CRISPR/Cas9介导h FAD3基因在牛NCAPG-LCORL位点的定点整合

论文摘要

亚麻（Linum usitatissimum）脂肪酸去饱和酶基因3（fatty acid desaturase 3, FAD3）是一种脂肪酸脱氢酶基因,编码ω-3多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFAs）脱氢酶,能够将ω-6 PUFAs转化成ω-3PUFAs。本研究利用CRISPR/Cas9介导,将无抗性、无标记的人（Homo sapiens）源化h FAD3基因表达载体C2（5’同源臂-CAG-hFAD3-PolyA-3’同源臂）和M2（5’同源臂-MAR-CAG-hFAD3-PolyA-MAR-3’同源臂）定点敲入牛（Bos taurus）胎儿成纤维细胞NCAPG-LCORL位点。运用气质联用仪对脂肪酸含量进行分析,结果表明hFAD3转基因细胞中ω-6/ω-3 PUFAs比值（0.565）较非转基因细胞（1.549）显著下降（P<0.01）。qRT-PCR结果表明h FAD3基因整合并表达后,脂肪分解相关的过氧化物酶体增殖物激活受体基因（peroxisome proliferator activated receptor1, PPARg）、激素敏感脂肪酶基因（hormone-sensitive lipase, LIPE）和脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase, LPL）表达总量上调倍数大于脂肪合成相关的乙酰辅酶A羧化酶基因（acetyl CoA carboxylase, ACC）、硬脂酰辅酶A去饱和酶基因（stearoyl CoA desaturase, SCD）和脂肪酸合酶基因（fatty acid synthase, FASN）表达总量,说明hFAD3基因的表达使得细胞内的脂肪趋于分解。通过流式分选获得59株C2打靶载体单克隆细胞株,PCR鉴定及测序结果表明,其中定点整合阳性单克隆细胞3株,定点整合效率为5.1%。同时检测定点整合阳性单克隆细胞株中脂肪酸的含量以及脂肪相关基因的表达量,结果与转染后细胞一致。比较有无核基质结合区（matrix attachment region, MAR）序列介导两种转基因细胞中hFAD3基因的表达量,结果显示,MAR介导组是无MAR组的5.91倍（P<0.01）。本研究利用CRISPR/Cas9介导可实现hFAD3基因在牛NCAPG-LCORL位点的定点整合以及在细胞水平正常行使其生物学功能,同时MAR的介导可显著提高外源基因的表达量,为安全高效生产转基因动物提供科学依据。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料与试剂
•   1.2 方法
•     1.2.1 切割载体与打靶载体的构建
•     1.2.2 切割载体与打靶载体共转染渤海黑牛胎儿成纤维细胞
•     1.2.3 转染后细胞DNA、RNA、脂肪酸水平的鉴定与检测
•     1.2.4 定点整合阳性单克隆细胞的筛选及相关检测
• 2 结果与分析
•   2.1 切割载体与打靶载体的构建
•   2.2 gB+C2和gB+M2转染后细胞hFAD3基因定点整合以及表达鉴定
•   2.3 gB+C2和gB+M2转染后细胞中脂肪酸含量的变化
•   2.4 gB+C2和gB+M2转染后细胞中hFAD3基因表达量的差异
•   2.5 gB+C2和gB+M2转染后细胞中脂肪酸相关基因表达量的变化
•   2.6 g B+C2定点整合阳性单克隆细胞的筛选及相关检测
• 3 讨论
•   3.1 转基因整合位点的选择
•   3.2 无标记无抗性基因表达载体的构建
•   3.3 核基质结合 （MAR） 序列对外源基因表达的影响
•   3.4 hFAD3基因的表达对细胞中ω-6/ω-3 PUFA比值的影响
•   3.5 h FAD3基因表达产物功能发挥对脂肪酸相关基因表达的影响
• 4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 广璐,张英,郭晶,白春玲,魏著英,于超然,扈廷茂,李光鹏

关键词: 脂肪酸去饱和酶基因,定点整合,核基质结合区

来源: 农业生物技术学报 2019年01期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 内蒙古大学省部共建草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室

基金: 国家转基因生物新品种培育科技重大专项(No.2016ZX08007-002)

分类号: Q78;S823

页码: 12-22

总页数: 11

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