一种基于重组截短Gcaa407～614蛋白的赤羽病病毒抗体间接ELISA方法的建立

论文摘要

为建立一种检测赤羽病病毒（Akabane virus,AKAV）抗体的ELISA方法,对Gc蛋白从407位至614位氨基酸的编码序列,经密码子优化后进行基因合成,然后克隆至重组表达载体PET-32a（+）,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,用1 mmol/L IPTG在37℃进行诱导表达。用Ni+2-NTA树脂亲和层析方法纯化重组蛋白(trGcaa407614),以Western blotting检测其抗原性;用纯化trGcaa407614建立间接ELISA方法(trGcaa407614-ELISA),并评价该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示:重组蛋白trGcaa407614以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达,经Ni+2-NTA树脂亲和层析纯化后的浓度2.4 mg/mL,纯度为94%,对山羊抗AKAV阳性血清呈现较好的抗原反应性;所建立的trGcaa407614-ELISA方法的最佳抗原包被浓度为4.0μg/mL,血清稀释度为1:80,血清阴阳性的OD450临界值为0.318;该方法对AKAV阳性血清呈特异性反应,组内试验和组间试验的变异系数均小于10%。用该方法对273份进口牛血清进行AKAV抗体检测,发现10份血清为阳性。总之,本研究建立的trGcaa407614-ELISA方法为血清样品中赤羽病病毒抗体的检测提供了有效手段。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 菌株、参考血清和主要试剂
•   1.2 AKAV Gc蛋白抗原表位区预测和主要抗原区原核表达载体的构建
•   1.3 重组蛋白诱导表达
•   1.4 重组蛋白纯化与复性
•   1.5 重组蛋白抗原性鉴定
•   1.6 间接ELISA方法建立
•     1.6.1 抗原最佳包被浓度及抗体最适稀释倍数确定
•     1.6.2 最佳封闭液确定
•     1.6.3酶标抗体最佳工作浓度确定
•     1.6.4 阴阳性临界值判定标准确定
•     1.6.5 特异性试验
•     1.6.6敏感性试验
•     1.6.7 重复性试验
•   1.7 临床样本检测
• 2 结果
•   2.1 Gc蛋白主要抗原区预测及重组表达载体构建
•   2.2 重组蛋白诱导表达及纯化
•   2.3 重组蛋白Western blot鉴定
•   2.4 间接ELISA方法的建立
•     2.4.1 抗原最佳包被浓度及抗体最适稀释倍数确定
•     2.4.2 最佳封闭液的确定
•     2.4.3 酶标抗体最佳工作浓度确定
•     2.4.4阴阳性临界值判定标准确定
•     2.4.5 特异性试验
•     2.4.6敏感性试验
•     2.4.7 重复性试验
•   2.5 临床样本检测
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 王建华,赵丹,陈本龙,张俊哲,王玉玲,肖妍

关键词: 赤羽病病毒,蛋白,截短蛋白,原核表达,间接,抗体检测

来源: 中国动物检疫 2019年05期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 天津海关

基金: 天津市应用基础与前沿技术研究计划项目(15JCYBJC30500),海关总署科技计划项目(2017IK125)

分类号: S852.65

页码: 85-92

总页数: 8

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