基于脂质体与DNA的酶动力学与细胞应用研究

论文摘要

磷脂双分子层是自然界中最常见的自组装结构之一,它不仅为细胞和亚细胞区室提供保护性容器,还承载了许多用于细胞通讯和跨膜转运的蛋白。人工制备的脂质体和固体支持的磷脂双分子层膜(SLB)作为最简化的细胞和细胞膜模型,为研究细胞内生化反应,跨膜转运,以及膜表面化学提供了极好的平台。DNA分子是自然界中另一种具有卓越自组装能力的材料。近年来,DNA纳米结构与功能化修饰技术得到突飞猛进的发展,被广泛应用于生物传感,药物递送,逻辑计算等领域。将磷脂双分子层与DNA纳米技术进行合理交叉结合,并借助当前的单分子技术,使得研究膜内或膜表面酶促反应,药物递送等成为可能。本论文主要是以磷脂双分子层为支撑平台,结合DNA纳米技术,研究细胞环境下单分子酶的动力学机制以及细胞内递送。主要研究内容如下:第一,针对在细胞环境中单分子酶动力学机制研究比较匮乏,本论文构建了在模拟的细胞环境中对单分子酶可视化研究的平台。通过将单个辣根过氧化物酶(HRP)包封在含有拥挤试剂的脂质体中再连接到SLB界面,就可利用全内反射显微镜实时监测单分子酶促反应过程中荧光强度的变化。分析结果表明在拥挤限域环境中酶分子活性状态和抑制状态的相关性减弱,产物对酶抑制程度降低。进一步,利用小角X射线散射实验和模型重构,建立了拥挤环境中酶分子动力学参数变化与构型变化的关系,对于理解生物学过程及研究细胞内信号转导等具有重要指导意义。第二,目前,在溶液环境中对快速扩散的蛋白动态过程难以在单分子水平上进行观测,针对这一问题,本论文构建了二维SLB膜上单分子酶级联反应的平台,实现了对单个酶行为的可视化研究。将上游酶(过氧化氢酶)和下游酶(葡萄糖氧化酶)以不同方式锚定在SLB界面,就可以利用全内反射显微镜实时追踪二维界面上游酶和下游酶的运动行为。对单个酶运动轨迹的分析结果显示,下游酶扩散系数的增加呈现底物依赖性,但是运动方向随机。实验和理论推导表明酶分子的‘趋向运动’是由平动与转动竞争平衡的结果。本工作为研究蛋白质的动态相互作用、抑制剂筛选等提供了新的思路。第三,将蛋白质直接递送到活细胞中在基础研究和治疗应用中仍然具有挑战。本论文将胆固醇功能化的DNA分别修饰到脂质体和细胞膜表面,实现了DNA反平行杂交介导的脂质体与细胞的膜融合以及蛋白的胞内递送。其中,HRP被包裹在脂质体内并递送到细胞胞浆,利用HRP催化反应产生的荧光产物可视化验证了膜融合的发生,而且此过程不依赖于细胞内吞。此外,利用链置换反应和杂交链式反应研究了膜融合的时空可控性,并在多元体系中实现了DNA介导脂质体与细胞的特异性融合。最后将细胞色素C递送到胞浆中引发细胞凋亡。此膜融合策略在蛋白药物递送,基因编辑方面都具有良好的应用潜力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 脂质体与二维磷脂双分子层膜
•     1.1.1 脂质体概述
•     1.1.2 脂质体的应用
•     1.1.3 二维磷脂双分子层膜概述
•     1.1.4 二维磷脂双分子层膜的应用
•   1.2 DNA纳米技术
•     1.2.1 DNA修饰及其应用
•     1.2.2 DNA折纸及其应用
•   1.3 单分子酶促反应的研究
•     1.3.1 单分子酶促反应概述
•     1.3.2 模拟细胞环境研究单分子酶促反应
•   1.4 蛋白的细胞内输送的研究
•     1.4.1 蛋白的胞内输送的研究现状
•     1.4.2 输送的策略及其局限性
•     1.4.3 膜融合方式实现物质输送
•   1.5 本研究课题的提出
• 第2章 利用脂质体模拟细胞环境研究单分子酶的动力学机制
•   2.1 引言
•   2.2 实验部分
•     2.2.1 实验材料
•     2.2.2 实验仪器
•     2.2.3 实验步骤
•   2.3 实验结果与讨论
•     2.3.1 对拥挤限域环境中单分子酶促反应的实时成像
•     2.3.2 单分子酶活性状态与别构状态的相关性
•     2.3.3 均相溶液中的酶促反应实验
•     2.3.4 小角X射线散射实验研究拥挤环境对酶结构的影响
•   2.4 结论
• 第3章 利用磷脂双分子层膜与DNA折纸研究单分子酶级联反应.
•   3.1 引言
•   3.2 实验部分
•     3.2.1 实验材料
•     3.2.2 实验仪器
•     3.2.3 实验步骤
•   3.3 实验结果与讨论
•     3.3.1 过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶在SLB上的锚定
•     3.3.2 级联反应中下游酶相对于上游酶的扩散行为
•     3.3.3 级联反应中下游酶相对于上游酶的分布行为
•     3.3.4 酶分子趋化行为与其平动与转动的关系
•   3.4 结论
• 第4章 利用DNA杂交介导脂质体与细胞膜融合及酶的胞内输送.
•   4.1 引言
•   4.2 实验部分
•     4.2.1 实验材料
•     4.2.2 实验仪器
•     4.2.3 实验步骤
•   4.3 实验结果与讨论
•     4.3.1 DNA反平行杂交介导的脂质体与细胞的膜融合
•     4.3.2 DNA反平行杂交介导的膜融合不依赖于细胞内吞途径
•     4.3.3 链置换反应实现脂质体与细胞可控的结合与解离
•     4.3.4 杂交链式反应实现两种脂质体与细胞程序化的结合
•     4.3.5 混合系统中DNA杂交介导的细胞与脂质体之间的选择性融合.
•     4.3.6 膜融合方法实现细胞毒性蛋白的胞内输送
•   4.4 结论
• 第5章 总结与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 高延静

导师: 宋世平

关键词: 磷脂双分子层,纳米技术,拥挤限域环境,酶促级联反应,膜融合

来源: 中国科学院大学(中国科学院上海应用物理研究所)

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 中国科学院大学(中国科学院上海应用物理研究所)

分类号: Q73

总页数: 144

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