1.哈尔滨医科大学黑龙江哈尔滨150081；
2.哈尔滨医科大学附属第一医院黑龙江哈尔滨150001
摘要：最新研究表明，cGAS/STING信号通路必须通过诱导产生I型干扰素来激活基因敲除小鼠模型的固有免疫和适应性免疫，进而发挥抗肿瘤免疫。cGAS/STING信号通路在各种人类癌症中都检测到有所表达，但这种信号通路在人类癌症免疫中的作用至今尚未清楚。我们的研究发现，cGAS/STING信号通路中的四个关键分子（cGAS，STING，TBK1和IRF3）在卵巢癌组织中表达相比于正常组织较低。研究还发现，cGAS/STING信号通路的表达水平与卵巢癌组织微环境的免疫细胞浸润之间有相关性。然而，cGAS/STING信号通路的表达水平不能预测卵巢癌患者的预后。这项研究表明，在施用激动剂激活STING抗肿瘤免疫疗法之前必须充分评估cGAS/STING信号通路，并明确其在肿瘤发生和肿瘤免疫中的功能。
关键词：卵巢癌；cGAS；STING；TBK1；IRF3；免疫细胞浸润；预后；干扰素
1.介绍
虽然免疫系统与癌症之间关系的研究已有近60年的历史，但免疫系统如何识别和杀死癌细胞的确切机制仍是未知。目前，人们普遍认为固有免疫和适应性免疫在肿瘤免疫监视中起重要作用，Ⅰ型干扰素（interferon，IFN）在连接固有免疫和适应性免疫引发有效的抗肿瘤免疫的过程中至关重要，因为抗原呈递树突状细胞（DC）产生的Ⅰ型干扰素在肿瘤微环境中，不仅激活固有免疫反应，还促进T细胞交叉激活和浸润[1]。大量研究表明细胞溶质双链DNA在各种细胞类型中诱导Ⅰ型干扰素的表达[2]。然而，直到2008年，当鉴定出干扰素基因刺激物（STING）时，细胞溶质DNA刺激的Ⅰ型干扰素诱导机制才被真正揭示[3]。
最近的证据表明，cGAS（环状GMP-AMP合酶）/STING信号传导对于诱导Ⅰ型干扰素是至关重要的，并且在癌症免疫中起重要作用。研究还表明，由DNA病毒感染，基因组DNA损伤或线粒体DNA渗漏引起的癌细胞中的细胞质dsDNA结合并激活环状GMP-AMP合成酶（cGAS），这种酶催化环状GMP-AMP的产生（cGAMP），cGAMP是一种结合并激活STING的环状二核苷酸[4]。激活的STING改变其构象以募集TANK结合激酶1（TBK1），然后磷酸化干扰素调节因子3（IRF3）。磷酸化的IRF3易位到细胞核中并诱导产生I型干扰素和与免疫调节有关的其他细胞因子[5]。
作为Ⅰ型干扰素的刺激物，cGAS/STING通路在体内引发自发的抗肿瘤T细胞应答[6]，而STING或IRF3的缺乏显示出抗肿瘤的自发性T细胞应答受损[7]。此外，肿瘤内注射STING激动剂可促进小鼠黑色素瘤和胶质瘤模型中T细胞向肿瘤微环境的浸润[8，9]。在大多数情况下，化学疗法和放射疗法通过诱导DNA损伤来破坏肿瘤细胞，这种疗法会导致DNA片段释放到胞质中，从而激活cGAS/STING通路[7]。有一些研究表明，STING激动剂也可以提高某些肿瘤进行免疫检查点阻滞治疗的效率[10]。然而，STING缺陷患者对免疫疗法和放化疗显示较差的治疗效果[7]。这些研究表明cGAS/STING通路在抗肿瘤免疫和癌症治疗中起重要作用。
虽然已经证明cGAS/STING途径对于各种小鼠模型中的抗肿瘤免疫是必须的，并且有研究表明该信号传导通路也是人类的某些癌症中的重要调节因子[11，12]；迄今尚未对人类癌症中cGAS/STING信号通路的表达进行广泛检测并挖掘该信号传导通路在人类癌症免疫中的作用。在本研究中，我们检测了cGAS/STING信号通路中四种关键分子（cGAS，STING，TBK1和IRF3）的表达谱，探讨了它们在人体卵巢癌肿瘤组织免疫细胞浸润中的潜在作用，并通过分析卵巢癌的TCGA数据揭示了癌症患者的预后。
2.结果
2.1cGAS/STING信号通路中MB21D1，TMEM173，TBK1和IRF3在卵巢癌中的表达情况。
我们首先检测了在cGAS/STING通路中的四个重要基因的表达：编码cGAS的MB21D1、编码STING的TMEN173、TBK1和IRF3。通过GEPIA网站（http：//gepia.cancer-pku.cn/）分析这四个基因在卵巢癌（来源于TCGA数据库）与正常卵巢组织（来源于GETx数据库）间的表达差异。TMEM173、TBK1和IRF3的mRNA水平在卵巢癌中有明显下降，但MB21D1表达有所升高。由此可见cGAS/STING通路在卵巢癌中受抑制。
2.2MB21D1，TMEM173，TBK1和IRF3基因在卵巢癌患者中突变率较高
在先前的一项研究中已经报道了由TMEM173基因中单核苷酸突变引起的STING感应cGAMP的能力受损[13]，表明基因突变也可能影响cGAS/STING信号通路的活性。因此，我们评估了MB21D1，TMEM173，TBK1和IRF3基因在卵巢癌中的突变状态。结果显示MB21D1，TMEM173，TBK1和IRF3基因在卵巢癌中存在各种突变。其中MB21D1，TMEM173，TBK1和IRF3的突变率分别为1%、2.9%、1.6%和2.9%。MB21D1、TMEM173和TBK1主要发生扩增突变，TMEM173还有少量缺失突变，TBK1有少量错义突变，IRF3三种突变类型都存在，且发生频率相近。
尽管这些基因在卵巢癌中的突变率相对较高，但由于突变的氨基酸不在这些基因的功能区中，似乎大多数突变可能不会影响STING结合环状二鸟苷酸的能力，cGAS的酶活性，TBK1的激酶活性以及IRF3作为转录因子的能力。
2.3分析在卵巢癌中MB21D1，TMEM173，TBK1或IRF3基因表达与肿瘤微环境免疫浸润的相关性
动物模型的证据表明，cGAS/STING信号通路在抗肿瘤免疫中起重要作用。因此，我们评估了cGAS/STING信号通路中四种关键分子的表达与肿瘤微环境中免疫细胞浸润之间的相关性，这是卵巢癌中抗癌免疫的关键过程。
为了研究每个基因对免疫细胞浸润的影响，评估了总共28个肿瘤浸润的白细胞亚群，包括16个适应性免疫细胞和12个先天免疫细胞。节点大小表示相关性，颜色表示相关关系。我们发现MB21D1和TMEM173的表达与免疫细胞浸润呈正相关。其中MB21D1与活化的CD4T细胞、2型辅助T细胞和自然杀伤T细胞浸润的相关性较大；而TMEM173与CD4记忆T细胞、CD8效应记忆T细胞和17型辅助T细胞浸润的相关性较大。与之相反的是TBK1和IRF3基因的表达与免疫细胞浸润的相关性较小甚至是负相关。TBK1与激活的CD4T细胞和2型辅助T细胞的浸润呈正相关且相关性较大，这与MB21D1相似，但其与其他免疫浸润细胞相关性较小或负相关。而IRF3总体与免疫细胞的浸润无相关关系。这些结果表明cGAS/STING信号在抗癌免疫中的作用不一致。
2.4MB21D1，TMEM173，TBK1和IRF3基因的表达不能预测卵巢癌症患者的预后
通过分析cGAS/STING信号通路的关键分子与个体免疫细胞浸润之间的相关性，我们发现MB21D1和TMEM173的表达与卵巢癌中固有免疫和适应性免疫细胞的阳性浸润主要相关，而TBK1和IRF3的表达与免疫浸润呈负相关，提示MB21D1，TMEM173，TBK1和IRF3可能在癌症患者的预后中发挥不同的作用。因此，我们评估了MB21D1，TMEM173，TBK1和IRF3基因在卵巢癌患者中的表达与预后相关的预测值。结果显示只有MB21D1的高表达与卵巢癌患者预后好有些许关系，但p>0.1，无意义。其他基因并不能预测卵巢癌患者的预后。
3.讨论
免疫疗法是一种有效的癌症疗法，在2013年被科学界列为十大重大科学突破中的第一位。固有免疫和适应性免疫都是免疫疗法的靶点。由于cGAS/STING信号通路对激活固有免疫和适应性免疫应答的积极作用，因此对其能否影响免疫疗法产生兴趣。例如，科学家们根据动物模型认为这种信号通路的激活增强了检查点阻滞治疗的效应器，并提高了治疗性癌症疫苗接种的效果[14]。然而，目前关注该通路在人类恶性肿瘤中的作用的研究仍是有限的。
在这项研究中，我们研究了卵巢癌中cGAS/STING信号通路中四种关键分子cGAS，STING，TBK1，IRF3的表达。我们发现TMEM173，TBK1和IRF3基因的表达在卵巢癌中显着下调，这意味着cGAS/STING信号传导可能在卵巢癌中被抑制，卵巢癌的免疫情况也可能被抑制，但这需要进一步实验验证。
最近的一项研究报道，STING信号可能介导癌细胞的转移。BakhoumSF.等发现肿瘤细胞的基因组不稳定性导致STING信号感应细胞溶质DNA从而被激活，STING信号的活化激活下游非经典NF-kB信号通路，从而促进癌细胞的转移[15]。最近的一项研究报道，cGAS过表达增强了双链DNA损伤并导致肺癌模型中的基因组不稳定，并诱导恶性转化，刺激体外增殖并加速肺癌细胞体内肿瘤生长[16]。另外，据报道，cGAS/STING信号通路的激活刺激癌细胞中PD-L1的表达，其介导癌细胞的免疫逃避。这些研究表明cGAS/STING信号通路的激活可以促进癌症进展。
通过分析cGAS/STING信号通路中关键分子表达与不同免疫细胞特征之间的关系，我们发现只有TMEM173和MB21D1的表达水平与大多数免疫细胞的浸润正相关，TBK1和IRF3与免疫细胞的浸润相关性较小或负相关。在过去几年中，已开发出各种STING激动剂以改善抗肿瘤免疫能力。例如，将合成的CDN（cyclicdinucleotides）直接注射到小鼠肿瘤中激活STING和固有免疫免疫系统，然后引发一系列反应并激活针对肿瘤的T细胞[17]。然而，最近的一项研究发现，STING激动剂通过激活细胞应激诱导细胞死亡[18]。同样，在另一项研究中，STING分子激活使T淋巴细胞受损；这个过程依赖于NF-kB，并且是在激活后STING重定位到高尔基体的结果[19]。这些新发现表明cGAS/STING信号可能损害适应性免疫系统，我们的结果也表明cGAS/STING信号通路的高表达与某些免疫细胞的浸润呈负相关。因此，cGAS/STING信号通路活性与免疫浸润之间的关系比我们目前所知的更复杂。
4.结论
总的来说，我们首次发现cGAS/STING信号在卵巢癌组织中表达下降。我们还发现，高度上调的cGAS/STING信号通路与卵巢癌中的免疫细胞浸润呈正相关，但高水平的cGAS/STING信号通路不能预测卵巢癌患者的预后。该研究表明，在临床应用基于STING激动剂的抗癌免疫治疗之前，有必要深入和全面评估cGAS/STING信号在肿瘤演进和肿瘤免疫中的功能。
5.方法
5.1从TCGA和cBioPortal数据库中获得数据
我们从TCGA数据库[20]中获得了卵巢癌mRNA的RNA-Seq-HTSeq-FPKM数据，来进一步分析cGAS/STING信号通路的表达，并且为了更好地对比分析，我们用transpermillion（TPM）的方法对这些数据进行标准化。用未配对样本t检验的方法来检测肿瘤组织和正常组织之间基因表达的不同。cBioPortal数据库是为大规模的癌症基因组数据提供癌症基因组学的可视化、分析和下载[21，22]。我们从cBioPortal数据库中下载卵巢癌中cGAS/STING信号通路中突变情况
5.2GEPIA基因表达及生存曲线
我们GEPIA数据库的数据评估MB21D1，TMEM173，TBK1和IRF3的mRNA表达及其预后意义。GEPIA是一款基于网络的工具，根据TCGA和GTEx数据提供快速定制功能，包含多种癌症类型的基因表达数据和生存信息[23]。为了分析病人的整体存活率，我们以中位数表达量作为表达阈值，将患者分为高表达组和低表达组，用Kaplan-Meier生存图显示。在Kaplan-Meier生存图中，存在风险比（HR），95%置信区间（CI）和Log-rank检验得出的P值。
5.3分析免疫细胞浸润和cGAS/STING信号通路的关键分子的表达水平之间的相关性
我们从GEO数据库中下载了来自TCGA数据库的卵巢癌的RNA测序数据。所有的原始数据用“Rsubread”R包与从CancerGenomicHub下载的表达谱数据进行对比处理，从而比较不同样本间基因的表达值。之前的研究发现了对应28个肿瘤浸润免疫细胞亚型的782个免疫标记基因。每种免疫细胞亚型的浸润程度通过ssGSEA方法估算并用“GSVA”R包进行比较处理。为了确定cGAS/STING信号通路种四个关键分子的基因表达水平与免疫细胞浸润程度之间的相关性，计算各个基因表达和每种免疫细胞亚型的富集指数之间的皮尔森相关系数。采用Cox比例风险回归法评价各个基因在卵巢癌中的预后意义。通过固定效应荟萃分析估计总体风险比并将其作为卵巢癌预后意义。
参考文献：
[1]Bose，D.，cGAS/STINGPathwayinCancer：JekyllandHydeStoryofCancerImmuneResponse.InternationalJournalofMolecularSciences，2017.18（11）：p.2456.
[2]RiveraVargas，T.，I.Benoit-Lizon，andL.Apetoh，Rationaleforstimulatorofinterferongenes–targetedcancerimmunotherapy.EuropeanJournalofCancer，2017.75：p.86-97.
[3]<4.STINGisanendoplasmicreticulumadaptorthatfacilitatesinnateimmunesignalling.pdf>.
[4]Sun，L.，etal.，CyclicGMP-AMPSynthaseIsaCytosolicDNASensorThatActivatestheTypeIInterferonPathway.Science，2012.339（6121）：p.786-791.
[5]Ran，Y.，H.-B.Shu，andY.-Y.Wang，MITA/STING：Acentralandmultifacetedmediatorininnateimmuneresponse.Cytokine&GrowthFactorReviews，2014.25（6）：p.631-639.
[6]Woo，S.-R.，L.Corrales，andT.F.Gajewski，TheSTINGpathwayandtheTcell-inflamedtumormicroenvironment.TrendsinImmunology，2015.36（4）：p.250-256.
[7]Woo，S.-R.，etal.，STING-DependentCytosolicDNASensingMediatesInnateImmuneRecognitionofImmunogenicTumors.Immunity，2014.41（5）：p.830-842.
[8]<9.STINGactivationoftumorendothelialcellsinitiatesspontaneousandtherapeuticantitumorimmunity.pdf>.
[9]Ohkuri，T.，etal.，STINGContributestoAntigliomaImmunityviaTriggeringTypeIIFNSignalsintheTumorMicroenvironment.CancerImmunologyResearch，2014.2（12）：p.1199-1208.
[10]<11.STINGagonistformulatedcancervaccinescancureestablishedtumorsresistanttoPD-1blockade.pdf>.
[11]Lu，S.，etal.，STINGactivationenhancescetuximab-mediatedNKcellactivationandDCmaturationandcorrelateswithHPV+statusinheadandneckcancer.OralOncology，2018.78：p.186-193.
[12]Song，S.，etal.，DecreasedexpressionofSTINGpredictspoorprognosisinpatientswithgastriccancer.ScientificReports，2017.7（1）.
[13]Shu，C.，etal.，StructureofSTINGboundtocyclicdi-GMPrevealsthemechanismofcyclicdinucleotiderecognitionbytheimmunesystem.NatureStructural&MolecularBiology，2012.19（7）：p.722-724.
[14]Kim，Y.J.，STINGingtheTumor'simmuneevasionmechanism.OncoImmunology，2018.7（4）：p.e1083673.
[15]Bakhoum，S.F.，etal.，ChromosomalinstabilitydrivesmetastasisthroughacytosolicDNAresponse.Nature，2018.553（7689）：p.467-472.
[16]Liu，H.，etal.，NuclearcGASsuppressesDNArepairandpromotestumorigenesis.Nature，2018.563（7729）：p.131-136.
[17]Corrales，L.，etal.，DirectActivationofSTINGintheTumorMicroenvironmentLeadstoPotentandSystemicTumorRegressionandImmunity.CellReports，2015.11（7）：p.1018-1030.
[18]Larkin，B.，etal.，CuttingEdge：ActivationofSTINGinTCellsInducesTypeIIFNResponsesandCellDeath.TheJournalofImmunology，2017.199（2）：p.397-402.
[19]<26.IntrinsicantiproliferativeactivityoftheinnatesensorSTINGinTlymphocytes.pdf>.
[20]Weinstein，J.N.，etal.，TheCancerGenomeAtlasPan-Canceranalysisproject.NatureGenetics，2013.45（10）：p.1113-1120.
[21]<29.IntegrativeAnalysisofComplexCancerGenomicsandClinicalProfilesUsingthecBioPortal.pdf>.
[22]Cerami，E.，etal.，ThecBioCancerGenomicsPortal：AnOpenPlatformforExploringMultidimensionalCancerGenomicsData：Figure1.CancerDiscovery，2012.2（5）：p.401-404.
[23]Tang，Z.，etal.，GEPIA：awebserverforcancerandnormalgeneexpressionprofilingandinteractiveanalyses.NucleicAcidsResearch，2017.45（W1）：p.W98-W102.
资助项目：黑龙江省教育厅科技项目（12531412，12521319）