球毛壳（Chaetomium globosum）产α-葡聚糖苷酶的诱变，优化及酶学特性

论文摘要

α-葡聚糖苷酶,也称为右旋糖酐酶（E.C.3.2.1.11）,是一种能特异性水解α-葡聚糖（右旋糖酐）分子中的α-1,6糖苷键生成一些低聚线性寡糖的水解酶。该酶主要应用于甘蔗制糖、药用葡聚糖的制备及龋齿防治方面,在化工,医药检测等方面也有较大的应用价值。本论文通过比对菌株在蓝色葡聚糖筛选平板上产生的透明圈大小,成功从土样中分离出一株新型α-葡聚糖苷酶生产菌株,观察菌体形态并分析基因序列后,确定为球毛壳（Chaetomium globosum）,并保存在中国微生物菌种保藏中心（CGMCCC No.15867）。用常压室温等离子体（ARTP）和甲基磺酸乙酯（EMS）结合的方法对球毛壳产α-葡聚糖苷酶进行诱变。确定ARTP诱变的最佳条件为10 L·min-1的氦气距离载片2 mm处照射120 s;EMS诱变的最佳条件为0.5 M的EMS终浓度处理4 h。两种方法连用后筛选得到一株α-葡聚糖苷酶阳性突变株,酶活为49.53 U·mL-1,与原始菌株所产酶酶活38.01 U·mL-1相比提高30.31%。诱变菌株传代数次稳定性皆良好。优化确定产酶发酵培养基为:20 g·L-1葡聚糖T20,10 g·L-1酵母提取物,2.0 g·L-1K2HPO4和0.5 g·L-1MgSO4,在此条件下发酵8 d,α-葡聚糖苷酶的酶活达到427.91U·mL-1。优化摇瓶发酵条件为:初始pH7.0、装液量70 mL、200 r·min-1、28℃、接种量6%,在此条件下发酵8 d,α-葡聚糖苷酶的酶活达到824.73 U·mL-1,是优化前酶活(49.53U·mL-1)的16.65倍。球毛壳α-葡聚糖苷酶经硫酸铵盐析、透析、Sephadex G75层析纯化后达到电泳纯,比酶活为8350.8 U·mg-1,纯化倍数为11.81,回收率为18.8%。对比诱变前后电泳纯的α-葡聚糖苷酶性质发现,诱变前后的α-葡聚糖苷酶最适pH和温度相同,均为5.5和60℃,pH在4.57.0和温度2050℃条件下的稳定性皆良好,诱变后的酶在2070℃的耐热性高于诱变前。同源建模和分子对接技术发现诱变前后酶的催化中心都为Asp 408、Asp409和Asp 431,但诱变后酶的578位氨基酸由组氨酸变为亮氨酸,此差异可能使酶的二级结构有微小变化而对性质有一定影响。球毛壳α-葡聚糖苷酶是一种内切型葡聚糖苷酶,降解高分子量葡聚糖为各种分子量的低聚糖且对高分子量葡聚糖的催化效率更高。终浓度为2 U·mL-1的酶催化浓度为3%的葡聚糖T2000反应15 min,将其分子量从2000 kDa降解到41 kDa。终浓度为1 U·mL-1的酶催化不同浓度的葡聚糖T2000,当浓度为3%时催化效率最高,分子量从2000 kDa降到60.2 kDa。球毛壳α-葡聚糖苷酶可明显抑制变异链球菌的生长,进而抑制变异链球菌合成葡聚糖生物膜,随着α-葡聚糖苷酶浓度的增加,变异链球菌的生长速率降低,葡聚糖生物膜的合成受到抑制,当酶浓度为50 U·mL-1时,抑制率为71.58%,清除率达到49.07%。此酶在防治和清除牙菌斑方面有很大应用潜力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 α-葡聚糖的概述
•     1.1.1 α-葡聚糖的结构和性质
•     1.1.2 α-葡聚糖的来源
•     1.1.3 α-葡聚糖的应用
•     1.1.4 α-葡聚糖的危害
•   1.2 α-葡聚糖苷酶的概述
•     1.2.1 α-葡聚糖苷酶的分类
•     1.2.2 α-葡聚糖苷酶的结构和性质
•     1.2.3 α-葡聚糖苷酶的来源
•     1.2.4 α-葡聚糖苷酶的应用
•   1.3 α-葡聚糖苷酶的研究进展
•     1.3.1 国外研究进展
•     1.3.2 国内研究进展
•   1.4 常压室温等离子体（ARTP）和甲基磺酸乙酯（EMS）诱变技术
•   1.5 立题意义
•   1.6 本文研究内容
• 第二章 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 菌种来源
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要培养基及溶液
•     2.1.4 主要仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 α-葡聚糖苷酶产酶菌株的筛选
•     2.2.2 α-葡聚糖苷酶产酶菌株的鉴定
•     2.2.3 球毛壳的生长和产酶曲线
•     2.2.4 球毛壳产α-葡聚糖苷酶的诱变
•     2.2.5 球毛壳诱变前后的形态变化
•     2.2.6 球毛壳产α-葡聚糖苷酶的培养基优化
•     2.2.7 球毛壳产α-葡聚糖苷酶的发酵条件优化
•     2.2.8 球毛壳α-葡聚糖苷酶的纯化
•     2.2.9 球毛壳诱变前后α-葡聚糖苷酶的酶学性质
•     2.2.10 球毛壳诱变前后α-葡聚糖苷酶的三维结构分析
•     2.2.11 球毛壳α-葡聚糖苷酶水解产物分析
•     2.2.12 球毛壳α-葡聚糖苷酶水解葡聚糖的理论研究
•     2.2.13 球毛壳α-葡聚糖苷酶在防治龋齿方面的研究
•   2.3 分析方法
•     2.3.1 酶活测定方法
•     2.3.2 蛋白质测定方法
•     2.3.3 SDS-PAGE分析蛋白分子量
•     2.3.4 水解产物的HPLC-MS分析
•     2.3.5 水解产物的HPLC分析
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 α-葡聚糖苷酶产酶菌株的筛选
•   3.2 α-葡聚糖苷酶产酶菌株的鉴定
•     3.2.1 产酶菌株的菌落、菌丝体、孢子形态
•     3.2.2 产酶菌株的ITS鉴定
•     3.2.3 球毛壳的生长和产酶曲线
•   3.3 球毛壳产α-葡聚糖苷酶的诱变
•     3.3.1 ARTP诱变球毛壳产α-葡聚糖苷酶
•     3.3.2 EMS诱变球毛壳产α-葡聚糖苷酶
•     3.3.3 ARTP结合EMS诱变
•     3.3.4 正突变株的筛选
•   3.4 球毛壳诱变前后的形态变化
•   3.5 球毛壳产α-葡聚糖苷酶的发酵优化
•     3.5.1 碳源种类的优化
•     3.5.2 碳源浓度的优化
•     3.5.3 氮源种类的优化
•     3.5.4 氮源浓度的优化
•     3.5.5 无机盐离子浓度的优化
•     3.5.6发酵培养基成分的正交实验
•     3.5.7 初始pH的优化
•     3.5.8 装液量的优化
•     3.5.9 转速的优化
•     3.5.10 发酵温度的优化
•     3.5.11 接种量的优化
•   3.6 球毛壳α-葡聚糖苷酶的分离纯化
•     3.6.1 硫酸铵沉淀蛋白及透析
•     3.6.2 Sephadex G75层析
•     3.6.3 纯化结果分析
•   3.7 球毛壳诱变前后α-葡聚糖苷酶的酶学特性
•     3.7.1 最适温度和热稳定性
•     3.7.2 最适pH和 pH稳定性
•     3.7.3 金属离子及化合物的影响
•     3.7.4 底物特异性研究
•     3.7.5 动力学研究
•   3.8 球毛壳诱变前后α-葡聚糖苷酶的结构分析
•   3.9 球毛壳α-葡聚糖苷酶水解葡聚糖
•     3.9.1 水解产物分析
•     3.9.2 水解葡聚糖的理论研究
•   3.10 球毛壳α-葡聚糖苷酶在防治龋齿方面的研究
•     3.10.1 对细菌的抑制性
•     3.10.2 对变异链球菌生长的影响
•     3.10.3 对生物膜的抑制和清除作用
• 主要结论与展望
•   主要结论
•   展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录 Ⅰ
• 附录 Ⅱ

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨柳

导师: 田亚平

关键词: 葡聚糖苷酶,诱变,发酵优化,酶学特性

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 江南大学

分类号: Q814

总页数: 63

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