一、三角褐指藻不同藻株脂肪酸组成的研究（论文文献综述）
侯兴国,方琰,白欢,胡莎莎,卿人韦,兰利琼[1]（2020）在《过表达甘油激酶三角褐指藻藻株富集油脂的研究》文中研究指明为了得到高产并符合生物柴油标准的微藻油脂的藻株,本文研究了在外源甘油存在的情况下野生型（WT）三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）,甘油激酶过表达藻株（GKOE）以及甘油激酶RNA干扰藻株（GKRNi）在添加浓度为20mmol/L外源甘油的培养基中的生长情况、油脂产量以及脂肪酸组成.结果显示:（1）甘油兼养的GKOE藻细胞浓度可达到2.23×107个/mL,明显高于甘油兼养的WT的1.79×107个/mL和GKRNi的1.78×107个/mL;（2）甘油兼养的GKOE油脂含量可达到31.73%,比甘油兼养的WT和GKRNi分别高了27.20%和26.63%;（3）尼罗红染色显示甘油兼养的GKOE荧光强度比甘油兼养的WT和GKRNi分别高16.26%和17.83%;（4）甘油兼养的GKOE总脂肪酸产量可达到0.052mg/mL,比甘油兼养的WT和GKRNi高了36.84%和10.64%,说明其油脂适合于生物柴油开发.
雷娜娜[2]（2020）在《三角褐指藻多不饱和脂肪酸合成的研究》文中认为长链多不饱和脂肪酸在人类健康中起着重要作用。特别是二十碳五烯酸（EPA）和二十碳六烯酸（DHA）对脑功能发育和心血管疾病有显着的作用。三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）是一种无异味、易于培养、繁殖快且EPA含量丰富的海洋硅藻,也是研究EPA合成的理想模式生物。从分子生物学角度探究三角褐指藻积累EPA和DHA合成的分子机制,借助相关分子遗传育种手段提高EPA和DHA产量,极具研究价值。本文主要研究内容和结果如下:1、从NCBI数据库下载三角褐指藻全基因组序列,从中筛选含ELO（Pfam编号PF01151）保守结构域序列的延长酶基因家族成员,利用生物信息学方法对其结构特征及编码蛋白序列进行分析。结果发现,从三角褐指藻基因组序列中共鉴定出6个ELO基因家族成员,其中4个为PUFA底物特异性基因、2个为SFA/MUFA底物特异性基因。它们的氨基酸数目差异不明显,包含1～3个外显子区域,推测全部为疏水性蛋白,6个ELO基因分布在5条染色体上。它们均含有多个跨膜区和磷酸化位点,不存在信号肽序列。ELO基因家族启动子顺式作用元件中含多个光响应元件、激素响应元件以及其他非生物胁迫响应元件。2、通过分子生物学手段,克隆得到三角褐指藻Δ5-延长酶基因的CDS序列,构建重组质粒p Pha-T1-5e,采用电转的方法将其质粒导入三角褐指藻细胞中进行过表达,通过ble抗性筛选以及PCR测序验证,筛选出了三株转化藻株（E51、E52、E53）。脂肪酸测定结果显示,DHA含量有显着的提高,其中E51、E52、E53三株转化藻株的DHA含量比野生藻株（WT）分别提高了26.4%、44.7%、27.3%（P<0.05）。荧光定量PCR检测表明E51、E52、E53的基因表达量较WT分别提高了53.9%、54.2%、50.8%（P<0.05）。3、探究光照、温度、-N、-P、-Si对三角褐指藻脂肪酸积累的影响。结果发现,弱光强（2000 Lux）条件下EPA含量较对照组（4000 Lux）提高了18.9%,光强越高,EPA含量越低。不同培养温度条件下,随着培养温度的降低,EPA和PUFA含量呈现逐渐升高的趋势。-N和-P培养条件下与对照组相比EPA含量降低,而SFA和MUFA含量显着提高;-Si培养条件下,在培养至第12天时,EPA含量高于对照组,比对照组提高了11.2%。4、通过对三角褐指藻野生藻株进行ARTP诱变处理,经初筛和复筛,筛选出生长速率快且EPA含量相对较高的诱变藻株,其中诱变藻株M12、M25的EPA含量分别较野生藻株提高了23.4%、38.0%。
赵靖悦[3]（2020）在《三角褐指藻隐花色素/光解酶的研究》文中研究表明三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）是一种易培养、繁殖快的海洋硅藻,含有丰富的具有抗氧化活性的岩藻黄素及大量的脂肪酸,特别是二十碳五烯酸（EPA）是硅藻门的理想模式生物。隐花色素/光解酶家族（cryptochrome/photolyase family,CPF）是一个古老的蛋白质家族,它具有光受体、时钟蛋白和DNA修复酶的功能。通过研究三角褐指藻隐花色素/光解酶基因家族,为下一步研究隐花色素的功能及下游信号反应提供依据,且通过研究三角褐指藻岩藻黄素和脂肪酸的积累,使岩藻黄素及EPA的含量得到提高,为其产业化生产做出贡献。本文主要研究内容和结果如下:1、从NCBI数据库中下载三角褐指藻全基因组,利用DNA photolyase的pfam模型（Pfam编号:pfam00875）在三角褐指藻基因组进行BLASTP搜索,共发现了6个隐花色素/光解酶（CPF）基因家族成员,经分析发现,6个CPF基因的氨基酸数目差异不明显,含有的motif数量及种类相近,在染色体上不具有串联成簇现象。根据蛋白氨基酸序列的同源性构建系统发育进化树,将三角褐指藻CPF基因家族的6个成员分类。三角褐指藻CPF基因启动子顺式作用元件中含多个光响应元件,也含有多种植物生长激素响应元件和多种非生物胁迫响应元件。2、通过分子生物学手段,克隆得到三角褐指藻CPF6基因的CDS序列,构建重组质粒p Pha-T1-CPF6,采用电击转化的方法将重组质粒导入三角褐指藻细胞中进行过表达,通过ble抗性筛选、PCR测序验证及q PCR验证,筛选出了三株转化藻株（CPF6#1,CPF6#2,CPF6#3）。三株转化藻株（CPF6#1,CPF6#2,CPF6#3）与野生株的生长趋势、干重、岩藻黄素积累方面并没有显着差异。3、探究不同光质对三角褐指藻野生株生长及岩藻黄素、脂肪酸积累的影响。与白光条件对比,蓝光条件下三角褐指藻细胞密度有所降低,即蓝光条件会抑制三角褐指藻细胞的生长。通过不同光质处理细胞,时间为1～3d时,蓝光培养体系的岩藻黄素含量、岩藻黄素干重单位含量单细胞内岩藻黄素含量均大于白光的,由此猜测短时间的蓝光刺激培养会增加岩藻黄素的累积量。且通过不同光质对三角褐指藻的脂肪酸代谢积累研究,发现蓝光可刺激单个细胞内EPA、脂肪酸物质的积累。4、探究不同浓度葡萄糖和甘蔗糖蜜添加条件下三角褐指藻野生株生长和岩藻黄素、脂肪酸积累的影响。添加的甘蔗糖蜜浓度为0.5g/L、1g/L时,三角褐指藻的生长量、岩藻黄素含量、总脂肪酸含量、EPA含量,都比添加葡萄糖培养的含量有显着提高。5、对三角褐指藻进行常压室温等离子体（Atmospheric Room Temperature Plasma,ARTP）诱变育种。选取320W,60s和400W,45s为最佳ARTP诱变处理条件。经过ARTP诱变处理,经筛选后,最终得到岩藻黄素含量有显着性提高（p<0.05）的突变株A6、A7、B3、B27、C2、E23,其岩藻黄素含量分别是野生株的1.53倍、1.45倍、1.40倍、1.33倍、1.41倍、1.39倍。其中,突变株A6的岩藻黄素含量最高,为3.59mg/L,是野生株的1.53倍,比野生株增加了1.24mg/L。
王秀海[4]（2020）在《微藻不饱和脂肪酸积累调控研究》文中进行了进一步梳理微藻是一类能够进行光合自养的生物,富含不饱和脂肪酸,尤其是多不饱和脂肪酸,作为不饱和脂肪酸来源具有良好的发展前景,既安全、经济,又绿色环保。课题以不饱和脂肪酸及生物量为指标筛选得到了优势藻株,并确定了优势藻株的最佳营养方式与脂肪酸甲酯化工艺参数,同时研究了不同培养条件对优势藻株生长及不饱和脂肪酸积累的影响,在此基础上,运用转录组学技术构建了优势藻株中不饱和脂肪酸的生物合成途径。课题先以海南当地的10株微藻为筛选对象,比较其生物量、生长速率、总脂含量、总脂产量以及不饱和脂肪酸相对含量。结果表明,藻株Chlorella vulgaris CJ15生物量、油脂产量较高,油脂含量及不饱和脂肪酸相对含量最高,相对于其他藻株更具开发潜力。探讨了营养方式对优势藻株C.vulgaris CJ15生长的影响,并测定了各生化组分（蛋白质、总糖、色素、粗纤维、氨基酸、总脂、脂肪酸）的含量。结果发现营养方式显着影响C.vulgaris CJ15的生长及生化组成;且C.vulgaris CJ15无异养能力。培养基中添加葡萄糖混养时C.vulgaris CJ15蛋白质及粗纤维的含量最高,分别为6.7%及6.75%;而以蔗糖为碳源的混养更有利于C.vulgaris CJ15糖类物质的合成;在光合自养条件下,C.vulgaris CJ15藻细胞的生长能力最强,生物量及生物量生产力最高,分别为2.59g L-1和0.19g L-1d-1,,且多不饱和脂肪酸百分比、葡萄糖、粗纤维产率及色素含量、油脂产量、必需氨基酸含量较高,综合考虑,C.vulgaris CJ15高密度、高生物活性物质培养的最适营养方式为光合自养。对C.vulgaris CJ15脂肪酸提取预处理及甲酯化工艺参数进行了优化。其中研磨超声辅助对C.vulgaris CJ15细胞破碎率最高,达到92.35±0.67%。通过甲酯化参数单因素实验与响应面优化实验确定了C.vulgaris CJ15脂肪酸甲酯化的最佳工艺参数（KOH浓度:0.79mol/L,H2SO4体积分数:3.32%,皂化温度:65℃,酯化温度:61.3℃,皂化时间:38.20min,酯化时间:25min。）对C.vulgaris CJ15培养条件（氮浓度、磷浓度、p H）的影响进行了探讨。不同氮浓度下C.vulgaris CJ15不饱和脂肪酸产量顺序为:12.6mmol/L>7.6mmol/L>22.6mmol/L>17.6mmol/L>27.6mmol/L>0.0mmol/L;磷浓度为0.26mmol/L与0.35mmolg/L时C.vulgaris CJ15不饱和脂肪酸的相对含量最高,均为70%,产量在浓度为0.26mmol/L时最高,为0.28±0.03g/L,因此,适合C.vulgaris CJ15生长及不饱和脂肪酸积累的磷源浓度为0.26mmol/L。p H对C.vulgaris CJ15不饱和脂肪酸的积累具有显着影响,适合C.vulgaris CJ15高密度培养及不饱和脂肪酸积累的p H条件为6.5。基于C.vulgaris CJ15氮缺乏（0.0mmol/L）与正常培养（17.6mmol/L）下不饱和脂肪酸含量的变化,对两种培养条件下的C.vulgaris CJ15藻细胞进行转录组测序和分析。氮缺乏组（处理组）与正常培养组（对照组）原始测序数据（Raw reads）经过滤后得到Clean Reads数分别为42713412和42337990,分别占Raw Reads数的98.64%和97.77%。处理组与对照组Clean Reads的Q20值与Q30值分别大于90%和80%,表明Reads的质量高,测序得到的碱基信息可靠。使用Trinity对所得到的Clean Reads进行从头拼接（de novo assembly）组装之后聚类去冗余,得到Unigene共44302条序列用于后续分析。采用软件将得到Unigene在7大功能数据库（KEGG、GO、NR、NT、Swiss Prot、Pfam和KOG）中做比对,共有35292条Unigene被注释到,占总Unigene的79.66%。以差异表达倍数|log2FC|≥2,FDR（False Discovery Rate）≦0.001为筛选条件,对处理组与对照组的Unigene进行比较筛选得到显着差异表达基因（DEGs）,并对DEGs进行了GO富集分析和KEGG Pathway富集分析。预测构建了C.vulgaris CJ15中不饱和脂肪酸的生物合成途径,并挖掘到不饱和脂肪酸合成途径中显着上调基因（或酶）FASN、Fab H、FATA、FAD2以及SCD(C16:0-Co A→C16:1（n-7）,显着下调基因（或酶）Fab D和TER。这为将来采用基因工程等手段提高C.vulgaris CJ15不饱和脂肪酸的积累提供了理论依据。
郝夏晖[5]（2020）在《三角褐指藻LACS酶在脂肪酸代谢中功能的初步研究》文中指出近年来,长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFA）对于人类健康的重要性越来越受到重视。目前人类获取LC-PUFA的主要来源是深海鱼油,然而鱼油面临资源短缺和环境污染的风险,因此需要寻找新的替代来源。海洋微藻能从头合成LC-PUFA,是海洋LC-PUFA的初级生产者。海洋微藻LC-PUFA合成代谢途径的研究对于开发LC-PUFA的替代来源具有重要的意义。长链酰基辅酶A合成酶（LACS）在脂肪酸代谢中起关键作用。游离脂肪酸必须在LACS催化作用下活化成酰基辅酶A,才能进入后续脂肪酸的代谢途径,如碳链延长、甘油三酯合成、糖脂合成、磷脂合成、β氧化等。研究LACS在产油微藻脂肪酸代谢中的功能有助于全面解析LC-PUFA的合成途径。本论文以富含LC-PUFA的海洋微藻-三角褐指藻为对象,采用分子生物学和生化等方法研究五个长链酰基辅酶A合成酶（ptACSL1-5）的生化特性。主要研究结果如下:（1）采用逆转录PCR扩增ptACSL1-4编码基因,分别构建ptACSL1-4与GFP的融合表达质粒,转化三角褐指藻,通过观察GFP荧光确定其亚细胞定位。结果表明:ptACSL1、ptACSL2和ptACSL3定位于质体,ptACSL4定位于细胞质膜和细胞质,而ptACSL5已知定位于过氧化物酶体。进一步通过GFP自组装方法确定了ptACSL1在质体中的具体定位:ptACSL1蛋白N端跨膜区位于叶绿体内质网（chloroplast ER）膜上,而C端位于胞浆。（2）通过体外酶活实验研究了ptACSL1-5蛋白的底物特异性。分别构建ptACSL1-5蛋白C末端融合6×His标签的表达质粒并转化到大肠杆菌进行异源表达,使用亲和层析方法分别纯化得到对应ptACSL重组蛋白,在体外酶反应体系中以不同游离脂肪酸为底物采用NADH消耗法测定重组蛋白的酶活。结果表明:以C18:1为底物时,五个ptACSL蛋白都检测到较高的酶活（175.50-330.38 nmol/min/mg）;分别以五种不同脂肪酸为底物时ptACSL1和ptACSL2都能检测到酶活;以C20:5为底物时,ptACSL1和ptACSL4的酶活相对其它底物高2个数量级,分别高达3135.05 nmol/min/mg和2388.8 nmol/min/mg。（3）采用Western blot方法研究了在缺氮培养和不同CO2浓度（空气、1%、4%、10%）培养条件下ptACSL1-5蛋白的表达模式。缺氮72 h内,ptACSL1、ptACSL3和ptACSL4蛋白表达持续上调,而ptACSL2蛋白表达下调。随着CO2浓度的提高,ptACSL1、ptACSL2和ptACSL4蛋白表达量降低;CO2浓度从空气提高至4%时,ptACSL3表达量明显增加,CO2浓度进一步增加至10%则抑制其表达。（4）采用CRISPR/Cas9技术分别构建ptACSL1-5基因敲除突变株。分别根据五个ptACSL基因序列各设计6个sgRNA,并构建相应CRISPR/Cas9质粒。以转化子基因组DNA为模板采用巢式PCR检测并对gRNA敲除位点区域进行测序。结果表明突变类型均为片段缺失,缺失片段大小为67-733bp,单基因突变率约为33-70%,每个ptACSL基因选取3-5个突变株用于后续分析。综上所述,本论文对三角褐指藻的五个ptACSL蛋白的亚细胞定位、底物特异性、表达模式进行了研究,并构建了ptACSL1-5基因敲除突变株,为后续阐明ptACSL1-5在脂肪酸代谢途径中的分子调控功能奠定了基础。
陈禹先[6]（2020）在《三角褐指藻遗传转化及高产油转化株的研究》文中认为三角褐指藻是一种具有重要经济价值和生态学意义的多形态单细胞硅藻。该藻生长在海洋或盐湖中,可以合成和累积岩藻黄质,金藻昆布糖,多不饱和脂肪酸等高价值化合物。此外,由于三角褐指藻生长速度快、不占用淡水资源、能够积累自身干重20%-30%的油脂,该藻已经成为潜在的生物柴油资源藻种。近年来,由于核基因组、叶绿体基因组、线粒体基因组、蛋白质组研究成果的积累和完善,三角褐指藻已经成为研究硅藻遗传学、生理学以及生化过程的―模型生物‖。在本文中,作者研究了三角褐指藻的无菌化培养;对基因枪转化以及转化子筛选方法进行了优化;敲低了内源Pt PEPC1和Pt PEPC2基因转录;将At LEC1和At LEC1-LIKE（At L1L）转录因子密码子优化后进行异源表达,最终获得了油脂含量显着提高的转化藻株。经系统的研究,形成了三角褐指藻遗传转化的高效实验研究体系。具体研究结果如下:1、建立了三角褐指藻的无菌纯化方法采用不同浓度的四种抗生素处理含有伴生菌的三角褐指藻藻液。Ampicillin（Amp）组对三角褐指藻细胞的生长以及相关生理生化指标没有显着性影响。在除菌方面,Amp的效价较低,在浓度400mg/L时仍存在大量的伴生菌。Chloramphenicol（Cmp）在低浓度（50 mg/L）时对于三角褐指藻生长具有促进作用,而高浓度（100～400 mg/L）时具有抑制作用;叶绿素荧光参数分析显示Cmp组所有浓度均对藻细胞具有毒性刺激作用,HPLC分析显示Cmp提高了藻细胞叶绿素a在光合色素中所占的比例。藻细胞与伴生菌对于Tetracycline（Tet）的耐受性是接近一致的,即菌藻在低浓度（50～100 mg/L）Tet下可以生长,在高浓度（200～400 mg/L）Tet下生长完全被抑制。Kanamycin（Kan）对于藻细胞生长无抑制作用,甚至在高浓度（400 mg/L）下可以促进藻细胞生长,400 mg/L Kan组Fv/Fm值始终高于对照组。在除菌方面,100 mg/L Kan即可完全除去培养基中的伴生菌,SYBR GREEN I染色法也验证了Kan的除菌效果。因此,大于100 mg/L浓度的Kan最适合用作三角褐指藻的除菌剂,对藻细胞生长没有明显影响。2、建立了微藻高效基因枪转化方法对抗生素选择培养基的改良,微载体的选择、制备、包埋、点膜和轰击参数的优化,以及受体细胞的处理等进行了系统研究。结果显示,采用50%海水盐度f/2培养基可以提高博来霉素的效价,f/2固体培养基中2216E营养物质的加入能缩短1/3的平板筛选时间。微载体制备应选择对金（钨）粉没有吸附作用的离心管,制备量/管应少于3.5 mg。微载体轰击量每次大约为0.75 mg,过量将会造成一个轰击死亡圈,过少将导致轰击成本上升。当轰击间距A为6.35 mm,间距B为11 mm,间距C为6 cm时,可以获得最多的转化细胞。109个受体细胞铺成较厚的多细胞层能显着提高转化效率。经过上述优化与改进,将现有文献报道的硅藻转化效率提高了4.7～30倍,达到295±60个转化子/μg DNA。该方法也成功应用于其他微藻（杜氏盐藻、小球藻）的基因枪转化研究,为微藻基因工程研究提供高效和可靠的操作技术。3、优化了微藻藻液直接PCR法采用单因素方差分析藻细胞裂解液种类、藻细胞数、藻细胞生长阶段和煮沸裂解时间对PCR关键性因素——藻液DNA含量的影响。结果显示5种藻细胞裂解液产生的藻液DNA含量具有显着性差异;藻细胞数量的增加会导致藻液DNA含量的非线性递增;对数生长期的藻细胞产生的藻液DNA含量显着性高于稳定期和衰亡期;煮沸裂解时间在5min～15min内对藻液DNA含量影响相对较小。在进行藻液PCR时,多次取样裂解得到的藻液DNA含量由于前3个因素的不同而差异显着。PCR反应结果显示藻液DNA的加入量在50ng～200ng之间才会产生清晰明亮的条带,而裂解液自身对PCR产物的影响可以忽略不计（20μl反应体系）。根据上述实验结果,作者认为传统的藻液PCR法应加入测量藻液DNA浓度,计算加入模板体积这一关键步骤,这样可以避免假阴性结果的出现,大大提高实验的成功率。4、沉默Pt PEPC1和Pt PEPC2基因提高三角褐指藻脂质含量从三角褐指藻中克隆获得两个磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因Pt PEPC1和Pt PEPC2,分别在这两个基因的酶活性中心保守序列设计反向重复的RNA干扰结构。转化后,得到了Pt PEPC1和Pt PEPC2基因干扰转化子。转化子无论在m RNA转录水平上,还是在PEPC酶活性上,均显示大幅下降。生理生化参数分析显示,干扰转化子最大细胞密度比野生型藻株降低8%～12%,Fv/Fm在对数生长期时（第8天）较野生型降低约5%,在稳定期时（第14天）降低约20%。干扰转化子r ETR值与野生型没有显着性差异,非光化学淬灭较野生型下降16%～31%。本研究证明了三角褐指藻不存在C4途径,而只存在有助于细胞消耗过剩光能的“C4代谢”。此外,干扰转化子中性脂含量提高18～22%,间接证明了“底物竞争”假说。5、过表达外源At LEC1和At L1L转录因子提高三角褐指藻脂质含量将At LEC1和At L1L转录因子进行密码子优化后,分别转入三角褐指藻细胞中。亚细胞定位显示转录因子定位于细胞核。Southern和Western杂交结果表明外源基因已整合进入三角褐指藻核基因组中,并且可以在藻细胞中稳定地表达。转化子在培养周期内与野生型藻细胞生长情况接近,最大细胞密度没有显着性差异。At LEC1转化子中性脂含量提高15%～24%,At L1L转化子中性脂含量提高42%～64%。转录组测序分析表明,过表达At L1L转录因子藻株中1876个基因表达发生显着性变化,其中1512个基因上调,364个基因下调。上调表达的基因涉及脂肪酸合成,甘油酯代谢,糖酵解,丙酮酸代谢等途径。代谢组学分析显示At L1L转化子中葡萄糖,果糖和甘露糖等单糖含量显着性下降,丙酮酸,苹果酸,琥珀酸和延胡索酸等有机酸以及脂质合成原料乙酰辅酶A,丙二酰辅酶A,甘油-3-磷酸的含量显着性提高。本研究的结果表明At L1L转录因子通过调控糖酵解、脂质合成途径相关基因,限制了光合固定的碳向糖类合成方向流动,这些碳被―虹吸‖进入脂质合成,进而造成转化株油脂积累的大幅提高。
叶浩盈[7]（2019）在《三角褐指藻脂肪酸去饱和酶基因家族分析及高产EPA藻株的选育》文中提出三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）是一种无异味、易于培养、繁殖快且二十碳五烯酸（EPA）含量丰富的海洋微藻,而EPA在增强人体免疫力、降低血脂、血压等方面有着显着的作用,因此以高产EPA的三角褐指藻作为工业藻株是未来工业发展的新趋势。本研究希望通过分子生物学的方法及常压室温等离子体诱变（ARTP）的方式筛选出高产EPA的三角褐指藻藻株,为工业化提取EPA提供科学依据和可利用的藻株。通过对藻株（FACHB-863）进行形态学与分子生物学鉴定,最终判断该藻株为三角褐指藻。利用涂布、划线法,毛细吸管分离法,再结合抗生素除菌方法,获得无菌藻株。比较液体保藏、固-液双相保藏、低温甘油保藏几种方法的保藏效果,固-液双相保藏效果最好,低温保藏最差,且低浓度保护剂保藏的细胞未能存活。从TAIR中下载拟南芥FAD基因家族,Blast比对筛选出三角褐指藻的FAD基因,共鉴定出15个家族基因。参与脂肪酸合成的去饱和酶基因分别有Δ4、Δ5、Δ6和Δ12,其中,Δ5去饱和酶基因位于11号染色体上并且是参与EPA合成途径中的关键酶基因,所以利用生物信息学对其所编码的蛋白（ptd5α）进行理化性质分析研究。对ptd5α进行分析时发现该蛋白较为稳定,属于亲水性蛋白。ptd5α蛋白有4个跨膜结构域,存在较多潜在的磷酸化位点,说明这些蛋白在与其他酶类蛋白互作过程中可能会改变其磷酸化状态,从而对其生物活性及功能进行调节。本论文针对提高三角褐指藻EPA产量展开了研究。首先对多不饱和脂肪酸合成途径中位于EPA上游的关键酶基因Δ5去饱和酶进行克隆;其次,构建重组质粒p Pha-T1-Δ5导入三角褐指藻中进行过表达;最后,通过ble抗性筛选以及PCR测序验证,筛选出了三株突变藻株（5D1、5D2、5D3）。通过一系列生理生化指标的测定,虽然突变藻株与野生藻株（WT）生长周期差异不显着,但脂肪酸的含量却有显着的提高,尤其是5D1、5D2、5D3三株突变藻株的EPA含量比野生藻株分别提高了24.2%、20.4%、30.9%。荧光定量PCR检测表明突变藻株5D1的Δ5去饱和酶基因的相对表达量较WT提高了61.5%,5D2、5D3藻株的Δ5去饱和酶基因的相对表达量较WT都提高了85.3%。将3株突变藻株与野生藻株基因组重测序发现,各组的In Del和SNP变异情况存在1-4个差异基因。对三角褐指藻野生藻株进行ARTP诱变处理,经初筛和复筛,筛选出4株诱变藻株SJA1、SJA3、SJA4、SJA6,EPA含量分别较野生藻株提高了25.6%、17.4%、15.5%、21.6%。
魏伟[8]（2019）在《三角褐指藻三磷酸甘油脱氢酶两种亚型的功能研究》文中指出硅藻的模式生物三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）被认为是生物柴油的理想来源,但大体而言微藻生物质能源的工业化发展受限于产量及提取成本等因素。随着现代分子生物学技术的发展,我们可以对相应藻株进行基因水平的改造。本研究以前人发现的能高效提高三角褐指藻总脂和甘油产量的甘油三磷酸脱氢酶（Glycerol-3-phosphate dehydrogenase,GPDH）为基础,通过蛋白序列分析对此酶在三角褐指藻中的两种亚型GPDH2和GPDH3,本研究通过分子生物学手段进行目的基因过表达、设计人工microRNA对两种亚型进行干扰来对其功能进行研究。通过成熟高效的遗传转化体系,成功获得GPDH2和GPDH3内源基因过表达工程藻株OEG2、OEG3;人工microRNA干扰藻株AMiG2和AMiG3。通过对这4种突变工程藻株的生理生化分析研究此基因两种亚型的功能。研究结果发现过表达GPDH2和GPDH3的藻株在对数期前期的生长速率与叶绿素a含量有明显提高,光合作用效率有轻微改变。两株GPDH2过表达突变工程藻中总脂含量分别降低25%、18%,甘油总产量分别提高27%、24%;两株GPDH3转化藻中脂质含量相比野生型提高114%、83%,甘油含量减少7%、5%;对比不同脂肪酸含量的变化发现,GPDH2对脂肪酸C14:0,C16:1固定有一定的偏好性,GPDH3则对脂肪酸C16:0含量的提高有较大的促进作用。研究结果初步阐明了三角褐指藻中GPDH2具有更强的甘油三磷酸酶活性,可诱导更多的三磷酸甘油脱磷产生甘油;GPDH3具有更强的脂肪酸固定作用,三磷酸甘油更多的偏向于结合脂肪酸先形成磷脂酸,最终合成甘油三酯以提高总脂含量。另外,通过人工microRNA干扰,特异性降低GPDH2和GPDH3转录表达后也取得了与上述研究相吻合的结果。本研究结果提升了对三角褐指藻的甘油三磷酸脱氢酶不同亚型功能的认知,同时也获得了性状优良的高产油脂、高生长速率的三角褐指藻工程藻株,为推动微藻资源高值化利用提供了理论依据和新的思路。
汪翔[9]（2018）在《三角褐指藻甘油三酯合成及累积途径相关重要节点的研究》文中研究说明微藻作为具有光合作用的单细胞生物,贡献了全球40%的初级生产力。微藻的光合作用效率高、易于培养、生物量高、不与农田争地、易于遗传改造,广泛应用于能源、医药、食品等领域中。三角褐指藻是一种代表性单细胞海洋硅藻,含有较高的脂质含量和多不饱和脂肪酸成分,基因组已经测序,并可易于遗传转化。三角褐指藻不仅保留了微藻常见的特点,而且含有较高的脂质含量和多不饱和脂肪酸组成。此外,它可以通过基因工程方式获得高产脂质和多不饱和脂肪酸的工程藻株。油体作为微藻的油脂储存细胞器,参与微藻脂质合成过程,包括油体膜合成、脂质合成及降解、脂质流动、信号传导等多种生物过程。对微藻油体的蛋白组成和功能的研究可以进一步厘清脂质累积的机制,为微藻能源产业化过程奠定坚实的基础。本研究中,我们通过对三角褐指藻中脂质合成途径的潜在重要节点开展了基因功能的研究,通过细胞分子生物学手段结合生理生化指标的测定,获得了如下一系列研究结果:1、三角褐指藻甘油三酯（Triacylglycerol,TAG）生物合成途径中,鉴定了一个1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶（1?acyl?sn?glycerol?3?phosphate acyltransferase,AGPAT1）,发现AGPAT1含有四个保守的酰基转移酶基序I-IV。免疫电镜结果显示AGPAT1定位于叶绿体膜上。过表达AGPAT1降低了总糖含量和可溶性蛋白含量,提高了脂质含量。AGPAT1可以协调TAG中其他关键基因的表达,此外,AGPAT1改变了脂肪酸组分,多不饱和脂肪酸也有所提高。我们不仅观察到细胞质中油体增大,超微结构显示叶绿体中也形成了许多含有TAG的质体小球。结果表明过表达AGPAT1可以提高TAG含量,也揭示了硅藻中新颖的叶绿体TAG合成途径。2、鉴于我们前期发现的甘油-3-磷酸酰基转移酶（Glycerol?3?phosphate acyltransferase,GPAT1）和AGPAT1在三角褐指藻TAG生物合成中的作用,进一步构建获得了GPAT1和AGPAT1双节点联合作用的过表达藻株。结果发现GPAT1和AGPAT1联合作用会促进TAG明显积累。联合作用影响了微藻对数期中期的生长,可能是额外生成叶绿体中光合膜导致。此外,我们首次揭示叶绿体定位的GPAT1和AGPAT1通过原核途径从头合成脂肪酸用于叶绿体TAG合成途径。3、三角褐指藻的脂肪酸组分中含有较高比例的长链多不饱和脂肪酸（Long chain polyunsaturated fatty acid,LC-PUFA）,本研究对合成途径中的潜在关键节点丙酰基甲酰基载体蛋白转移酶（Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase,MCAT）和脂肪酸去饱和酶5b（Desaturase 5b,D5b）进行了鉴定。结果发现,双节点联合作用下,藻株中LC-PUFA快速大量积累。其中花生四烯酸（Arachidonic acid,ARA）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid,DHA）的含量分别高达18.98μg/mg和9.15μg/mg。我们首次将微藻中二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid,EPA）含量提升至高达85.35μg/mg（干重）。除此之外,我们发现ARA和EPA主要积累于甘油三酯中,而DHA则主要集中在磷脂中。这两个关键节点联合作用导致LC-PUFA的高表达,而对微藻生长速率无影响。4、为了解油体的蛋白组成和调控机制,本研究中,我们对潜在油体组成蛋白LDP1进行了功能鉴定。LDP1与另一个硅藻Fistulifera sp.油体相关蛋白DOAP1具有同源性。LDP1的过表达提高了脂质含量、增加了油体大小、上调了涉及甘油三酯和脂肪酸合成相关基因的表达水平。相反,通过RNAi敲低LDP1会降低脂质含量、减少油体体积。此外我们分离了缺氮处理下三角褐指藻的油体,通过质谱分析了油体蛋白组分,发现LDP1存在于油体蛋白组分中并且丰度较高。重要的是,我们通过利用EYFP进行定位确定了LDP1存在于油体。5、鉴于人类的非酒精性脂肪肝相关的重要蛋白含patatin样磷脂酶域3蛋白（Patatin-like phospholipase domain-containing protein 3,PNPLA3）可促进肝脏中脂质合成,我们在三角褐指藻中寻找并鉴定出了类似PNPLA3功能的蛋白,过表达藻的内源PNPLA3提高了脂质累积水平,脂肪酸组分有所改变。我们又将人源的PNPLA3I148M首次在三角褐指藻中进行了异源表达,发现PNPLA3I148M显着提高了微藻脂质含量和改变了脂肪酸组成。总体而言,本论文首次发现了三角褐指藻存在叶绿体甘油三酯合成和组装机制,报道了新鉴定的油体蛋白,并揭示了油体蛋白参与了脂质合成和油体生成,提供了多节点共同调控的策略提升脂质和多不饱和脂肪酸合成,同时获得了脂质和多不饱和脂肪酸含量显着提高的转化藻株。这些结果提升了对微藻脂质代谢机制的认知,并为推动微藻资源高值化利用提供了理论依据和新的思路。
陈建楠[10]（2018）在《球等鞭金藻生产岩藻黄素和油脂的研究》文中研究说明球等鞭金藻（IsocArysis galbana）是一种富含岩藻黄素和不饱和脂肪酸的海洋微藻。岩藻黄素是一种含氧的类胡萝卜素,具有抗氧化、调节血糖、抗血管新生等生理活性,在人体健康、美容、食品等方面发挥着重要作用。不饱和脂肪酸具有调节心血管疾病、健脑益智等功能,在人体生长、发育的过程中起着重要组成部分。通过对球等鞭金藻生产岩藻黄素和油脂的研究,为后续产业化生产和研究提供一些有价值的参考依据。本文主要研究内容和结果如下:1、通过不同的分离纯化方法和抗生素除菌研究,得到了无菌的球等鞭金藻;通过不同的保藏方法对球等鞭金藻进行保藏研究,液体继代保藏和固体平板试管斜面保藏方法对球等鞭金藻的保藏效果比较好;利用形态学和分子生物学鉴定,认定该株藻为等鞭藻属（Isochrysis sp.）的一株球等鞭金藻;通过BD FACSymphony A5流式细胞仪预测球等鞭金藻的基因组大小为102.671 Mb左右。2、通过有机溶剂提取球等鞭金藻岩藻黄素的工艺优化,最佳的提取工艺优化组合为提取温度35℃、料液比1:30 g/mL、提取时间15 min、提取次数2次,提取率为12.03 mg/g;岩藻黄素粗提物通过硅胶柱分离纯化,最佳的回收率为86.35%,纯度为29.78%;通过UPLC和HPLC建立检测岩藻黄素方法,通过液相质谱仪检测鉴定球等鞭金藻的岩藻黄素质量分数大小为659左右。3、通过球等鞭金藻培养条件的优化,最适的培养温度为25℃、光照强度为120μmol photons m-2s-1、光照周期为14 h:10 h、海水盐度在31.5‰左右、pH值在8.0左右有利于球等鞭金藻的生长,通过培养基优化岩藻黄素含量提高了 2.54倍,总油脂含量提高了 2.77倍;通过50 L光生物反应器通气扩大培养,提高了岩藻黄素和油脂的产量;通过对球等鞭金藻絮凝采收,氯化铁为最佳絮凝剂,而且有利于采收后继续补料培养。4、通过不同的光质和氮磷胁迫诱导球等鞭金藻研究,发现对岩藻黄素和脂肪酸代谢积累没有显着性影响关系。通过紫外诱变育种和等离子体诱变育种,筛选出了七株生长速率快岩藻黄素和油脂含量相对较高的突变藻株。
二、三角褐指藻不同藻株脂肪酸组成的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、三角褐指藻不同藻株脂肪酸组成的研究（论文提纲范文）
（1）过表达甘油激酶三角褐指藻藻株富集油脂的研究（论文提纲范文）
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 生长曲线的绘制 |
| 2.2.2 油脂的提取与测定 |
| 2.2.3 中性脂质的定性测定 |
| 2.2.4 脂肪酸组成测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 藻株生长情况分析 |
| 3.2 油脂含量分析 |
| 3.3 中性脂质定性分析 |
| 3.4 藻细胞的脂肪酸组成分析 |
| 4 讨论 |
| 引用本文格式： |
（2）三角褐指藻多不饱和脂肪酸合成的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1.1 三角褐指藻简介 |
| 1.2 多不饱和脂肪酸的研究 |
| 1.2.1 结构、性质和来源 |
| 1.2.2 多不饱和脂肪酸合成途径 |
| 1.2.3 多不饱和脂肪酸的功能 |
| 1.2.4 多不饱和脂肪酸研究进展 |
| 1.3 脂肪酸延长酶简介 |
| 1.4 脂肪酸延长酶基因家族研究 |
| 1.5 影响三角褐指藻脂肪酸积累的主要因素 |
| 1.6 三角褐指藻诱变育种研究进展 |
| 1.7 本课题研究的目的、内容和技术路线 |
| 1.7.1 本课题研究的目的 |
| 1.7.2 本课题主要研究内容 |
| 1.7.3 本课题研究的技术路线 |
| 第一章 三角褐指藻脂肪酸延长酶基因家族的生物信息学分析 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 基因家族成员鉴定及基本性质分析 |
| 1.2.2 基因结构分析 |
| 1.2.3 基因家族序列motif分析 |
| 1.2.4 基因染色体定位 |
| 1.2.5 系统发育进化树构建 |
| 1.2.6 基因家族启动子分析 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 三角褐指藻ELO基因家族的鉴定及蛋白基本性质分析 |
| 1.3.2 三角褐指藻ELO基因家族的结构分析 |
| 1.3.3 三角褐指藻ELO基因家族motif及染色体分布分析 |
| 1.3.4 系统发育进化树分析 |
| 1.3.5 三角褐指藻ELO基因家族的启动子分析 |
| 1.4 小结与讨论 |
| 第二章 三角褐指藻Δ5-延长酶基因的克隆及过表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 藻种 |
| 2.1.2 主要试剂和测序服务 |
| 2.1.3 培养基与试剂配制 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 三角褐指藻的培养 |
| 2.2.2 三角褐指藻基因组DNA的提取 |
| 2.2.3 三角褐指藻总RNA的提取 |
| 2.2.4 cDNA第一链的合成 |
| 2.2.5 三角褐指藻Δ5-脂肪酸延长酶基因的克隆 |
| 2.2.6 过表达载体pPha-T1-5e的构建 |
| 2.2.7 电击法转化三角褐指藻 |
| 2.2.8 三角褐指藻Δ5-延长酶基因过表达藻株的筛选与鉴定 |
| 2.2.9 荧光定量PCR的检测 |
| 2.2.10 脂肪酸的提取及测定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 三角褐指藻基因组DNA的提取 |
| 2.3.2 三角褐指藻总RNA的提取 |
| 2.3.3 PCR扩增Δ5-延长酶基因 |
| 2.3.4 重组过表达载体pPha-T1-5e的构建和鉴定 |
| 2.3.5 三角褐指藻Δ5-延长酶基因过表达藻株的筛选鉴定 |
| 2.3.6 三角褐指藻基因表达差异性分析 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 条件胁迫对三角褐指藻生长和脂肪酸合成的影响 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 藻种 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 三角褐指藻细胞生长的测定 |
| 3.2.2 光照强度对三角褐指藻生长和脂肪酸合成的影响 |
| 3.2.3 温度对三角褐指藻生长和脂肪酸合成的影响 |
| 3.2.4 营养元素缺失对三角褐指藻生长和脂肪酸合成的影响 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 三角褐指藻细胞生长的测定 |
| 3.3.2 不同光照强度对三角褐指藻生长和脂肪酸合成的影响 |
| 3.3.3 温度对三角褐指藻生长和脂肪酸合成的影响 |
| 3.3.4 营养元素缺失对三角褐指藻的生长和脂肪酸合成的影响 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 三角褐指藻ARTP诱变育种 |
| 4.1 实验材料与仪器 |
| 4.1.1 藻种 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 诱变时间的筛选 |
| 4.2.2 致死率的计算 |
| 4.2.3 诱变藻株的筛选 |
| 4.2.4 诱变藻株与野生藻株的脂肪酸的测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 ARTP诱变处理时间对三角褐指藻致死率的影响 |
| 4.3.2 诱变藻株的筛选 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 附录1 测序序列 |
| 附录2 主要符号缩略表 |
| 附录3 相关试剂及缓冲液配方 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）三角褐指藻隐花色素/光解酶的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 0.1 三角褐指藻 |
| 0.1.1 三角褐指藻简介 |
| 0.1.2 三角褐指藻中重要活性物质 |
| 0.1.2.1 岩藻黄素 |
| 0.1.2.2 EPA |
| 0.2 隐花色素/光解酶基因家族 |
| 0.2.1 基因家族相关概念 |
| 0.2.2 隐花色素/光解酶基因家族的研究 |
| 0.2.3 三角褐指藻隐花色素/光解酶基因的研究 |
| 0.3 糖蜜 |
| 0.3.1 甘蔗糖蜜简介 |
| 0.3.2 糖蜜作为培养基碳源的研究 |
| 0.4 ARTP诱变育种 |
| 第一章 三角褐指藻隐花色素/光解酶基因家族分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 基因家族成员鉴定 |
| 1.1.2 基因家族结构分析 |
| 1.1.3 二级结构分析 |
| 1.1.4 保守结构域预测及染色体分析 |
| 1.1.5 三级结构预测分析 |
| 1.1.6 系统发育进化树构建 |
| 1.1.7 基因家族启动子分析 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.2.1 基因家族的鉴定及蛋白特性分析结果 |
| 1.2.2 基因家族的结构分析结果 |
| 1.2.3 二级结构预测分析 |
| 1.2.4 保守结构域预测及染色体分布分析结果 |
| 1.2.5 其他三级结构预测分析 |
| 1.2.5.1 三级结构建模分析 |
| 1.2.5.2 磷酸化位点预测分析 |
| 1.2.5.3 跨膜结构域分析 |
| 1.2.5.4 亚细胞结构定位 |
| 1.2.6 系统发育进化树构建结果 |
| 1.2.7 基因家族的启动子分析结果 |
| 1.3 小结与讨论 |
| 第二章 三角褐指藻CPF6 基因的克隆及过表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 藻种 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 三角褐指藻的培养 |
| 2.2.2 三角褐指藻总RNA的提取 |
| 2.2.3 三角褐指藻CPF6 基因的克隆 |
| 2.2.4 过表达载体p Pha-T1-CPF6 的构建 |
| 2.2.4.1 CPF6 基因与p Pha-T1 载体的连接 |
| 2.2.4.2 重组质粒的转化、阳性克隆的鉴定及测序 |
| 2.2.5 电击转化三角褐指藻 |
| 2.2.6 阳性转化子的筛选及验证 |
| 2.2.7 荧光定量PCR的检测 |
| 2.2.8 转化株细胞生长、干重及岩藻黄素的测定 |
| 2.2.8.1 生长曲线绘制 |
| 2.2.8.2 细胞干重的测定 |
| 2.2.8.3 岩藻黄素的测定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 三角褐指藻CPF6 基因的扩增 |
| 2.3.2 CPF6 基因过表达载体p Pha-T1-CPF6 的构建和鉴定 |
| 2.3.2.1 菌液PCR验证 |
| 2.3.2.2 质粒PCR验证 |
| 2.3.3 阳性转化子的筛选 |
| 2.3.4 阳性转化子的验证 |
| 2.3.5 目的基因的荧光定量检测 |
| 2.3.6 野生株与转化株的对比 |
| 2.3.6.1 生长曲线的测定 |
| 2.3.6.2 野生株与转化株干重测定 |
| 2.3.6.3 HPLC测定岩藻黄素的方法 |
| 2.3.6.4 野生株与转化株的岩藻黄素测定 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 不同光质培养条件对三角褐指藻岩藻黄素和脂肪酸积累的影响 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 藻种 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验方案设计 |
| 3.2.2 细胞密度、细胞干重的测定 |
| 3.2.2.1 三角褐指藻干重测定 |
| 3.2.2.2 三角褐指藻细胞密度测定 |
| 3.2.3 岩藻黄素提取及测定 |
| 3.2.4 脂肪酸提取及测定 |
| 3.2.4.1 样品处理 |
| 3.2.4.2 样品酯化 |
| 3.2.4.3 气相色谱测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 不同光质培养条件对三角褐指藻细胞生长的影响 |
| 3.3.2 不同光质培养条件对三角褐指藻岩藻黄素含量的影响 |
| 3.3.3 脂肪酸的测定 |
| 3.3.4 不同光质培养条件对三角褐指藻脂肪酸的影响 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 以甘蔗糖蜜为培养基碳源对三角褐指藻生长的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 藻种 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实验方案设计 |
| 4.2.2 甘蔗糖蜜预处理 |
| 4.2.3 苯酚硫酸定糖法测定甘蔗糖蜜所含的总糖含量 |
| 4.2.3.1 标准液的配置 |
| 4.2.3.2 葡萄糖标准曲线的制作 |
| 4.2.4 三角褐指藻干重测定 |
| 4.2.5 三角褐指藻细胞密度测定 |
| 4.2.6 岩藻黄素测定 |
| 4.2.7 脂肪酸含量测定 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 不同浓度甘蔗糖蜜和葡萄糖对三角褐指藻细胞生长的影响 |
| 4.3.2 不同浓度甘蔗糖蜜及葡萄糖对三角褐指藻岩藻黄素含量的影响 |
| 4.3.3 不同浓度甘蔗糖蜜和葡萄糖对三角褐指藻脂肪酸的影响 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 三角褐指藻ARTP诱变育种 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 藻种准备 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 诱变时间的筛选 |
| 5.2.2 致死率计算 |
| 5.2.3 ARTP诱变藻株的初筛 |
| 5.2.4 ARTP诱变藻株的复筛 |
| 5.2.5 诱变藻株与野生藻株的岩藻黄素的测定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 ARTP致死率 |
| 5.3.2 三角褐指藻ARTP突变株筛选结果 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 附录1 进化树中所用序列 |
| 附录2 f/2 培养基配方 |
| 附录3 测序序列 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）微藻不饱和脂肪酸积累调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 微藻及其应用 |
| 1.1.1 食品领域 |
| 1.1.2 能源领域 |
| 1.1.3 医药领域 |
| 1.1.4 动物营养与饲料领域 |
| 1.1.5 化妆品领域 |
| 1.1.6 污水处理 |
| 1.2 培养条件对微藻生长代谢的影响 |
| 1.2.1 营养方式 |
| 1.2.2 温度 |
| 1.2.3 pH |
| 1.2.4 碳源 |
| 1.2.5 氮源 |
| 1.2.6 磷源 |
| 1.3 微藻不饱和脂肪酸研究现状 |
| 1.3.1 不饱和脂肪酸生理功能 |
| 1.3.2 微藻不饱和脂肪酸的研究现状 |
| 1.4 微藻转录组研究 |
| 1.5 论文研究方案 |
| 1.5.1 研究目的与意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 培养基配方 |
| 2.4 优势藻株的筛选 |
| 2.4.1 藻株分离纯化与藻种制备 |
| 2.4.2 微藻培养 |
| 2.4.3 富油藻株筛选 |
| 2.4.4 脂肪酸组成分析 |
| 2.5 营养方式对小球藻C.vulgaris CJ15 生长及代谢的影响 |
| 2.5.1 藻种制备 |
| 2.5.2 微藻培养 |
| 2.5.3 生长曲线及生物量测定 |
| 2.5.4 蛋白质含量测定 |
| 2.5.5 色素含量测定 |
| 2.5.6 可溶性总糖含量测定 |
| 2.5.7 粗纤维含量测定 |
| 2.5.8 油脂含量测定 |
| 2.5.9 脂肪酸成分分析 |
| 2.5.10 氨基酸分析 |
| 2.6 C.vulgaris CJ15 脂肪酸提取预处理与甲酯化工艺优化 |
| 2.6.1 C.vulgaris CJ15 藻细胞破碎方法选择 |
| 2.6.2 甲酯化方法选择 |
| 2.6.3 甲酯化单因素实验 |
| 2.6.4 甲酯化工艺参数响应面优化 |
| 2.6.5 优化参数验证 |
| 2.7 培养条件对C.vulgaris CJ15 生长及不饱和脂肪酸积累的影响 |
| 2.7.1 氮浓度对C.vulgaris CJ15 生长及不饱和脂肪酸积累的影响 |
| 2.7.2 磷浓度对C.vulgaris CJ15 生长及不饱和脂肪酸积累的影响 |
| 2.7.3 p H对 C.vulgaris CJ15 生长及不饱和脂肪酸积累影响 |
| 2.7.4 生长及生物量的测定 |
| 2.7.5 脂肪酸分析 |
| 2.8 C.vulgaris CJ15 转录组测序及不饱和脂肪酸合成途径分析 |
| 2.8.1 微藻培养 |
| 2.8.2 RNA提取 |
| 2.8.3 cDNA建库 |
| 2.8.4 测序数据信息分析及注释 |
| 2.8.5 差异表达基因筛选及不饱和脂肪酸生物合成途径分析 |
| 2.9 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 优势藻株的筛选 |
| 3.1.1 微藻生长及生物量分析 |
| 3.1.2 富油藻株筛选 |
| 3.1.3 脂肪酸成分分析 |
| 3.2 营养方式对小球藻C.vulgaris CJ15 生长及代谢产物的影响 |
| 3.2.1 微藻细胞生长及生物量分析 |
| 3.2.2 蛋白质、可溶性总糖及粗纤维含量 |
| 3.2.3 油脂含量及产量 |
| 3.2.4 色素含量 |
| 3.2.5 脂肪酸组成及含量 |
| 3.2.6 氨基酸组成及含量 |
| 3.3 C.vulgaris CJ15 脂肪酸提取预处理与甲酯化工艺优化 |
| 3.3.1 C.vulgaris CJ15 藻细胞破碎方法选择 |
| 3.3.2 甲酯化方法选择 |
| 3.3.3 单因素实验结果 |
| 3.3.4 甲酯化工艺参数响应面优化 |
| 3.3.5 优化参数验证 |
| 3.4 培养条件对C.vulgaris CJ15 生长及不饱和脂肪酸积累的影响 |
| 3.4.1 氮浓度对C.vulgaris CJ15 生长及不饱和脂肪酸积累的影响 |
| 3.4.2 磷浓度对C.vulgaris CJ15 生长及不饱和脂肪酸积累的影响 |
| 3.4.3 p H对 C.vulgaris CJ15 生长及不饱和脂肪酸积累的影响 |
| 3.5 C.vulgaris CJ15 转录组测序及不饱和脂肪酸合成途径分析 |
| 3.5.1 测序数据质量评估及de novo组装 |
| 3.5.2 基因功能注释 |
| 3.5.3 C.vulgaris CJ15 氮缺乏与正常培养显着差异表达基因(DEGs) |
| 3.5.4 不饱和脂肪酸生物合成途径构建及相关DEGs分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 优势藻株筛选 |
| 4.2 营养方式对小球藻C.vulgaris CJ15 生长及代谢的影响 |
| 4.3 C.vulgaris CJ15 脂肪酸提取预处理与甲酯化工艺优化 |
| 4.4 培养条件对C.vulgaris CJ15 生长及不饱和脂肪酸积累的影响 |
| 4.4.1 氮 |
| 4.4.2 磷 |
| 4.4.3 pH |
| 4.5 C.vulgaris CJ15 转录组测序及不饱和脂肪酸合成途径分析 |
| 5.结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）三角褐指藻LACS酶在脂肪酸代谢中功能的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 微生物来源的长链多不饱和脂肪酸 |
| 1.1.1 长链多不饱和脂肪酸的营养功效 |
| 1.1.2 微生物长链多不饱和脂肪酸的基本合成途径 |
| 1.2 产油硅藻油脂代谢研究进展 |
| 1.2.1 产油硅藻简介 |
| 1.2.2 产油硅藻脂肪酸从头合成途径 |
| 1.2.3 产油硅藻甘油三酯合成途径 |
| 1.2.4 产油硅藻甘油糖脂合成途径 |
| 1.2.5 产油硅藻脂肪酰基在不同脂类中的流向 |
| 1.3 长链酰基CoA合成酶 |
| 1.3.1 长链酰基CoA合成酶简介 |
| 1.3.2 大肠杆菌和酿酒酵母的酰基CoA合成酶的研究进展 |
| 1.3.3 植物长链酰基CoA合成酶的研究进展 |
| 1.3.4 产油微藻的长链酰基CoA合成酶的研究进展 |
| 1.4 硅藻基因组编辑研究进展 |
| 1.4.1 基因组编辑技术简介 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas9 技术简介 |
| 1.4.3 硅藻基因组编辑研究进展 |
| 1.5 本研究的目的和内容 |
| 第二章 ptACSL蛋白亚细胞定位 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 菌株与培养条件 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 培养基与溶液 |
| 2.2.5 引物与质粒 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 三角褐指藻ptACSL1-4 基因的克隆 |
| 2.3.2 蛋白定位预测 |
| 2.3.3 蛋白跨膜预测 |
| 2.3.4 GFP融合表达载体的构建 |
| 2.3.5 ptACSL1的GFP自组装载体构建 |
| 2.3.6 三角褐指藻基因枪转化 |
| 2.3.7 三角褐指藻的GFP载体转化子的筛选和检测 |
| 2.3.8 三角褐指藻共聚焦荧光观察 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 ptACSL1-4的GFP融合载体以及ptACSL1GFP自组装载体的构建 |
| 2.4.2 ptACSL1-5 蛋白的亚细胞定位 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 ptACSL的异源表达和底物特异性分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 菌株与培养条件 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.2.4 培养基与溶液 |
| 3.2.5 引物与质粒 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 ptACSL大肠杆菌表达载体的构建 |
| 3.3.2 大肠杆菌异源表达ptACSL蛋白 |
| 3.3.3 ptACSL蛋白纯化 |
| 3.3.4 ptACSL蛋白酶活测定 |
| 3.4 实验结果和讨论 |
| 3.4.1 大肠杆菌异源表达ptACSL蛋白 |
| 3.4.2 ptACSL蛋白的酶活测定 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 ptACSL蛋白表达模式分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 菌株与培养条件 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.2.4 培养基与溶液 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 三角褐指藻的缺氮培养 |
| 4.3.2 三角褐指藻的不同CO2浓度培养 |
| 4.3.3 ptACSL蛋白的Western blot检测 |
| 4.4 实验结果和讨论 |
| 4.4.1 缺氮条件下ptACSL蛋白的表达模式 |
| 4.4.2 不同CO_2浓度培养下ptACSL蛋白的表达模式 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 ptACSL基因敲除 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 菌株与培养条件 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验仪器 |
| 5.2.4 培养基与溶液 |
| 5.2.5 引物和质粒 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 ptACSL基因的sgRNA设计 |
| 5.3.2 sgRNA表达盒的构建 |
| 5.3.4 基因敲除株的筛选 |
| 5.3.5 基因敲除株的验证 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 ptACSL基因的sgRNA设计 |
| 5.4.2 ptACSL基因敲除突变株的筛选 |
| 5.4.3 ptACSL基因敲除突变株的验证 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）三角褐指藻遗传转化及高产油转化株的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 单细胞真核硅藻—三角褐指藻 |
| 1.2 三角褐指藻基因工程技术研究进展 |
| 1.2.1 前期积累阶段 |
| 1.2.2 外源基因的转化 |
| 1.2.3 亚细胞定位与基因沉默 |
| 1.2.4 三角褐指藻的电转化 |
| 1.2.5 基因编辑技术 |
| 1.3 微藻提高油质含量研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 三角褐指藻的无菌培养 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 藻种及培养 |
| 2.1.2 抗生素的配制及各处理组设置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 藻细胞密度测定 |
| 2.2.2 叶绿素荧光参数的测定 |
| 2.2.3 叶绿素a含量的测定 |
| 2.2.4 岩藻黄质含量的测定 |
| 2.2.5 细菌检测 |
| 2.2.6 藻细胞伴生菌的分离 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 四种抗生素对三角褐指藻生长的影响 |
| 2.3.2 四种抗生素对三角褐指藻色素含量的影响 |
| 2.3.3 四种抗生素对三角褐指藻伴生菌的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 微藻高效基因枪转化方法的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 藻种 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 博来霉素敏感性测定 |
| 3.2.2 表达质粒、仪器与相关耗材的准备 |
| 3.2.3 微载体的制备 |
| 3.2.4 受体细胞的准备 |
| 3.2.5 微载体的包埋及点膜 |
| 3.2.6 基因枪轰击与藻细胞恢复培养 |
| 3.2.7 转化细胞的检测 |
| 3.2.7.1 转化三角褐指藻的检测 |
| 3.2.7.2 转化杜氏盐藻的检测 |
| 3.2.7.3 转化小球藻的检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 培养基的改良及抗生素选择浓度的确定 |
| 3.3.2 三角褐指藻基因枪转化过程的优化 |
| 3.3.2.1 微载体选择、制备、包埋与点膜的优化 |
| 3.3.2.2 基因枪轰击参数的优化 |
| 3.3.2.3 受体细胞处理的优化 |
| 3.3.3 三角褐指藻转化细胞的荧光检测 |
| 3.3.4 改良基因枪转化法与已报道基因枪法转化效率的比较 |
| 3.3.5 杜氏盐藻和小球藻的基因枪转化 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 三角褐指藻藻液直接PCR法的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 藻种 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 单胞藻的培养 |
| 4.2.2 裂解液的配制,藻细胞的裂解方法及藻液DNA的获得 |
| 4.2.3 藻液DNA含量的测量以及不同因素对藻液DNA含量的影响 |
| 4.2.3.1 藻液DNA含量的测量 |
| 4.2.3.2 裂解液种类与裂解时间对藻液DNA含量的影响 |
| 4.2.3.3 藻细胞数与藻细胞生长阶段对藻液DNA含量的影响 |
| 4.2.3.4 藻液DNA加入量对PCR产物的影响 |
| 4.2.3.5 裂解液体积对PCR产物的影响 |
| 4.2.4 引物以及PCR扩增条件 |
| 4.2.5 真核微藻18SrRNA通用引物的设计 |
| 4.2.6 三角褐指藻外源基因的导入以及转化子的筛选 |
| 4.2.7 藻细胞的三维荧光扫描以及荧光显微镜检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 两种微藻藻液PCR法的实验结果 |
| 4.3.2 影响藻液PCR成功因素的分析以及藻液PCR方法的改进 |
| 4.3.3 真核微藻18SrRNA通用引物的设计以及在微藻藻种鉴定中的应用 |
| 4.3.4 改进的藻液PCR法在微藻转化子筛选中的应用 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 沉默内源Pt PEPC1、Pt PEPC2 对三角褐指藻油脂积累影响的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 藻种 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 三角褐指藻总RNA的提取以及c DNA的合成 |
| 5.2.2 Pt PEPC1、Pt PEPC2 的克隆、测序 |
| 5.2.3 Pt PEPC1、Pt PEPC2 基因RNA干扰载体的构建 |
| 5.2.3.1 Pt PEPC1、Pt PEPC2 基因功能生物信息学分析 |
| 5.2.3.2 Pt PEPC1、Pt PEPC2 基因RNAi载体的构建 |
| 5.2.4 三角褐指藻的转化及阳性转化子的筛选 |
| 5.2.5 RNA干扰转化株Pt PEPC1、Pt PEPC2 基因表达量检测 |
| 5.2.6 RNA干扰转化株PEPC酶活性检测 |
| 5.2.7 生长曲线绘制以及叶绿素荧光参数测量 |
| 5.2.8 三角褐指藻中性脂相对含量的测定 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 Pt PEPC1、Pt PEPC2 基因的克隆、测序与比对 |
| 5.3.1.1 三角褐指藻总RNA提取结果 |
| 5.3.1.2 Pt PEPC1、Pt PEPC2 基因的克隆 |
| 5.3.2 RNA干扰载体的构建 |
| 5.3.3 转化子的筛选 |
| 5.3.4 RNA干扰株PTPEPC1和Pt PEPC2 基因相对表达量检测 |
| 5.3.5 RNA干扰株PEPC酶活性检测 |
| 5.3.6 RNA干扰株生理生化参数检测 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 过表达外源At LEC1,At L1L转录因子对三角褐指藻油脂积累影响的研究 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 植株 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 拟南芥总RNA提取以及c DNA合成 |
| 6.2.2 At LEC1,At L1L克隆、测序 |
| 6.2.3 At LEC1,At L1L密码子优化 |
| 6.2.4 At LEC1,At L1L过表达载体的构建 |
| 6.2.5 三角褐指藻的转化及阳性转化子的筛选 |
| 6.2.6 转化子外源基因亚细胞定位 |
| 6.2.7 转化子Southern杂交 |
| 6.2.8 转化子Western杂交 |
| 6.2.9 藻细胞生理参数检测 |
| 6.2.10 藻细胞中性脂尼罗红染色 |
| 6.2.11 藻细胞细胞组分含量检测 |
| 6.2.12 藻细胞总脂肪酸检测 |
| 6.2.13 转录组测序 |
| 6.2.14 qPCR法验证转录组差异表达基因 |
| 6.2.15 代谢组学分析 |
| 6.2.15.1 样本预处理 |
| 6.2.15.2 色谱条件 |
| 6.2.15.3 质谱条件 |
| 6.2.15.4 数据处理 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 At LEC1,At L1L克隆、测序结果 |
| 6.3.2 At LEC1,At L1L密码子优化结果 |
| 6.3.3 外源基因转化表达载体的构建 |
| 6.3.4 阳性转化子的筛选 |
| 6.3.5 转化子亚细胞定位结果 |
| 6.3.6 转化子Southern杂交结果 |
| 6.3.7 转化子Western杂交结果 |
| 6.3.8 转化子光合荧光及生理参数检测 |
| 6.3.9 藻细胞中性脂的尼罗红染色结果 |
| 6.3.10 藻细胞组分分析 |
| 6.3.11 藻细胞总脂肪酸含量检测 |
| 6.3.12 转录组测序分析结果 |
| 6.3.12.1 参考序列比对分析 |
| 6.3.12.2 基因表达差异分析 |
| 6.3.12.3 差异表达基因的GO二级注释分类 |
| 6.3.12.4 差异表达基因的KEGG通路富集 |
| 6.3.13 qPCR法验证结果 |
| 6.3.14 代谢组学分析结果 |
| 6.3.14.1 各组样本的典型代谢谱图 |
| 6.3.14.2 正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA) |
| 6.3.14.3 显着性差异代谢物 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 外源基因的密码子优化 |
| 6.4.2 At LEC1和At L1L转录因子促进藻细胞脂质合成 |
| 结论 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（7）三角褐指藻脂肪酸去饱和酶基因家族分析及高产EPA藻株的选育（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1.1 三角褐指藻简介 |
| 1.2 国内外研究状况 |
| 1.3 三角褐指藻转化方法 |
| 1.4 二十碳五烯酸 |
| 1.4.1 二十碳五烯酸简介及功能 |
| 1.4.2 二十碳五烯酸合成途径 |
| 1.5 脂肪酸去饱和酶 |
| 1.5.1 脂肪酸去饱和酶的简介 |
| 1.5.2 脂肪酸去饱和酶作用机制 |
| 1.5.3 脂肪酸去饱和酶发展前景 |
| 1.6 脂肪酸去饱和酶基因家族研究 |
| 1.7 全基因组测序技术 |
| 1.8 三角褐指藻诱变育种研究 |
| 1.9 研究内容 |
| 1.10 研究意义 |
| 1.11 创新点 |
| 1.12 技术路线 |
| 第一章 藻种鉴定、纯化、保藏及基因组大小的预估 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要的仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 藻种培养 |
| 1.2.2 藻种鉴定 |
| 1.2.3 藻种无菌化 |
| 1.2.4 藻种保藏 |
| 1.2.5 三角褐指藻基因组大小的预估 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 形态学鉴定结果 |
| 1.3.2 三角褐指藻的细胞密度与光吸收值的对应关系 |
| 1.3.3 三角褐指藻的生长曲线 |
| 1.3.4 分子生物学的鉴定结果 |
| 1.3.5 三角褐指藻无菌化培养结果 |
| 1.3.6 藻种的保藏结果 |
| 1.3.7 三角褐指藻基因组大小的预估结果 |
| 1.4 讨论与小结 |
| 第二章 三角褐指藻中脂肪酸去饱和酶基因家族分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 三角褐指藻去饱和酶基因家族鉴定 |
| 2.2.2 基因家族成员序列特征分析 |
| 2.2.3 基因家族序列motif分析 |
| 2.2.4 基因在染色体上定位 |
| 2.2.5 基因家族进化树构建和基因结构分析 |
| 2.2.6 Δ5 去饱和酶基因(PTD5α)编码的蛋白序列分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 三角褐指藻去饱和酶基因家族(FAD family)鉴定 |
| 2.3.2 基因家族成员的序列特征分析 |
| 2.3.3 FAD基因家族motif分析 |
| 2.3.4 基因在染色体上的定位 |
| 2.3.5 基因家族基因结构分析 |
| 2.3.6 FAD基因家族进化树分析 |
| 2.3.7 PTD5α编码蛋白(ptd5α)基本性质分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 Δ5-去饱和酶基因的克隆及过表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 藻株 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 三角褐指藻RNA的提取 |
| 3.2.2 Δ5-c DNA第一链的合成 |
| 3.2.3 Δ5 去饱和酶基因的克隆 |
| 3.2.4 过表达载体p Pha-T1-Δ5 的构建 |
| 3.2.5 电击转化三角褐指藻 |
| 3.2.6 阳性转化子的筛选及验证 |
| 3.2.7 脂肪酸标准曲线的绘制 |
| 3.2.8 脂肪酸的提取及测定 |
| 3.2.9 荧光定量PCR的检测 |
| 3.2.10 野生藻株与突变藻株基因组重测序 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Δ5 去饱和酶基因的克隆 |
| 3.3.2 Δ5 基因过表达载体pPha-T1 的构建和鉴定 |
| 3.3.3 阳性转化子的筛选 |
| 3.3.4 阳性转化子的验证 |
| 3.3.5 目的基因的荧光定量检测 |
| 3.3.6 脂肪酸标品的检测 |
| 3.3.7 突变藻株在各个时期脂肪酸含量测定 |
| 3.3.8 野生藻株与突变藻株基因组重测序的结果 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第四章 三角褐指藻ARTP诱变育种 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 藻种准备 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 诱变时间的筛选 |
| 4.2.2 致死率计算 |
| 4.2.3 诱变藻株的初筛 |
| 4.2.4 诱变藻株的复筛 |
| 4.2.5 诱变藻株与野生藻株的脂肪酸的测定 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 致死率统计 |
| 4.3.2 诱变藻株初筛 |
| 4.3.3 诱变藻株复筛 |
| 4.3.4 诱变藻株与野生藻株表型及脂肪酸的测定 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 附录1 测序序列 |
| 附录2 相关试剂及缓冲液配方 |
| 附录3 英文缩写检索 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）三角褐指藻三磷酸甘油脱氢酶两种亚型的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 微藻及其应用价值 |
| 1.2 微藻的遗传转化 |
| 1.3 三角褐指藻 |
| 1.4 甘油三磷酸脱氢酶 |
| 1.5 研究创新点 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验藻种及菌种培养 |
| 2.2 三角褐指藻3-磷酸甘油脱氢酶基因功能分析预测 |
| 2.3 三角褐指藻3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)质粒构建 |
| 2.4 三角褐指藻转化藻株构建及筛选 |
| 2.5 三角褐指藻GPDH基因相关转化藻株生理生化指标检测 |
| 2.6 实验数据采集及分析 |
| 第三章 GPDH2,GPDH3 单独过表达藻株构建及功能研究 |
| 3.1 GPDH2和GPDH3 蛋白序列功能分析 |
| 3.2 GPDH2,GPDH3 过表达载体的构建 |
| 3.3 GPDH2,GPDH3 过表达转化藻株的筛选验证 |
| 3.4 GPDH2,GPDH3 过表达转化藻株生长速率、光合作用分析 |
| 3.5 转化藻胞内总蛋白、总碳水化合物含量测定 |
| 3.6 转化藻株胞内、胞外甘油含量测定 |
| 3.7 转化藻株油体形态、大小观察 |
| 3.8 转化藻株总脂含量、成分分析 |
| 3.9 转化藻株脂肪酸成分分析 |
| 3.10 讨论 |
| 3.11 小结 |
| 第四章 GPDH2与GPDH3 转录水平干扰下功能的研究 |
| 4.1 WMD3– Web设计的GPDH2和GPDH3 miRNa结果 |
| 4.2 GPDH2和GPDH3 人工miRNA前体组装 |
| 4.3 AMiG2和AMiG3 转化藻筛选 |
| 4.4 AMiG2和AMiG3 转化藻筛转录水平分析 |
| 4.5 AMiG2和AMiG3 转化藻株胞内甘油含量分析 |
| 4.6 AMiG2和AMiG3 转化藻筛甘油三酯含量分析 |
| 4.7 讨论 |
| 4.8 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）三角褐指藻甘油三酯合成及累积途径相关重要节点的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 全球能源危机日益严峻 |
| 1.1.2 微藻作为新型生物质能源原料受到广泛关注 |
| 1.2 传统方法提高微藻脂质积累 |
| 1.3 微藻脂质代谢途径概况 |
| 1.4 微藻甘油三酯积累相关代谢途径重要节点研究现状 |
| 1.4.1 微藻遗传转化体系的建立 |
| 1.4.2 脂质合成途径关键节点对微藻脂质累积的作用 |
| 1.4.3 其他代谢途径关键节点对微藻脂质累积的作用 |
| 1.5 选题的意义以及设计思路 |
| 1.6 主要创新点 |
| 1.7 中英文对照表 |
| 第二章 三角褐指藻AGPAT1调控叶绿体TAG合成 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 藻种培养 |
| 2.3.2 三角褐指藻AGPAT1基因分析 |
| 2.3.3 三角褐指藻AGPAT1基因克隆 |
| 2.3.4 利用同源重组法构建表达载体 |
| 2.3.5 电转化方法将载体导入至三角褐指藻 |
| 2.3.6 利用分子生物学手段鉴定转化藻 |
| 2.3.7 转化藻AGPAT1蛋白酶活检测 |
| 2.3.8 转化藻生理指标检测 |
| 2.3.9 转化藻细胞组分检测 |
| 2.3.10 共聚焦观察微藻形态和油体 |
| 2.3.11 胶体金法免疫电镜观察蛋白定位 |
| 2.3.12 统计学分析 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 三角褐指藻AGPAT1序列分析 |
| 2.4.2 AGPAT1成功导入三角褐指藻并表达 |
| 2.4.3 过表达AGPAT1不影响生长和光合速率 |
| 2.4.4 过表达AGPAT1改变初级代谢产物的含量 |
| 2.4.5 过表达AGPAT1影响TAG合成通路中其他关键基因的表达 |
| 2.4.6 过表达AGPAT1显着提高脂质积累 |
| 2.4.7 过表达AGPAT1改变微藻脂肪酸组分 |
| 2.4.8 AGPAT1定位于叶绿体中并参与叶绿体TAG合成 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 GPAT1和AGPAT1对TAG生成过程中脂肪酸选择性的调控 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 藻种培养 |
| 3.3.2 三角褐指藻GPAT1和AGPAT1基因克隆 |
| 3.3.3 利用同源重组法构建表达载体 |
| 3.3.4 电转化方法将双质粒同时导入至三角褐指藻 |
| 3.3.5 利用分子生物学手段鉴定转化藻 |
| 3.3.6 转化藻GPAT1和AGPAT1蛋白酶活检测 |
| 3.3.7 转化藻生理指标检测 |
| 3.3.8 转化藻亚细胞定位检测 |
| 3.3.9 转化藻细胞组分检测 |
| 3.3.10 转化藻TAG中脂肪酸成分检测 |
| 3.3.11 转化藻关键通路中基因转录水平检测 |
| 3.3.12 芝麻酚处理后转化藻生理指标检测 |
| 3.3.13 浅蓝菌素处理后转化藻总脂肪酸含量检测 |
| 3.3.14 统计学分析 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 双基因GPAT1和AGPAT1成功导入三角褐指藻并表达 |
| 3.4.2 GPAT1和AGPAT1均定位于三角褐指藻叶绿体 |
| 3.4.3 GPAT1和AGPAT1双基因过表达提高对数期中期微藻生长 |
| 3.4.4 GPAT1和AGPAT1双基因过表达改变初级代谢产物的含量 |
| 3.4.5 GPAT1和AGPAT1双基因过表达促进脂质过量生产 |
| 3.4.6 双基因GPAT1和AGPAT1过表达协调其他通路关键基因的转录水平 |
| 3.4.7 GPAT1和AGPAT1双基因过表达通过原核途径提高脂肪酸合成 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 三角褐指藻MCAT和D5b联合作用富集长链多不饱和脂肪酸 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 藻种培养 |
| 4.3.2 三角褐指藻MCAT和PtD5b基因克隆 |
| 4.3.3 利用同源重组法构建表达载体 |
| 4.3.4 电转化方法将双质粒同时导入三角褐指藻 |
| 4.3.5 利用分子生物学手段鉴定转化藻 |
| 4.3.6 转化藻MCAT蛋白酶活检测 |
| 4.3.7 转化藻密度和生长周期测定 |
| 4.3.8 转化藻中性脂含量检测 |
| 4.3.9 转化藻总脂含量检测 |
| 4.3.10 转化藻总脂各成分含量检测 |
| 4.3.11 转化藻脂肪酸含量检测 |
| 4.3.12 统计学分析 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 三角褐指藻MCAT和PtD5b序列分析 |
| 4.4.2 分子水平鉴定MCAT和PtD5b成功在三角褐指藻中整合并表达 |
| 4.4.3 过表达MCAT和PtD5b不影响三角褐指藻的生理状态 |
| 4.4.4 MCAT和PtD5b联合作用提升了三角褐指藻脂质累积 |
| 4.4.5 过表达MCAT和PtD5b造成系统性代谢调控引发LC-PUFA积累 |
| 4.4.6 过表达MCAT和PtD5b造成不同脂成分中LC-PUFAs分布改变 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 三角褐指藻油体蛋白参与油体生物发生和TAG积累 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 藻种培养 |
| 5.3.2 实时定量PCR检测三角褐指藻LDP1转录水平 |
| 5.3.3 三角褐指藻LDP1基因克隆 |
| 5.3.4 利用同源重组法构建表达载体 |
| 5.3.5 电转化方法将双质粒同时导入三角褐指藻 |
| 5.3.6 利用分子生物学手段鉴定转化藻 |
| 5.3.7 转化藻脂质含量和脂肪酸组分检测 |
| 5.3.8 共聚焦显微观察微藻形态和油体 |
| 5.3.9 转化藻亚细胞定位检测 |
| 5.3.10 三角褐指藻油体的分离 |
| 5.3.11 油体蛋白的提取、SDS-PAGE分离和蛋白鉴定 |
| 5.3.12 统计学分析 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 三角褐指藻LDP1序列分析 |
| 5.4.2 缺氮和缺磷条件下LDP1的转录水平 |
| 5.4.3 分子生物学方法鉴定重组质粒导入三角褐指藻 |
| 5.4.4 LDP1参与三角褐指藻脂质生物合成和积累 |
| 5.4.5 LDP1参与转化藻中脂肪酸组分的改变 |
| 5.4.6 LDP1调控TAG和脂肪酸合成相关基因转录表达 |
| 5.4.7 三角褐指藻油体蛋白组学鉴定显示LDP1是主要组成蛋白 |
| 5.4.8 亚细胞定位显示LDP1位于油体 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 三角褐指藻内源和人源PNPLA3调控三角褐指藻TAG合成 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 实验试剂 |
| 6.2.2 实验仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 藻种培养 |
| 6.3.2 三角褐指藻PNPLA3基因分析 |
| 6.3.3 三角褐指藻PNPLA3基因克隆和人源PNPLA3基因优化 |
| 6.3.4 利用同源重组法构建表达载体 |
| 6.3.5 电转化方法将质粒导入三角褐指藻 |
| 6.3.6 利用分子生物学手段鉴定转化藻 |
| 6.3.7 转化藻生理指标检测 |
| 6.3.8 转化藻脂质含量检测 |
| 6.3.9 共聚焦显微观察微藻形态和油体 |
| 6.3.10 统计学分析 |
| 6.4 实验结果与讨论 |
| 6.4.1 三角褐指藻PNPLA3序列分析 |
| 6.4.2 内源PNPLA3和人源Pnpla3I148M导入三角褐指藻并表达 |
| 6.4.3 过表达内源PNPLA3和人源Pnpla3I148M不影响生长和光合速率 |
| 6.4.4 过表达内源PNPLA3和人源Pnpla3I148M显着提高微藻脂质含量 |
| 6.4.5 过表达内源PNPLA3和人源Pnpla3I148M改变微藻脂肪酸组分 |
| 6.5 小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表的论文和奖励 |
| 致谢 |
（10）球等鞭金藻生产岩藻黄素和油脂的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中文文摘 |
| 绪论 |
| 1.1 球等鞭金藻 |
| 1.2 岩藻黄素的研究进展 |
| 1.2.1 岩藻黄素简介 |
| 1.2.2 岩藻黄素的生物合成途径 |
| 1.2.3 岩藻黄素的生物学活性 |
| 1.2.4 岩藻黄素的提取与分离纯化检测 |
| 1.3 球等鞭金藻油脂的研究进展 |
| 1.3.1 球等鞭金藻油脂 |
| 1.3.2 不饱和脂肪酸的生物学功能 |
| 1.3.3 不饱脂肪酸代谢途径 |
| 1.3.4 油脂的提取与脂肪酸检测 |
| 1.4 球等鞭金藻的培养 |
| 1.5 诱变育种 |
| 1.6 本课题研究的意义、内容及技术路线 |
| 1.6.1 本课题研究的意义 |
| 1.6.2 本课题研究的内容 |
| 1.6.3 本课题研究技术路线 |
| 第一章 藻种的分离纯化、保藏鉴定与基因组大小预测 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.1.1 主要材料、仪器设备 |
| 1.2 分离纯化方法 |
| 1.2.1 毛细吸管分离法 |
| 1.2.2 稀释分离法 |
| 1.2.3 固体平板涂布、划线分离法 |
| 1.2.4 抗生素除菌 |
| 1.3 保藏方法 |
| 1.3.1 液体继代保藏 |
| 1.3.2 低温甘油保藏 |
| 1.3.3 低温甘油二甲基亚砜混合保藏 |
| 1.3.4 低温脯氨酸二甲基亚砜混合保藏 |
| 1.3.5 固液双相保藏 |
| 1.3.6 固体平板、试管斜面保藏 |
| 1.4 藻种鉴定 |
| 1.4.1 形态学鉴定 |
| 1.4.2 分子生物学鉴定 |
| 1.5 基因组大小预测 |
| 1.6 结果与分析 |
| 1.6.1 分离纯化方法结果分析 |
| 1.6.2 保藏方法结果分析 |
| 1.6.3 藻种鉴定结果分析 |
| 1.6.4 基因组大小预测结果分析 |
| 1.7 小结与讨论 |
| 第二章 岩藻黄素的提取、分离纯化与检测鉴定 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 主要材料、仪器设备 |
| 2.2 岩藻黄素的提取工艺优化 |
| 2.2.1 原料来源的预处理 |
| 2.2.2 岩藻黄素的提取条件优化 |
| 2.2.3 球等鞭金藻岩藻黄素提取工艺优化 |
| 2.3 岩藻黄素分离纯化 |
| 2.3.1 硅胶板薄层层析定性分析 |
| 2.3.2 硅胶柱层析分离纯化 |
| 2.4 岩藻黄素的HPLC和UPLC检测方法建立 |
| 2.4.1 超高效液相建立检测岩藻黄素方法 |
| 2.4.2 高效液相色谱建立检测岩藻黄素方法 |
| 2.5 岩藻黄素的LC-MS鉴定 |
| 2.5.1 岩藻黄素高效液相色谱—串联质谱联用仪的鉴定 |
| 2.6 结果与分析 |
| 2.6.1 岩藻黄素的提取优化结果分析 |
| 2.6.2 岩藻黄素硅胶柱层析分离纯化结果分析 |
| 2.6.3 岩藻黄素的UPLC与HPLC检测方法的建立结果分析 |
| 2.6.4 岩藻黄素的LC-MS鉴定结果分析 |
| 2.7 小结与讨论 |
| 第三章 球等鞭金藻培养优化与絮凝采收 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 主要材料、仪器设备 |
| 3.2 球等鞭金藻培养条件的优化 |
| 3.2.1 多功能酶标仪测定680nm处细胞密度 |
| 3.2.2 光照强度对球等鞭金藻生长情况的影响 |
| 3.2.3 pH对球等鞭金藻生长情况的影响 |
| 3.2.4 光照周期对球等鞭金藻生长情况的影响 |
| 3.2.5 培养温度对球等鞭金藻生长情况的影响 |
| 3.2.6 海水盐度对球等鞭金藻生长情况的影响 |
| 3.3 有机碳源、氮源、磷源、铁源对球等鞭金藻生长情况的影响 |
| 3.3.1 有机碳源葡萄糖和甘蔗糖蜜对球等鞭金藻生长情况的影响 |
| 3.3.2 硝酸钠、尿素、硝酸铵对球等鞭金藻生长情况的影响 |
| 3.3.3 磷酸二氢钠和氯化铁对球等鞭金藻生长情况的影响 |
| 3.4 生产球等鞭金藻岩藻黄素的培养基正交优化实验 |
| 3.5 提高球等鞭金藻油脂含量的培养基正交优化实验 |
| 3.6 通气扩大培养球等鞭金藻实验 |
| 3.6.1 三角瓶5L通气扩大培养实验 |
| 3.6.2 光生物反应器50 L通气扩大培养实验 |
| 3.7 球等鞭金藻絮凝采收实验 |
| 3.8 结果与分析 |
| 3.8.1 球等鞭金藻培养条件的优化结果分析 |
| 3.8.2 有机碳源、氮源、磷源、铁源对球等鞭金藻生长情况的影响结果分析 |
| 3.8.3 生产球等鞭金藻岩藻黄素的培养基正交优化实验结果分析 |
| 3.8.4 提高球等鞭金藻总油脂的培养基正交优化试验结果分析 |
| 3.8.5 通气扩大培养球等鞭金藻实验结果分析 |
| 3.8.6 球等鞭金藻絮凝采收实验结果分析 |
| 3.9 小结与讨论 |
| 第四章 不同光质诱导和氮磷胁迫对岩藻黄素、脂肪酸代谢积累的影响 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 主要材料、仪器设备 |
| 4.2 不同光质对球等鞭金藻岩藻黄素代谢积累的影响 |
| 4.2.1 红光、蓝光、绿光、暗光对球等鞭金藻岩藻黄素代谢积累的影响 |
| 4.2.2 弱光和白光+绿光混合光质对球等鞭金藻岩藻黄素代谢积累的影响 |
| 4.3 红光、蓝光、绿光、暗光对球等鞭金藻脂肪酸代谢积累的影响 |
| 4.4 氮磷胁迫对球等鞭金藻岩藻黄素代谢积累的影响 |
| 4.5 氮磷胁迫对球等鞭金藻脂肪酸代谢积累的影响 |
| 4.6 通气培养对球等鞭金藻脂肪酸代谢积累的影响 |
| 4.7 结果与分析 |
| 4.7.1 不同光质对球等鞭金藻岩藻黄素代谢积累的影响结果分析 |
| 4.7.2 不同光质对球等鞭金藻脂肪酸代谢积累的影响结果分析 |
| 4.7.3 氮磷胁迫对球等鞭金藻岩藻黄素代谢积累的影响结果分析 |
| 4.7.4 氮磷胁迫对球等鞭金藻脂肪酸代谢积累的影响结果分析 |
| 4.7.5 通气培养对球等鞭金藻脂肪酸代谢积累的影响结果分析 |
| 4.8 小结与讨论 |
| 第五章 球等鞭金藻紫外诱变与等离子体诱变育种 |
| 5.1 材料与仪器 |
| 5.1.1 主要材料、仪器设备 |
| 5.2 球等鞭金藻的紫外诱变育种 |
| 5.3 球等鞭金藻等离子体诱变育种 |
| 5.4 球等鞭金藻突变藻株的初筛与培养 |
| 5.5 球等鞭金藻突变藻株的复筛与培养 |
| 5.6 突变藻株与原始藻株的比生长速率、干重、岩藻黄素含量比较 |
| 5.7 突变藻株与原始藻株的脂肪酸分析 |
| 5.8 结果与分析 |
| 5.9 小结与讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 附录1 18S rDNA拼接序列 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、三角褐指藻不同藻株脂肪酸组成的研究（论文参考文献）
- [1]过表达甘油激酶三角褐指藻藻株富集油脂的研究[J]. 侯兴国,方琰,白欢,胡莎莎,卿人韦,兰利琼. 四川大学学报(自然科学版), 2020(06)
- [2]三角褐指藻多不饱和脂肪酸合成的研究[D]. 雷娜娜. 福建师范大学, 2020(12)
- [3]三角褐指藻隐花色素/光解酶的研究[D]. 赵靖悦. 福建师范大学, 2020(12)
- [4]微藻不饱和脂肪酸积累调控研究[D]. 王秀海. 海南大学, 2020(02)
- [5]三角褐指藻LACS酶在脂肪酸代谢中功能的初步研究[D]. 郝夏晖. 中国农业科学院, 2020
- [6]三角褐指藻遗传转化及高产油转化株的研究[D]. 陈禹先. 辽宁师范大学, 2020(01)
- [7]三角褐指藻脂肪酸去饱和酶基因家族分析及高产EPA藻株的选育[D]. 叶浩盈. 福建师范大学, 2019(12)
- [8]三角褐指藻三磷酸甘油脱氢酶两种亚型的功能研究[D]. 魏伟. 暨南大学, 2019(02)
- [9]三角褐指藻甘油三酯合成及累积途径相关重要节点的研究[D]. 汪翔. 暨南大学, 2018(12)
- [10]球等鞭金藻生产岩藻黄素和油脂的研究[D]. 陈建楠. 福建师范大学, 2018(05)