导读:本文包含了定向进化论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:阿诺德,巴马,选择性,脱氨酶,蛋白质,噬菌体,环己酮。
定向进化论文文献综述
曲戈,朱彤,蒋迎迎,吴边,孙周通[1]（2019）在《蛋白质工程：从定向进化到计算设计》一文中研究指出定向进化通过建立突变体文库与高通量筛选方法,快速提升蛋白的特定性质,是目前蛋白质工程最为常用的蛋白质设计改造策略。近十年随着计算机运算能力大幅提升以及先进算法不断涌现,计算机辅助蛋白质设计改造得到了极大的重视和发展,成为蛋白质工程新开辟的重要方向。以结构模拟与能量计算为基础的蛋白质计算设计不但能改造酶的底物特异性与热稳定性,还可从头设计具有特定功能的人工酶。近年来机器学习等人工智能技术也被应用于计算机辅助蛋白质设计改造,并取得瞩目的成绩。文中介绍了蛋白质工程的发展历程,重点评述当前计算机辅助蛋白质设计改造方面的进展与应用,并展望其未来发展方向。(本文来源于《生物工程学报》期刊2019年10期）
欧晨辉,沈辰,赵万里,郭蕊琳,刘吉华[2]（2019）在《定向进化CYP105D1酶提高l-THP转化活性研究》一文中研究指出细胞色素CYP105D1是Streptomyces griseus ATCC 13273中生物转化左旋四氢巴马汀合成左旋紫堇达明的关键酶,课题组前期成功在原核体系中克隆了CYP105D1,实现了利用工程菌株生物转化合成制备左旋紫堇达明。但是,CYP105D1存在着转化活性低、酶稳定性差等缺陷,因此希望通过定向进化手段改造CYP105D1,提高左旋紫堇达明的产量。研究首先通过同源模建与分子对接的方法,预测了CYP105D1与底物相互作用的关键位点,然后选取了其中8个位点进行定点饱和突变。突变文库筛选结果与全细胞转化结果显示,突变体R98AR99A的转化率提升至原先的1. 48倍。研究通过对CYP105D1酶进行定向进化,成功提高了左旋紫堇达明的生物转化合成效率,并进一步揭示了CYP105D1与底物左旋四氢巴马汀的相互作用机制。(本文来源于《药物生物技术》期刊2019年04期）
马春玲,吴冉冉,黄睿,姜文侠,游淳[3]（2019）在《通过定向进化改造的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶用于低pH酶燃料电池》一文中研究指出大多数酶燃料电池(EFCs)是为在生理条件下工作而设计的,不能承受低pH值,因为酶的不稳定性。而提高EFCs的耐酸能力代表了增强其实际应用的稳健性和多样性。在本研究中,我们成功构建了一个由葡萄糖6-磷酸脱氢酶,6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶,心肌黄酶叁酶催化的EFC,此EFC可以在阳极pH为5.4的条(本文来源于《第十二届中国酶工程学术研讨会论文摘要集》期刊2019-08-08）
刘海英[4]（2019）在《快速定向进化技术几天即可“造出”新分子》一文中研究指出科技日报华盛顿7月6日电 （记者刘海英）美国北卡罗莱纳大学医学院研究人员近日在《细胞》杂志线上版刊发研究报告称，他们开发出一种可用于哺乳动物细胞的，可在几天内产生具有特定性质的新分子，其效率远高于目前使用的定向进化方法。定向进化是美国科学家弗朗(本文来源于《科技日报》期刊2019-07-08）
王越[5]（2019）在《定向进化L—氨基酸脱氨酶转化合成α—酮戊二酸》一文中研究指出α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)是一种二元短链羧酸,也是连接碳-氮代谢的关键节点,是微生物体内多种化合物的重要前体,广泛应用于食品、医药、精细化工等领域。目前,α-KG的生产制备方法主要有化学合成法、微生物发酵法和酶催化转化法。其中,化学合成法使用大量有害试剂,严重污染环境且限制其在食品等行业的应用。微生物发酵法存在副产物过多,发酵周期长等弊端。酶催化转化法具有催化反应条件温和、转化率高、反应副产物少,产物易分离等优点,适合α-KG的生产。本研究利用异源表达来源于Proteus mirabilis的L-氨基酸脱氨酶基因(pm1)的E.coli BL21(DE3)重组菌株催化底物L-谷氨酸钠合成产物α-KG,并从分子改造、表达载体优化、摇瓶和罐上发酵及全细胞转化条件优化等方面提高L-氨基酸脱氨酶合成α-KG的效率。论文主要内容如下:(1)将异源表达来源于Proteus mirabilis的L-氨基酸脱氨酶基因pm1的重组大肠杆菌E.coli BL21(pET20b-pm1)进行摇瓶上的发酵和全细胞转化的条件优化。确定最佳发酵条件为:种子培养时间10 h,诱导温度20℃,诱导时间12 h,诱导剂IPTG浓度0.06 mM,诱导时刻为菌液OD_(600)值为3.0时;最佳全细胞转化条件为:转化温度30℃,pH 6.0,细胞浓度为20 g·L~(-1),最终α-KG产量达到61.80 g·L~(-1),底物摩尔转化率为39.6%。(2)通过在线网站SWISS MODEL获得来自Proteus myxofaciens的L-氨基酸脱氨酶晶体模型,与PM1同源性达93.74%。同源建模及分子对接后,分析该模型的结构,对其关键位点周围氨基酸进行饱和突变。通过多轮筛选后,获得六株产量高于对照的突变体,分别为G206R、P272F、V276C、V283I、E340S、E340G,产量分别较对照提高12.5%、18.2%、14.8%、4.5%、27.6%、17.0%。随后进行多轮复合突变,突变体G206R/P272F/V276C/V283I/E340S产量最高,达100.96 g·L~(-1),底物摩尔转化率为64.7%。(3)验证分子改造后的最适转化条件。通过在摇瓶上进行最优复合突变体G206R/P272F/V276C/V283I/E340S的全细胞转化过程中的温度、pH和细胞量的优化。确定最适温度为30℃,最适pH为6.0,最适细胞量20 g·L~(-1)。(4)对重组大肠菌株进行表达载体拷贝数优化。构建不同拷贝数表达载体pRSFDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1的重组质粒,发酵及全细胞转化对比产物α-KG生成量。结果显示含有pACYCDuet-1表达载体的重组菌株产量最高,为106.37 g·L~(-1),底物摩尔转化率为68.1%,且培养结束时菌浓为对照的2.25倍,更有利于下一步的全细胞转化。(5)3 L发酵罐上进行发酵和全细胞转化条件及底物添加方式优化。确定发酵过程中最佳搅拌转速为400 rpm,最佳通气量为3.0 sL·min~(-1)。全细胞转化过程中最佳搅拌转速为600 rpm,最佳通气量为3 sL·min~(-1)。底物分叁次加入,总浓度150 g·L~(-1),最高产量达93.46 g·L~(-1),底物摩尔转化率为79.8%。(本文来源于《江南大学》期刊2019-06-01）
潘梦妍,徐显皓,刘延峰,李江华,吕雪芹[6]（2019）在《甲壳素酶Chisb的定向进化及生物转化合成几丁寡糖》一文中研究指出甲壳素酶具有广泛的工业应用前景,如可将虾壳、蟹壳和其他甲壳废物降解成以几丁寡糖为主的高附加值产品,但野生型甲壳素酶催化效率低,大大限制了几丁寡糖的生产。笔者在前期研究中表达了一个具有较高效催化效率的甲壳素酶Chisb,并对其酶学性质进行了初步研究。为进一步提高甲壳素酶Chisb的催化效率,以R13NprB-C-SP-H为亲本,采用易错PCR(Error-pronePCR)技术构建随机突变体文库,对甲壳素酶Chisb进行定向进化。经过96孔板初筛和摇瓶复筛,获得了两个催化效率进一步提高的突变体C43D和E336R。对突变体的酶学性质进行分析, C43D和E336R的最适催化温度为55℃, C43D的最适pH为5.0,E336R的最适pH为9.0;其催化效率相比对照分别提高了1.35倍和1.57倍;而E336R和C43D催化产几丁寡糖的含量分别为2.53 g/L和2.06 g/L,相比对照(0.89 g/L)分别提高了2.84倍和2.31倍;底物转化率分别为84.3%和68.7%,相比对照(29.7%)分别提高了54.6%和39%。研究表明,通过易错PCR引入随机突变的方法能够有效提高甲壳素酶Chisb的催化效率。上述研究获得的催化效率提高的正向突变体及其酶学性质分析对生物转化合成几丁寡糖具有重要研究意义和应用价值。(本文来源于《生物工程学报》期刊2019年09期）
徐鉴[7]（2019）在《定向进化调控酶的选择性及催化多功能性》一文中研究指出近20年来,酶的定向进化逐渐成为生物催化领域的研究热点。相比于天然酶,通过定向进化得到的工程酶具有多种优势,例如更高的活性、更高的热稳定性、更优良的立体选择性等。甚至,定向进化还可以构建实现一些天然酶不能催化的多功能性反应。因此,开展对酶的定向进化的研究,获得性能更加优良的工程酶,同时研究其催化多功能性,扩大酶的使用范围是具有重要科学意义和应用价值的课题。论文针对南极假丝酵母脂肪酶B(CAL-B)的底物酸结合口袋和醇结合口袋展开研究。采用聚焦的小型突变库考察了 CAL-B酸、醇结合口袋中对立体选择性影响最大的位点;并通过迭代突变,得到了具有良好催化活性以及高立体选择性的突变株;成功实现了对CAL-B催化的MBH酯水解拆分、以及2-苯基丙酸对硝基苯酚酯和乙醇的转酯化拆分反应的选择性调控。论文研究了工程化CAL-B对酸醇双手性中心化合物选择性的调控作用。以丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、和苯丙氨酸(F)分别代表体积较小、体积中等、体积较大的氨基酸,采用体积依赖型的聚焦迭代突变库的构建与筛选策略,实现了CAL-B催化双手性化合物在异丙醚溶剂中的选择性拆分,得到了对四个构型产物分别具有良好选择性的四个突变株。并对每一个突变株进行了底物适用性的研究,扩展了其应用范围。同时通过分子动力学模拟,晶体结构分析,分别阐述了四种突变体的不同选择性来源和作用机制。论文建立了光催化脱羧羰基化和R-/S-酮还原酶串联一锅法从酸到R-/S-手性α-苯乙醇的转化方法,对光催化脱羧羰基化反应的条件进行了探究,合成了一系列分别具有R-/S-手性构型的苯乙醇衍生物。基于对光催化脱羧反应的良好认识,进一步研究了一种新型的光脱羧酶(CvFAP)催化立体选择性脱羧反应制备手性α-功能基羧酸的反应;通过理性设计,采用赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)、苯丙氨酸(F)和酪氨酸(Y)对FAP的活性空腔进行大体积氨基酸突变的扫描,增加CvFAP催化活性位点与底物的疏水性作用,从而提高了光能酶的反应活性,成功实现了CvFAP催化α-功能基羧酸的立体选择性拆分;最后,通过分子对接和分子动力学模拟,对其选择性的来源与分子机制进行探讨。论文还研究了环已酮单加氧酶(CHMO)的催化多功能性,通过蛋白质工程改造成功将其转化为酮还原酶。基于对CHMO的反应催化循环的研究和认识,设计了苯甲酰甲酸乙酯作为底物进攻还原态的辅酶(FADH2),成功实现了CHMO催化不对称还原反应;并采用计算指导的定向进化,对CHMO的活性中心周围的氨基酸进行突变筛选,成功提升了其还原反应的活性。(本文来源于《浙江大学》期刊2019-04-01）
王婕[8]（2019）在《环己酮单加氧酶定向进化及其酶促串联反应研究》一文中研究指出定向进化改造酶的结构,是提高酶催化活性和改变选择性(化学选择性、区域选择性和立体选择性)的重要手段,近年来受到广泛关注。来源于不动杆菌NCIMB 9871的环己酮单加氧酶(AcCHMO)是Baeyer-Villiger单加氧酶中研究最为广泛的一种,对于其天然反应具有较高的反应活性和立体选择性。随着研究的深入,AcCHMO被应用于更多底物的氧化反应,甚至能够催化杂原子化合物氧化。手性有机硼酸酯是一个重要的有机反应中间体,可以作为构建手性碳-碳键的前体。本论文通过定向进化手段,对AcCHMO氧化拆分消旋硼酸酯反应的立体选择性进行调控,并将该反应同化学偶联反应进行串联,获得手性产物1-苯乙基取代的苯衍生物。同时调控AcCHMO对不同环大小和取代环酮的活性及立体选择性。主要研究成果总结如下:本论文首先选择AcCHMO底物结合口袋周围的L143、F246、F432、L435等位点,以丙氨酸A、苯丙氨酸F、亮氨酸L叁种侧链大小不同的氨基酸作为代表氨基酸进行定点突变构建高度聚焦的小型突变库,以α-苯乙基硼酸频哪醇酯作为底物,筛选出具有高立体选择性的突变株。分析了重要突变株中氨基酸残基对氧化α-苯乙基硼酸频哪醇酯反应的立体选择性的影响,在最优单位点突变的基础上进行迭代,最终获得了两个具有立体选择性互补的AcCHMO突变株,L143F/F432I/L435A和F246A/L435F/L507A。两个突变株催化氧化拆分反应可以分别得到ee值在75%以上的(R)-和(S)-α-苯乙基硼酸频哪醇酯,以及相反构型的(S)和(R)-α-苯乙醇产物(ee值分别为58%和68%)。论文在得到手性α-苯乙基硼酸频哪醇酯的基础上,将其与取代的碘苯亲电试剂偶联,成功构建了一个酶促化学串联一锅体系,得到手性的1-苯乙基取代的苯衍生物。在分别对Suzuki偶联反应和AcCHMO全细胞体系催化的串联反应进行条件优化后,最终可以以40%的产率和75%的ee值得到手性产物1-苯乙基取代的苯衍生物。此外,论文扩展了工程化AcCHMO催化环酮的底物谱,探讨了从环丁酮到环辛酮等一系列底物的反应结果,对比分析了底物环大小与酶空腔空间结构的关系,筛选出了分别能够提高各环酮底物催化活性的突变株。另外,还在环酮上增加了苯基取代基,对比3-苯基环丁酮、3-苯基环戊酮和4-苯基环己酮的反应结果,发现432位点和435位点对含苯环取代基的环酮底物有明显的立体选择性调控作用。F432L突变株能够分别催化3-苯基环丁酮与4-苯基环己酮氧化得到与WT构型相反的对映异构体,经过进一步突变优化两种底物都实现了大于99%ee值的选择性。对于3-苯基环戊酮,同样以F432L和L435G为调控突变株,实现更加复杂的区域选择性与立体选择性同时调控,得到与WT完全不同的结果。(本文来源于《浙江大学》期刊2019-04-01）
买买提·艾尔肯（Mamatjan,Arkin）[9]（2019）在《通过定向进化和小分子配体修饰调控酶对手性酸的立体选择性》一文中研究指出手性分子是很多药物的重要组成单元。在过去几年中,手性分子的合成受到了越来越多的关注,而化学法合成手性分子需要用到过渡金属催化剂和复杂的手性配体。化学合成不仅反应条件苛刻、所用的手性配体价格昂贵,而且会引起一系列的环境污染问题。因此,在温和条件下通过绿色方法合成手性分子仍然是目前化学研究的热点。本论文主要开展了以下几方面的研究。脂肪酸脱羧酶FAP(WT-FAP)是近年发现的一个光敏酶,可以在光激发下催化长链羧酸的脱羧反应。本论文基于对该酶催化机理的认识,认为利用FAP催化的选择性光脱羧反应可以实现手性酸拆分,这是一种新型的手性酸拆分思路。但是在2-羟基辛酸的动力学拆分模型反应中,我们发现WT-FAP的活性和立体选择性(ees=22%)都很低,无法实现高效拆分。为了解决这个问题,我们在分子动力学模拟的基础上,利用理性设计的方法对FAP进行了蛋白质工程改造,得到了最佳突变株G462Y。该突变株具有很高的转化率和选择性,可以获得ees>99%的R构型羧酸。该突变株也展示了很宽的底物谱,可以获得一系列高ee值的含羟基、氨基官能团的手性羧酸。与α-功能化羧酸的其他酶促合成方法相比,FAP催化的拆分方法不需要NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)循环或原料的预先酯化或酰胺化。南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctic lipase B,CALB)是当前应用最广泛的一种脂肪酶。本论文将CALB的突变和小分子配体对CALB催化空腔的修饰相结合,在对CALB醇口袋和酸口袋的一些关键位点进行突变的基础上,用小分子配体与突变株的半胱氨酸残基结合,改变了酶活性中心附近的空间结构,来调控CALB对手性羧酸酯水解拆分的立体选择性,取得了较好的效果。例如,对于2-苯基丙酸酯水解的模型反应,突变株W104A/T42C的R构型立体选择性从eep=32%提高到了与小分子结合后的eep=50%。而具有反转的S构型选择性的突变株V190C/A281F(eep=14.1%),与小分子配体结合后其S构型立体选择性进一步提升到了eep=80%。在对一系列手性酯产物进行底物扩展研究,发现小分子配体修饰酸口袋突变株V190C/A281F后,会明显提高对较大体积的手性酯的S构型水解立体选择性。最后,论文进一步将“小分子配体修饰脂肪酶调控手性酸立体选择性”方法应用到了枯草杆菌脂肪酶(Bacillus subtilis lipase A,BSLA)中。我们首先将BSLA活性位点附近的一些对立体选择性有影响的氨基酸突变成了半胱氨酸,通过小分子配体修饰,改变酶的结构,达到调控底物的立体选择性的目标。在2-(对甲基)苯基丙酸对硝基苯酚酯水解反应中,BSLA-M78C与小分子配体结合,产物R构型立体选择性从eep=59.3%提升到了 eep=92.9%。在突变株BSLA-M137C上加小分子配体成功实现了对底物选择性的反转。(本文来源于《浙江大学》期刊2019-04-01）
孙宇杰,杨南燕,欧锦新,李飞,黄雪莹[10]（2019）在《应用定向进化获取受体高亲和性hEGF突变株E40V及其特性的评价》一文中研究指出人表皮生长因子(human epidermal growth factor,hEGF)是一种由53个氨基酸构成的单体多肽。该蛋白作为有效的促有丝分裂因子,通过和细胞表面受体EGFR特异性结合来影响细胞的生长,增殖和分化。hEGF基因的失调与某些癌症的生长和发育有关,其蛋白本身对于表皮损伤和溃疡具有良好的修复功能。但是由于其半衰期较短且会造成受体表达下调,因此有必要对其进行改良。通过StEP法对人源和猪源EGF因子进行定向化改造,通过构建噬菌体展示文库和ELISA筛选方式获得一株对于受体具有较高亲和力的突变株E40V,并使用MTT、圆二色谱和细胞划痕对该突变株的促细胞增殖,迁移能力以及温度,pH耐受性进行了探究。结果显示,E40V相较于野生型EGF,其受体亲和性显着提高,对于正常细胞的促增殖能力也有所强化,而对于温度,pH耐受情况则与野生型相差不大。本研究不仅为短肽的定向进化提供了一个范例,也为EGF的实际应用打下基础。(本文来源于《中山大学学报(自然科学版)》期刊2019年02期）
定向进化论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
细胞色素CYP105D1是Streptomyces griseus ATCC 13273中生物转化左旋四氢巴马汀合成左旋紫堇达明的关键酶,课题组前期成功在原核体系中克隆了CYP105D1,实现了利用工程菌株生物转化合成制备左旋紫堇达明。但是,CYP105D1存在着转化活性低、酶稳定性差等缺陷,因此希望通过定向进化手段改造CYP105D1,提高左旋紫堇达明的产量。研究首先通过同源模建与分子对接的方法,预测了CYP105D1与底物相互作用的关键位点,然后选取了其中8个位点进行定点饱和突变。突变文库筛选结果与全细胞转化结果显示,突变体R98AR99A的转化率提升至原先的1. 48倍。研究通过对CYP105D1酶进行定向进化,成功提高了左旋紫堇达明的生物转化合成效率,并进一步揭示了CYP105D1与底物左旋四氢巴马汀的相互作用机制。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
定向进化论文参考文献
[1].曲戈,朱彤,蒋迎迎,吴边,孙周通.蛋白质工程：从定向进化到计算设计[J].生物工程学报.2019
[2].欧晨辉,沈辰,赵万里,郭蕊琳,刘吉华.定向进化CYP105D1酶提高l-THP转化活性研究[J].药物生物技术.2019
[3].马春玲,吴冉冉,黄睿,姜文侠,游淳.通过定向进化改造的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶用于低pH酶燃料电池[C].第十二届中国酶工程学术研讨会论文摘要集.2019
[4].刘海英.快速定向进化技术几天即可“造出”新分子[N].科技日报.2019
[5].王越.定向进化L—氨基酸脱氨酶转化合成α—酮戊二酸[D].江南大学.2019
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[10].孙宇杰,杨南燕,欧锦新,李飞,黄雪莹.应用定向进化获取受体高亲和性hEGF突变株E40V及其特性的评价[J].中山大学学报(自然科学版).2019
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