的表达在硝态氮还原酶（NR-null）突变体中仍受NO3-的诱导,说明T5120的表达可以直接受NO3-信号的诱导,而不是NO3-的还原产物。qPCR检测发现T5120过表达系中NO3-响应基因的NO3-诱导量明显升高,表明T5120能调控植物对NO3-的响应;生理检测发现T5120过表达系的NO3-含量显著降低;进一步的研究结果显示,过表达系的硝态氮还原酶（NR）活性和氨基酸含量明显升高,而对NO3-的吸收不变,说明过表达系中NO3-含量降低是由于同化作用增强造成的。分子水平的检测结果表明,T5120过表达系中部分NO3-同化基因的表达量显著增加。上述结果说明T5120能促进植物对NO3-的初级响应和同化利用。为进一步了解T5120的作用机制,我们分析了T5120的启动子序列,发现其启动子区存在一个NO3-响应（NRE-like）元件;随后利用Y1H和ChIP-qPCR技术进行鉴定,结果显示NLP7可以结合T5120的启动子,LUC/REN双荧光素酶报告系统分析表明NLP7可以激活T5120的转录,进一步的研究发现NLP7可以调控T5120的表达和NO3-诱导量,这些结果说明NLP7可以直接结合T5120并调控其表达。将T5120在nlp7-4突变体中过表达,发现T5120/nlp7-4株系根部的荧光明显强于nlp7-4突变体;T5120/nlp7-4株系的NR活性和NO3-同化基因的表达明显升高,表明T5120能部分恢复nlp7突变体在NO3-信号及同化方面的缺陷。上述结果说明T5120作用于NLP7的下游调控NO3-信号。通过对T5120过表达系在低和高两种NO3-浓度条件下的表型观察及统计,发现T5120能促进植物的生长。二、NSIG调控NO3-信号及代谢正向遗传学是克隆新基因的有效途径,本研究还利用NO3-调控基因筛选系统克隆出一个新基因NSIG。在无NO3-的培养条件下,含NO3-响应启动子（NRP-YFP）的野生型幼苗根部不发荧光,通过筛选突变群体,筛选出一个根部发强荧光的NO3-负调控突变体E7;通过图位克隆和全基因组测序确定突变基因为一个新的NO3-调控基因,将其命名为NSIG（NITRATE SIGNALING INHIBITED GENE）,原生质体瞬时转化实验表明该蛋白定位于细胞核中。RNA-seq分析显示E7突变体中多个NO3-响应基因的表达显著高于野生型,说明NSIG负调控NO3-信号;进一步的研究发现,有NO3-存在下,NSIG依然负调控NO3-信号,说明NSIG对NO3-信号的负调控作用不依赖于NO3-。为研究NSIG在NO3-代谢方面的功能,我们检测了E7突变体中的NO3-含量,发现突变体中NO3-含量降低;深入的研究发现E7突变体对NO3-的吸收降低,而NR活性和氨基酸含量升高,分子水平的检测发现E7突变体中转运基因NRT1.1的表达下降,而部分NO3-同化基因的表达升高。这些结果说明NSIG调控了植物对NO3-的吸收和同化。为研究NSIG与NRT1.1的作用关系,我们分别检测了单基因突变体中另一基因的表达,发现E7突变体中NRT1.1的表达显著降低,而nrt1.1突变体中NSIG的表达没有变化;接下来我们构建了E7 chl1-13的双突变体,并对其荧光进行了观察,发现NSIG与NRT1.1在不同通路上调控NO3-的信号。上述结果表明NSIG可以调控NRT1.1的转运功能,但不影响其信号功能。通过对NSIG与NLP7作用关系的研究,发现NSIG与NLP7在NO3-信号调控途径中也是相互独立的。本研究克隆了两个新的NO3-调控基因T5120和NSIG、鉴定了它们在NO3-调控方面的功能、阐明了它们的作用机制,为解析植物体内的NO3-调控机制和网络奠定了基础、为提高作物的氮素利用率提供了理论依据和指导。
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符号说明中文摘要Abstract1 前言 1.1 研究氮素调控机制的意义 1.1.1 氮素对植物生长发育的影响 1.1.2 氮肥造成的环境危害3-的分子机理'> 1.2 植物吸收利用NO3-的分子机理3-的分子机制'> 1.2.1 植物转运NO3-的分子机制 1.2.1.1 NPF转运蛋白家族 1.2.1.2 NRT2 转运蛋白家族 1.2.1.3 CLC转运蛋白家族 1.2.1.4 SLAC/SLAH转运蛋白家族3-的同化'> 1.2.2 植物体内NO3-的同化3-信号调控的研究'> 1.3 NO3-信号调控的研究3-感应子'> 1.3.1 NO3-感应子 1.3.2 转录因子 1.3.3 剪切因子 1.3.4 mRNA和多肽 1.4 植物中lnc RNA的功能 1.4.1 LncRNA的发现 1.4.2 LncRNA的功能3-调控基因突变体筛选系统'> 1.5 拟南芥NO3-调控基因突变体筛选系统 1.6 本研究的意义2 材料与方法 2.1 试验材料 2.1.1 植物材料 2.1.2 菌株与质粒 2.1.3 酶与试剂 2.1.3.1 酶和抗体 2.1.3.2 试剂盒 2.1.3.3 溶液、缓冲液及培养基配方 2.1.4 仪器与设备 2.1.5 引物 2.2 试验方法 2.2.1 拟南芥的生长及植物材料的培养 2.2.1.1 拟南芥的生长 2.2.1.2 培养基配制 2.2.1.3 种子消毒处理 2.2.1.4 拟南芥的竖直培养 2.2.1.5 拟南芥的六孔板液体培养 2.2.1.6 拟南芥的Magenta Box培养 2.2.1.7 拟南芥的杂交 2.2.2 转基因株系表达载体的构建 2.2.2.1 植物总RNA的提取 2.2.2.2 反转录 2.2.2.3 Phusion PCR扩增 2.2.2.4 PCR产物回收 2.2.2.5 限制性内切酶酶切 2.2.2.6 产物回收 2.2.2.7 连接 2.2.2.8 大肠杆菌感受态的制备 2.2.2.9 转化大肠杆菌Mach1 感受态 2.2.2.10 质粒提取 2.2.3 农杆菌介导的拟南芥的遗传转化 2.2.3.1 根癌农杆菌GV3101 感受态细胞的制备 2.2.3.2 表达载体转化农杆菌 2.2.3.3 拟南芥的转化3-调控基因突变体的筛选'> 2.2.4 NO3-调控基因突变体的筛选 2.2.4.1 EMS诱变 2.2.4.2 荧光筛选 2.2.5 图位克隆 2.2.5.1 图位克隆群体的构建 2.2.5.2 基因组DNA的提取 2.2.5.3 初步定位 2.2.5.4 精细定位 2.2.6 qPCR技术 2.2.7 硝态氮含量测定 2.2.8 NR活性 2.2.8.1 制作标准曲线 2.2.8.2 样品中NR活性的测定 2.2.9 氨基酸含量测定 2.2.9.1 制作标准曲线 2.2.9.2 样品中氨基酸含量的测定 2.2.10 酵母单杂交（Y1H） 2.2.10.1 酵母感受态的制备 2.2.10.2 酵母转化 2.2.11 染色质免疫沉淀技术（ChIP） 2.2.11.1 染色质与蛋白交联（室温） 2.2.11.2 染色体准备（4℃） 2.2.11.3 免疫共沉淀 2.2.11.4 Elution和解交联 2.2.11.5 提取DNA 2.2.12 双荧光素酶试验 2.2.12.1 拟南芥原生质体的制备 2.2.12.2 原生质体转化 2.2.12.3 双荧光素酶活性测定 2.2.13 新的lnc RNAs的筛选 2.2.14 统计学分析3 结果与分析3-信号响应及同化利用'> 3.1 LncRNA T5120 调控NO3-信号响应及同化利用3-响应lncRNAs的鉴定'> 3.1.1 拟南芥NO3-响应lncRNAs的鉴定 3.1.1.1 RNA-seq质量评估 3.1.1.2 拟南芥根中lnc RNAs的筛选3-的lnc RNAs的筛选'> 3.1.1.3 拟南芥根中响应NO3-的lnc RNAs的筛选 3.1.2 LncRNA T5120 的组织表达 3.1.3 T5120 对氮素响应的分析3-处理不同时间下T5120 的表达'> 3.1.3.1 NO3-处理不同时间下T5120 的表达3-浓度处理下T5120 的表达'> 3.1.3.2 不同NO3-浓度处理下T5120 的表达3-诱导'> 3.1.3.3 T5120 的表达可直接被NO3-诱导3-信号的调控'> 3.1.4 T5120对NO3-信号的调控3-代谢的调控'> 3.1.5 T5120对NO3-代谢的调控3-含量'> 3.1.5.1 T5120 过表达系的NO3-含量3-吸收'> 3.1.5.2 T5120 过表达系的NO3-吸收3-同化'> 3.1.5.3 T5120 过表达系的NO3-同化 3.1.5.4 T5120 过表达系中同化基因的表达水平 3.1.6 LncRNA T5120 与转录因子NLP7 之间的调控关系 3.1.6.1 NLP7 可以结合并激活T5120 的启动子 3.1.6.2 NLP7 调控T5120 的表达3-信号'> 3.1.6.3 T5120 作用于NLP7 下游调控NO3-信号 3.1.7 LncRNA T5120 调控植物的生长3-信号抑制基因NSIG的筛选及功能鉴定'> 3.2 拟南芥NO3-信号抑制基因NSIG的筛选及功能鉴定 3.2.1 E7 突变体的分离及NSIG基因的图位克隆 3.2.2 E7 突变体与WT的转录组分析 3.2.2.1 测序数据质量评估 3.2.2.2 E7 与野生型差异基因统计及GO分析3-响应基因的表达'> 3.2.3 NSIG负调控NO3-响应基因的表达3-存在条件下NSIG负调控NO3-信号'> 3.2.4 在NO3-存在条件下NSIG负调控NO3-信号 3.2.5 NSIG基因的组织表达分析 3.2.6 NSIG基因对不同N素的响应3-代谢'> 3.2.7 NSIG基因调控NO3-代谢3-含量分析'> 3.2.7.1 E7 突变体的NO3-含量分析3-吸收'> 3.2.7.2 E7 突变体的NO3-吸收 3.2.7.3 E7 突变体同化能力分析 3.2.8 E7 突变体生长发育表型分析3-感应子NRT1.1 间的作用关系'> 3.2.9 NSIG与 NO3-感应子NRT1.1 间的作用关系 3.2.9.1 NSIG与 NRT1.1 在基因表达方面的调控关系3-信号方面的调控关系'> 3.2.9.2 NSIG与 NRT1.1在NO3-信号方面的调控关系 3.2.10 NSIG与转录因子NLP7 间的作用关系 3.2.10.1 NSIG与 NLP7 在基因表达方面的调控关系3-信号方面的调控关系'> 3.2.10.2 NSIG与 NLP7在NO3-信号方面的调控关系4 讨论3-信号和代谢的调控'> 4.1 LncRNA参与NO3-信号和代谢的调控3-信号'> 4.2 NSIG基因负调控NO3-信号 4.3 T5120和NSIG的作用关系5 结论参考文献致谢攻读学位期间发表的论文及成果
文章来源
类型: 博士论文
作者: 刘飞
导师: 王勇
关键词: 信号,代谢,拟南芥
来源: 山东农业大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学,生物学
单位: 山东农业大学
基金: 国家基金委(31670247),山东省双一流学科(SYL2017YSTD01)
分类号: Q943.2
DOI: 10.27277/d.cnki.gsdnu.2019.000029
总页数: 107
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标签：信号论文; 代谢论文; 拟南芥论文;
拟南芥硝态氮调控基因T5120和NSIG的克隆与功能鉴定
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