以胱抑素及其突变体为例研究毕赤酵母表达外源蛋白的影响

论文摘要

毕赤酵母是一种高效的真核表达系统,已被广泛的应用于生产重组蛋白药物。现有研究表明,二硫键异构酶PDI（Protein Disulfide Isomerase）在宿主菌里过表达会显著提高酵母对外源蛋白的表达量。PDI在催化新生蛋白质二硫键形成的同时参与蛋白折叠;另一方面它兼具分子伴侣的功能,能帮助错误折叠的蛋白折叠成其天然构象。为了深度剖析PDI提高淀粉样蛋白表达效率的机理及涉及的细胞通路及信号因子,我们以鸡胱抑素为模型蛋白,分别构建了鸡胱抑素的各种突变体（淀粉样突变体I66Q、不稳定型突变体ΔW和α螺旋II解体突变E82P）,并在PDI正常表达及过表达的毕赤酵母GS115菌株中进行分泌型表达。经SDS-PAGE及Western Blot检测各菌株胞内及胞外蛋白发现,除表达I66Q的两个重组菌株没有检测到胞内蛋白外,其余菌株在胞内均检测到外源蛋白的单体。胞外蛋白的检测结果显示,除E82P在PDI正常表达及过表达菌株中的表达量变化不明显外,其余外源蛋白在PDI过表达菌株的表达量均显著高于PDI正常表达的菌株。蛋白质表达的实验结果符合蛋白构象决定表达效率的既有科学假说。利用转录组测序技术对各菌株进行了深度分析,对I66Q VS WT和ΔW VS WT的两组菌株绘制维恩图,分别筛选出203个和210个差异表达基因。随后进行KEGG途径的分类和统计,发现在I66Q VS WT及ΔW VS WT组分别有145,148个基因注释到KEGG数据库中,差异基因在遗传信息处理中的差距较大,特别是在DNA复制过程中I66Q VS WT中只有gene3858上调,而在ΔW VS WT中有五个上调基因注释到DNA复制的通路中。因此,推测引起较大差距的原因是I66Q虽然是淀粉样突变体,但其主体构象与野生型相比变化较小,而ΔW则是去掉了一个包含9个氨基酸的α螺旋II的截短体,并缺失一个二硫键,这需要调动更多的基因来提高其复制、转录和翻译等蛋白质合成相关功能的效率。本次研究及转录组测序分析结果一方面确定了PDI对毕赤酵母分泌淀粉样蛋白的调控作用,另一方面,比较鸡胱抑素各突变体与野生型鸡胱抑素的异同。有助于阐明新生蛋白的淀粉样突变体、不稳定突变体与野生型天然蛋白在胞内的产生过程,为深入理解真核生物的品质管理系统提供理论和实验依据。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 前言
•   0.1 毕赤酵母
•   0.2 毕赤酵母蛋白质二硫键异构酶
•   0.3 胱抑素C
•     0.3.1 人胱抑素C
•     0.3.2 鸡胱抑素C（Chicken Cystatin C,WT）
•     0.3.3 鸡胱抑素C突变体
•   0.4 高通量测序
•   0.5 研究目的及意义
• 第1章 构建表达外源蛋白鸡胱抑素及其突变体的重组菌株
•   1.1 实验所需菌株及化学试剂
•     1.1.1 载体及菌株
•     1.1.2 实验相关试剂
•     1.1.3 实验相关仪器
•     1.1.4 验证重组菌株的通用引物序列
•   1.2 实验方法
•     1.2.1 获取含有I66Q,ΔW和 E82P的pPICZαA质粒载体
•     1.2.2 构建分泌外源I66Q,ΔW和E82P蛋白的GS115及GS115-PDI重组菌株
•     1.2.3 酵母直接PCR验证方法
•   1.3 实验结果
•     1.3.1 含外源蛋白I66Q的重组菌株的验证
•     1.3.2 含外源蛋白ΔW的重组菌株的验证
•     1.3.3 含外源蛋白E82P的重组菌株的验证
•   1.4 本章小结
• 第2章 过表达PDI对淀粉样蛋白及其突变体表达的影响
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验相关试剂
•     2.1.2 实验相关仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 诱导表达外源淀粉样蛋白
•     2.2.2 提取外源淀粉样蛋白
•     2.2.3 银染检测外源淀粉样蛋白
•     2.2.4 Western Blot检测外源淀粉样蛋白
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 银染结果分析
•     2.3.3 Western Blot结果分析
•   2.4 本章小结
• 第3章 PDI影响淀粉样蛋白表达差异基因筛选及部分基因的验证.
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 实验相关试剂
•     3.1.2 实验相关仪器
•     3.1.3 实验相关引物
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 提取酵母RNA
•     3.2.2 转录组测序流程
•     3.2.3 cDNA合成
•     3.2.4 qPCR反应体系
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 测序样品列表
•     3.3.2 转录组测序所得结果
•     3.3.3 各样品间差异基因的筛选
•     3.3.4 异表达基因筛选
•   3.4 本章小结
• 结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表学术论文及参加科研情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 秦淑贞

导师: 何剑为

关键词: 毕赤酵母,二硫键异构酶,鸡胱抑素,转录组测序

来源: 辽宁大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 辽宁大学

分类号: Q78

总页数: 62

文件大小: 3267K

下载量: 29