短乳杆菌2-34瓜氨酸转运蛋白的鉴定及功能研究

论文摘要

从黄酒发酵液中分离的短乳杆菌2-34（Lactobacillus brevis 2-34）具有重吸收瓜氨酸的能力,由于其中瓜氨酸转运机制并不清楚,导致该菌株尚未成功应用于黄酒酿造,以达到减少瓜氨酸含量从而最终降低氨基甲酸乙酯含量的目的。本课题对该菌株中假定的瓜氨酸转运蛋白进行鉴定和功能研究,初步探索瓜氨酸转运机理,为该菌株的应用奠定理论基础。对L.brevis 2-34基因组中两个假定的瓜氨酸转运蛋白编码基因——dcuC和a/o antiporter,利用Cre-loxp系统对二者进行基因敲除,发现基因敲除菌株代谢精氨酸速度变慢,且无法将分泌至发酵液中的瓜氨酸完全重吸收回胞内。此外,ΔdcuC菌株发酵结束后发酵液中瓜氨酸的含量更高,说明DcuC和A/O antiporter蛋白均能够吸收细胞外的瓜氨酸,且DcuC吸收效率更高。以质粒pRSFDuet-1和pETDuet-1为表达载体,分别通过构建多顺反子串联表达系统以及双质粒表达系统,在Escherichia coli C43（DE3）中表达瓜氨酸代谢相关蛋白:ArcD（精氨酸/鸟氨酸转运蛋白）、ArcA（精氨酸降解酶）、ArcB（瓜氨酸降解酶）以及DcuC或A/O antiporter（假定的瓜氨酸转运蛋白）。结果显示,所有重组菌株均可利用精氨酸并分泌瓜氨酸,且与无瓜氨酸转运蛋白的对照组菌株相比,表达了DcuC或A/O antiporter的重组菌株发酵液中瓜氨酸含量更低,进一步证明了DcuC和A/O antiporter均具有吸收瓜氨酸的功能。通过RT-PCR技术监测L.brevis 2-34在含精氨酸培养基中生长时基因的转录情况,发现在对数中期及中后期,即瓜氨酸被迅速重吸收回胞内时,蛋白ArcD编码基因基本不转录,而DcuC和A/O antiporter编码基因仍有较高的转录水平,证明了DcuC和A/O antiporter与瓜氨酸吸收的相关性。通过生物学信息方法,对DcuC和A/O antiporter蛋白结构进行分析,发现二者均含有跨膜结构,为膜蛋白。核心结构域DcuC已被证明在乳酸菌中与瓜氨酸吸收相关。同时二者均含有翻译后修饰位点,可能与其转运瓜氨酸的方向转换有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 概述
•     1.1.1 黄酒发酵与潜在致癌物氨基甲酸乙酯的关系
•     1.1.2 降低黄酒中氨基甲酸乙酯含量的方法
•   1.2 短乳杆菌中瓜氨酸的代谢及形成途径
•     1.2.1 ADI途径及arc基因簇
•     1.2.2 L.brevis2-34 中的arc基因簇
•     1.2.3 氨基酸转运体
•   1.3 假定瓜氨酸转运蛋白基因功能鉴定方法
•     1.3.1 Cre-loxp乳酸菌基因敲除方法
•     1.3.2 乳酸菌电转化与限制修饰系统
•     1.3.3 异源表达
•   1.4 立题依据及研究意义
•   1.5 论文主要研究内容
• 第二章 材料与方法
•   2.1 菌株与质粒
•   2.2 试剂和仪器
•     2.2.1 主要试剂
•     2.2.2 主要仪器设备
•   2.3 主要溶液及培养基的制备
•     2.3.1 培养基的制备
•     2.3.2 主要溶液的制备
•   2.4 培养条件
•   2.5 实验方法
•     2.5.1 L.brevis2-34 基因组提取
•     2.5.2 瓜氨酸代谢相关基因异源表达载体的构建及转化
•     2.5.3 瓜氨酸代谢相关蛋白诱导表达
•     2.5.4 重组菌株瓜氨酸代谢相关蛋白表达SDS-PAGE检测
•     2.5.5 HPLC法检测发酵液中精氨酸和瓜氨酸的含量
•     2.5.6 质粒体外人工修饰
•     2.5.7 L.brevis2-34 电转化
•     2.5.8 假定瓜氨酸转运蛋白编码基因dcuC和 a/o antiporter的敲除
•     2.5.9 dcuC和a/o antiporter基因敲除菌株氨基酸转运情况
•     2.5.10 瓜氨酸代谢相关基因表达水平分析
•     2.5.11 假定的瓜氨酸转运蛋白结构分析
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 假定瓜氨酸转运蛋白结构分析
•     3.1.1 假定瓜氨酸转运蛋白一级结构分析
•     3.1.2 假定瓜氨酸转运蛋白二级结构预测
•   3.2 大肠杆菌异源表达瓜氨酸代谢相关基因
•     3.2.1 重组质粒的构建与转化
•     3.2.2 SDS-PAGE鉴定目的蛋白异源表达情况
•     3.2.3 DcuC与A/O antiporter对精氨酸和瓜氨酸的吸收转运情况
•   3.3 假定瓜氨酸转运蛋白编码基因dcuC和a/o antiporter的敲除
•     3.3.1 Cre-loxp乳酸菌基因敲除系统改造
•     3.3.2 dcuC和a/o antiporter基因敲除
•     3.3.3 dcuC和a/o antiporter基因敲除菌株氨基酸转运情况
•   3.4 Lactobacillus brevis 2-34中瓜氨酸代谢相关基因相对转录水平分析
•     3.4.1 L.brevis2-34 在含精氨酸条件下的生长和氨基酸吸收情况
•     3.4.2 RT-PCR分析L.brevis 2-34瓜氨酸代谢相关基因的相对转录水平
• 主要结论与展望
•   主要结论
•   展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1：作者在攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录2：实验所用基因序列

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘晓慧

导师: 陆健

关键词: 黄酒,瓜氨酸

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 江南大学

基金: 李晓敏副教授国家自然科学基金青年科学基金项目“黄酒酿造乳酸菌ADI途径中瓜氨酸转运方式及其调控机理的研究”(3170101535,2018.01.01-2020.12.31)

分类号: TS262.4;Q78

总页数: 55

文件大小: 4598K

下载量: 72