导读:本文包含了内皮样细胞论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:细胞,干细胞,内皮,恒河,角膜,骨髓,诱导。
内皮样细胞论文文献综述
王珊珊,Xiaohui,Rausch-Fan,Oleh,Andrukov,林毅,林李嵩[1]（2019）在《Emdogain对共培养成骨样细胞及内皮细胞成骨及成血管基因表达的影响》一文中研究指出目的:评价emdogain对直接与间接共培养条件下成骨样细胞和内皮细胞成骨及成血管基因表达的影响以及其间的相关性。方法:将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和成骨样细胞(MG63)按2∶1比例于12孔板内进行直接及间接共培养,并使用不同浓度(0、0.1、1、10、50μg/mL)的emdogain共培养细胞72 h。采用细胞计数仪结合流式细胞仪评价细胞增殖情况,并通过荧光激活流式细胞分选技术分选共培养细胞。对分选后的成骨样细胞及内皮细胞采用实时荧光定量PCR分别检测成骨相关基因碱性磷酸酶(ALP)、I型胶原蛋白(Col-1)及成血管相关基因血管内皮细胞生长因子(VEGF)、VEGF酪氨酸激酶受体1(Flt-1)、VEGF酪氨酸激酶受体2(KDR)、von Willebrand因子(vWF)、内皮细胞C蛋白受体(EPCR)、E选择素(E-Selectin)、促血管生成素2(Ang-2)的表达水平。采用SPSS24.0软件包对数据进行统计学处理。结果:在直接与间接共培养条件下,Emdogain对MG63及HUVEC细胞增殖的作用具有浓度依赖性。随着emdogain浓度增加,细胞增殖率逐渐下降。50μg/mL浓度的emdogain对MG63及HUVEC细胞增殖抑制作用最为明显。随着emdogain浓度增加,MG63表面ALP和Col-1表达水平逐渐增加;50μg/mL浓度条件下,表达水平最高且与其他组基因表达水平差异显着(P<0.01)。同一emdogain浓度条件下,直接共培养MG63表面ALP及Col-1表达水平均显着高于间接共培养(P<0.01)。除10μg/mL组外,直接共培养条件下,VEGF表达水平均显着高于间接共培养(P<0.01)。50μg/mL组直接共培养的HUVEC表面Flt-1、KDR、vWF、E-selectin基因表达水平显着高于间接共培养及直接共培养的其他各组(P<0.01)。间接共培养条件下,HUVEC表面EPCR及Ang-2基因表达水平显着高于直接共培养(P<0.05)。结论:Emdogain对共培养MG63和HUVEC增殖的作用具有浓度依赖性,50μg/mL可能是emdogain作用的关键浓度。在直接共培养条件下,50μg/mL emdogain抑制MG63及HUVEC细胞增殖,但能同时促进MG63及HUVEC细胞相关基因表达;且该条件下emdogain的作用显着强于其他实验条件,细胞间直接交联可能在其中发挥重要作用。(本文来源于《中国口腔颌面外科杂志》期刊2019年01期）
吕继忠[2]（2018）在《成纤维细胞来源诱导性多能干细胞定向分化为血管内皮样细胞及与牙髓干细胞的共培养》一文中研究指出背景:牙髓的血管重建是为组织工程牙髓再生提供养分与能量供给的重要环节。干细胞的选择和血管内皮样细胞的定向分化已经成为真正实现牙髓再生的重要研究方向。目的:将小鼠成纤维细胞来源诱导性多能干细胞定向分化为血管内皮样细胞,探讨其与牙髓干细胞共培养促进血管新生的可行性。方法:(1)采用酶消化法制备小鼠睾丸支持细胞饲养层;(2)外源添加血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导小鼠皮肤成纤维细胞来源诱导性多能干细胞定向分化为血管内皮样细胞并进行鉴定;(3)建立血管内皮样细胞与牙髓干细胞共培养体系,荧光实时定量PCR检测CD34、血管内皮生长因子mRNA的表达。结果与结论:(1)诱导分化14 d后倒置显微镜下观察到细胞形态改变,呈现血管内皮形态;(2)流式细胞术鉴定诱导分化细胞CD31阳性,呈现内皮细胞表型;(3)诱导分化14 d后,培养液上清中内皮型一氧化氮合酶水平明显高于未分化细胞(P<0.01);(4)诱导分化14 d后,与未分化对照组相比,实验组细胞内皮素表达增高(P<0.01),前列环素表达降低(P<0.01);(5)血管内皮样细胞与牙髓干细胞共培养5 d后,与血管内皮样细胞单独培养组相比,共培养组CD34和血管内皮生长因子表达增高(P<0.01);(6)结果表明,小鼠成纤维细胞来源的诱导性多能干细胞可以定向分化为血管内皮样细胞,与牙髓干细胞共培养后有形成血管的倾向。(本文来源于《中国组织工程研究》期刊2018年21期）
王玉林,吕林林,王霞,高永清,周兆[3]（2018）在《枸杞多糖减轻过氧化氢诱导的人内皮样细胞EA.hy926氧化损伤》一文中研究指出目的:研究枸杞多糖(LBP)对过氧化氢(H_2O_2)诱导人内皮样细胞EA.hy926氧化损伤的作用及机制。方法:用H_2O_2建立EA.hy926细胞氧化损伤模型,细胞共分为5个组:正常对照(control)组、模型(damage)组(H_2O_2,50 mmol/L)、LBP(100 mg/L)组、抗损伤(anti-damage)组(50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L LBP+50 mmol/L H_2O_2)和LY294002(20μmol/L)组。采用CCK-8法检测细胞的活力;用Annexin V/PI双染法流式细胞术检测不同处理后EA.hy926细胞的凋亡;吖啶橙(AO)/溴乙啶(EB)染色法观察细胞凋亡的形态特征;划痕法测定细胞的迁移能力;一氧化氮(NO)试剂盒检测细胞培养上清中NO的水平;用ELISA法测定血管内皮生长因子(VEGF)的水平;Western blot检测cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、内皮型NO合酶(eNOS)、p-eNOS和p-Akt的蛋白水平。结果:量效结果显示浓度为100 mg/L的LBP预处理EA.hy926细胞1 h,然后加入H_2O_2(50 mmol/L)处理24 h对减轻H_2O_2诱导的EA.hy926细胞损伤的作用最显着。与damage组比较,LBP预处理可提高EA.hy926细胞的活力(P<0.05),减少细胞凋亡(P<0.05),并促进细胞迁移;上清液中VEGF和NO水平升高;Bcl-2/Bax比率明显升高,下调cleaved caspase-3蛋白水平,并上调eNOS和p-eNOS蛋白水平。此外,加入PI3K抑制剂LY294002后,LBP对H_2O_2损伤的EA.hy926细胞的保护作用减弱,表现为NO水平和p-Akt蛋白水平降低。结论:LBP能减轻H_2O_2对EA.hy926细胞的损伤作用,缓解H_2O_2诱导的凋亡,其机制与激活PI3K/Akt/eNOS信号通路密切相关。(本文来源于《中国病理生理杂志》期刊2018年06期）
王新文[4]（2018）在《低氧诱导人骨肉瘤MNNG/HOS细胞转分化为血管内皮样细胞的研究》一文中研究指出【目的】血管内皮细胞是形成肿瘤新生血管的重要组成部分,与肿瘤的发展及转移密切相关,因此本课题旨在探讨低氧条件下人骨肉瘤MNNG/HOS细胞是否可转分化为血管内皮样细胞,并进一步探讨其分子机制。【方法】1.将人骨肉瘤MNNG/HOS细胞在各组不同条件下培养,观察其是否出现血管内皮细胞所具有典型的“铺路石”外观;应用3D培养技术,观测是否出现网状结构;应用RT-PCR技术,从m RNA水平检测内皮细胞所特有的标记物(CD31、CD34、v WF)的表达情况;采用细胞免疫荧光技术,从蛋白质水平检测CD31、CD34、v WF的表达情况。2.将人骨肉瘤MNNG/HOS细胞在各组不同条件下培养96小时后,接种于裸鼠皮下,构建裸鼠人骨肉瘤异种移植瘤模型,接种49天后,取下异种移值瘤并予抗人的CD31抗体进行免疫组织化学染色,检测其异种移植瘤血管内皮细胞是否有来源于人骨肉瘤MNNG/HOS细胞。3.将体外各组不同条件下培养的人骨肉瘤MNNG/HOS细胞株,应用流式细胞仪进行分析,检测能被CD133抗体染色的细胞的比例,应用q PCR技术检测干细胞基因Oct4和Nanog转录水平;接种于裸鼠皮下,观察其成瘤能力。4.应用m TOR通路抑制剂雷帕霉素100nmol/L,30分钟预处理人骨肉瘤MNNG/HOS细胞,然后低氧条件下培养,接种于裸鼠皮下,观察其成瘤能力;接种49天后,取下异种移值瘤予抗人的CD31抗体进行免疫组织化学染色,检测移植瘤血管内皮细胞是否有来源于人骨肉瘤MNNG/HOS细胞。并观察予雷帕霉素预处理的低氧条件下培养的MNNG/HOS细胞是否出现“铺路石”外观;应用3D培养技术,观测是否出现网状结构;应用细胞免疫荧光技术,从蛋白质水平检测CD31、CD34、v WF的表达情况;用流式细胞仪分析能被CD133抗体标记的细胞比例;应用q PCR技术检测干细胞基因Oct4和Nanog转录水平,以及HIF-α转录水平;应用Western blot技术检测HIF-α及m TOR信号通路中的m TOR、p-m TOR、P70S6K及p-P70S6K蛋白表达水平,探讨低氧诱导人骨肉瘤MNNG/HOS细胞转分化为血管内皮样细胞的分子机制。【结果】1.预处理理组和低氧组可观察到血管内皮样细胞所具有典型的“铺路石”外观,叁维培养可观测到网状结构形成,m RNA和蛋白质水平均可检测到CD31、CD34、v WF的表达;而常氧组和常氧对照组未能观察到“铺路石”外观及网状结构形成,m RNA和蛋白质水平均未能检测到CD31、CD34、v WF的表达。2.预处理理组和低氧组的异种移植瘤,免疫组织化学染色可见被抗人的CD31抗体染色阳性细胞;常氧组和常氧对照组均未见被抗人的CD31抗体染色阳性细胞。3.低氧组能被CD133抗体染色的细胞的比例较对照组显着增加(P﹤0.05);干细胞基因Oct4和Nanog转录水平较常氧对照组显着增加(P﹤0.05);异种移植瘤,体积和重量较对照组显着增大(P﹤0.05)。4.雷帕霉素组的皮下异种移植瘤的体积和重量较低氧组均显着减小(P﹤0.05);未见被抗人的CD31抗体染色阳性细胞;未能观察到“铺路石”外观,未见网状结构形成;蛋白质水平均未能检测到CD31、CD34、v WF的表达;HIF-α在m RNA转录水平较低氧组无显着差异(P﹥0.05),但蛋白表达水平显着降低(P﹤0.05);m TOR信号通路中m TOR及P70S6K蛋白的磷酸化水平较低氧组显着降低(P﹤0.05)。【结论】1.低氧条件下培养的人骨肉瘤MNNG/HOS细胞可转分化为血管内皮样细胞,并具有典型的“铺路石”外观和形成网状结构,m RNA和蛋白质水平均检测CD31、CD34、v WF的表达显着增加。2.低氧条件下培养的人骨肉瘤MNNG/HOS细胞接种于裸鼠体内可转分化为血管内皮样细胞;3.低氧条件下培养的人骨肉瘤MNNG/HOS细胞可去分化为肿瘤干细胞,其成瘤能力增强。4.HIF-1α可能通过m TOR信号通路,参与低氧条件下人骨肉瘤MNNG/HOS细胞转分化为血管内皮细样胞这一过程。(本文来源于《福建医科大学》期刊2018-06-01）
熊何巍[5]（2018）在《骨髓间充质干细胞诱导的内皮样细胞与细胞膜片混合培养》一文中研究指出目的:(1)探索通过将骨髓间充质干细胞诱导所得内皮样细胞与骨髓间充质干细胞制备的细胞片混合培养,初步探讨两者共同培养体外血管形成的可行性。(2)同时并将混合培养后的细胞片运用于完全游离的缺血皮瓣模型,评估体内血管形成的潜能。方法:(1)骨髓间充质细胞(BMSCs)提取、培养及流式鉴定:取SPF级4周龄雄性SD大鼠,处死后提取骨髓冲洗液,采用全骨髓差异贴壁培养法,体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC),取培养所得P4代BMSC,胰酶消化后运用流式细胞计数检测表面标记物CD90、CD73、CD11b、CD45、CD31。(2)抗坏血酸介导BMSC形成细胞片:取培养所得P4代BMSC,加入含有抗坏血酸的培养基中培养10天后形成可通过细胞刮刮取的片状结构,分别加入成骨、成脂诱导培养基进行分化功能鉴定,并通过CCK8法检测、绘制加入与不加入抗坏血酸后的BMSCs生长曲线;行HE、Masson染色观察细胞片组织学结构。(3)BMSC向内皮样细胞诱导及鉴定:采用含有血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)合诱导因子方法将骨髓间充质干细胞诱导分化为内皮样细胞,观察细胞形态变化及生长情况,免疫荧光检测细胞标志物CD31、Flt-1;流式细胞仪鉴定表面标记的表达,种植于Matrigel基质胶后的形态学变化。(4)荧光标记的BMSCs细胞膜片与内皮样细胞的体外体内混合培养:利用红色荧光蛋白(RFP)标记的BMSCs并诱导为内皮样细胞,与绿色荧光蛋白(GFP)标记的BMSCs细胞片混合培养后与荧光显微镜下观察细胞形态变化及迁移。并将混合培养后的细胞用于动物模型,术后两周处死、收集组织标本,行切片HE染色组织学观察及免疫荧光观察CD31阳性细胞分布。结果:(1)骨髓间充质细胞(BMSCs)提取、培养及流式鉴定:原代BMSC呈长梭形,呈集落漩涡状生长,经流式细胞术检测细胞结果示CD73、CD90阳性,CD11b、CD45、CD31阴性。(2)经加入抗坏血酸培养基培养的BMSCs较未加入的对照组细胞增殖加快,I型胶原纤维表达强于对照组,培养10天后可与培养皿内形成片状,经HE及Masoon组织学切片显示加入抗坏血酸组较对照组细胞间大量胶原沉积,细胞重迭。经成骨及成脂诱导后的细胞片经成骨、成脂诱导后,油红O、茜素红染色呈阳性。(3)BMSC经内皮诱导后,倒置显微镜下观察可见其形态由长梭形渐成为短梭形,细胞密集处呈铺路石样结构,诱导后2周经流式细胞术鉴定显示CD31阳性率达91%。胰酶消化内皮样细胞后种植于Matrigel后4小时可观察到内皮样细胞小足伸出,呈网格状结构,8小时后渐聚集形成多个集落。RFP标记的内皮细胞与GFP标记的BMSCs细胞膜片混合培养后与荧光显微镜下观察,4小时后可见内皮细胞伪足伸出,呈长梭形,并相互连接呈网状,生长状态良好。(4)混合培养后的细胞片用于SD大鼠缺血皮瓣模型体内后,可形成毛细血管,与对照组相比较,毛细血管数量明显增多。结论:(1)经抗坏血酸诱导形成的BMSCs细胞膜片能够为BMSCs诱导分化所得的内皮样细胞生长及血管网络形成提供物理结构支撑,并能在体外及动物缺血皮瓣模型中共同形成具有功能的微血管样结构。(2)BMSCs构建的细胞膜片搭载内皮样细胞具有改善皮瓣及组织缺血、重建微血管的潜在作用。(本文来源于《华中科技大学》期刊2018-05-01）
董昕[6]（2018）在《恒河猴自体骨髓间充质干细胞体外诱导分化为角膜内皮样细胞的实验研究》一文中研究指出角膜病是当今世界重要的致盲性眼病之一,国内外目前对于角膜内皮失代偿疾病导致的角膜病盲主要还是用各种类型的角膜移植手术这一比较传统的治疗方法,但是供体来源的匮乏这一世界难题一直未曾得到真正解决,所以寻找一种可以代替角膜内皮细胞的细胞或是方法,就成为角膜内皮疾病研究的焦点。本实验尝试通过骨髓间充质干细胞的多向分化潜能,选用恒河猴10 只,全麻后取恒河猴自体(BMSCs:Bone marrow mesenchymal stem cells)和恒河猴角膜内皮细胞(CECs:Corneal endothelial cells),进行分离培养鉴定。按照诱导方式的不同将恒河猴BMSCs分为6个实验组,正常培养的恒河猴BMSCs及CECs为正常对照组,分别对6个实验组的恒河猴BMSCs给予不同的诱导条件进行诱导分化,并分别对诱导分化后的细胞形态学变化进行观察及检测细胞因子和标志性蛋白的表达变化,对诱导分化后的细胞和正常培养的恒河猴BMSCs之间的差异进行对比,观察哪一种诱导方式诱导分化后的恒河猴BMSCs更加接近角膜内皮细胞,实验结果表明:当恒河猴BMSCs在不同诱导条件下(在一定浓度范围内增加培养基中的房水浓度、恒河猴BMSCs与恒河猴CECs直接接触共培养、恒河猴BMSCs与CECs间接共培养、恒河猴BMSC与恒河猴(CEC-CM)接触共培养)均有向类角膜内皮样细胞方向分化的潜能;恒河猴BMSCs与自体晶体匀浆液接触共培养后向类角膜内皮样细胞方向分化的趋势不明显,恒河猴BMSCs中加入虹膜组织提取物培养后无向类角膜内皮样细胞方向分化趋势和潜能、并且虹膜组织对于恒河猴BMSCs生长、增殖有明显的抑制作用。对恒河猴BMSCs分化为CECs的可行性和影响因素进行初步分析研究。为下一步应用自体BMSCs诱导分化治疗人类角膜内皮功能失代偿疾病奠定重要的理论基础。同时本实验成功的对恒河猴CEC进行了在体外的分离培养和冻存复苏,为恒河猴CECs的体外培养、鉴定、冻存提供了成功经验。[目的]利用恒河猴骨髓间充质干细胞(BMSC)具有的多向分化潜能,拟通过将恒河猴的BMSCs与角膜内皮细胞(CECs)体外共培养,并分别加入不同配方的培养液,诱导恒河猴BMSCs向角膜内皮样细胞分化。对分化的恒河猴BMSCs和培养的CECs进行细胞形态学分析、超微结构分析、特异性表面分子和蛋白表达的检测、诱导分化过程中特定细胞因子的变化的检测。验证恒河猴BMSCs诱导分化为角膜内皮样细胞的可能性,同时对比不同诱导条件下的诱导结果。探讨影响诱导分化的因素和寻找BMSCs诱导分化的最佳条件,为下一步应用自体BMSCs诱导分化治疗人类角膜内皮功能失代偿疾病奠定一定的理论基础。[方法]本实验选用恒河猴10只,由中国医学科学院昆明医学生物研究所灵长类研究中心提供,雌雄兼有,年龄16-28个月,体重4-6.5公斤。全麻后取恒河猴自体BMSCs和CECs进行分离培养,并通过流式细胞仪检测细胞的表面标记物、和进行成骨成脂诱导分化[1]证实本实验所提取分离培养的细胞是具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞(BMSCs),通过神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)免疫组化检测和对分离提取的恒河猴角膜内皮细胞进行细胞表面特异性蛋白免疫荧光染色鉴定[2]证明本次实验所分离提取的细胞是恒河猴角膜内皮细胞。根据诱导方法的不同将恒河猴BMSCs分为6个实验组,正常培养的恒河猴BMSCs及CECs为正常对照组。对分别对6个实验组的河猴BMSCs给予不同的诱导条件,对恒河猴BMSCs进行诱导分化后,观察恒河猴BMSCs细胞形态学变化及检测诱导后的恒河猴BMSCs细胞表面特异性蛋白表达变化。探讨恒河猴BMSCs细胞分化为CECs细胞可行性和影响因素。[结果]1.成功实现了恒河猴角膜内皮细胞在体外的分离、培养和鉴定,其细胞形态非常典型;恒河猴角膜内皮细胞经多次传代(6次传代)培养和冻存复苏后生长状态良好、细胞形态典型,而且角膜内皮细胞特异性蛋白神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达阳性、细胞离子泵Na+-K+-ATP酶蛋白表达阳性、细胞紧密连接蛋白ZO-1蛋白表达阳性,证明本次实验所分离提取的细胞是恒河猴角膜内皮细胞。2.不同培养条件对恒河猴BMSCs诱导分化结果2.1不同房水浓度对恒河猴BMSCs诱导分化结果:在15%和25%两种不同房水浓度的培养液中培养的恒河猴BMSCs细胞形状有向多边形变化的趋势,排列变得松散,两组细胞分别进行NSE染色细胞内均可见粗大的棕色颗粒。ZO-1荧光染色显示:见细胞核被DAPI着染为蓝色、细胞膜和胞浆染色未见明显的绿色荧光、染色结果弱阳性,Na+-K+-ATP荧光染色显示:见细胞核被DAPI着染为蓝色、细胞膜和胞浆可见明显的红色荧光着染,染色阳性。2.2恒河猴BMSCs与CECs直接共培养诱导分化结果恒河猴BMSCs与CECs直接接触共培养后,可见长梭形恒河猴BMSCs贴壁生长、行NSE染色细胞内均可见粗大的棕色颗粒。行Z0-1荧光染色后细胞膜和胞浆轻度染为绿色,染色弱阳性,Na+-K+-ATP荧光染色后细胞膜和胞浆见红色着染,染色阳性。2.3恒河猴BMSCs/CECs间接共培养诱导分化结果恒河猴BMSCs与恒河猴CECs间接接触共培养20h,可见长梭形BMSCs贴壁生长,行NSE染色后细胞内均可见粗大的棕色颗粒见。Z0-1荧光染色:细胞膜和胞浆轻度染为绿色,染色弱阳性,Na+-K+-ATP免疫荧光染色:细胞膜和胞浆见红色着染,染色阳性。2.4晶状体上皮提取物诱导恒河猴BMSCs分化结果根据是否与晶状体上皮提取物接触诱导再分为:恒河猴BMSCs与晶状体上皮提取物非接触共培养组和BMSCs与晶状体上皮提取物直接接触共培养组。与晶状体上皮提取物非接触共培养组共培养14h可见细胞变宽、形状有向多边形方向分化的趋势,NSE染色细胞内棕色颗粒着染不明显,与空白对照CECs组比较细胞内棕色颗粒着染明显减少。ZO-1免疫荧光染色显示:细胞膜和胞浆染色未见明显的绿色荧光、Z0-1荧光染色结果阴性;Na+-K+-ATP酶免疫荧光染色显示:细胞膜和胞浆见明显的红色颗粒状荧光着染,Na+-K+-ATP酶免疫荧光染色结果阳性。恒河猴BMSCs与晶状体上皮提取物直接接触共培养组共培养14h、可见细胞变宽、排列松散、形状有向多边形方向分化的趋势,但是细胞数量较非接触共培养组细胞密度低,NSE染色细胞内棕色颗粒着染不明显,与CECs组比较细胞内棕色颗粒着染明显减少。ZO-1免疫荧光染色显示:细胞膜和胞浆染色未见明显的绿色荧光、Z0-1荧光染色结果阴性;Na+-K+-ATP酶免疫荧光染色显示:细胞膜和胞浆见明显的红色颗粒状荧光着染,Na+-K+-ATP酶免疫荧光染色结果阳性。2.5虹膜组织对于恒河猴BMSCs的诱导分化结果根据是否与虹膜组织接触诱导再分为:恒河猴BMSCs与虹膜组织非接触共培养组和BMSCs与虹膜组织接触共培养组。与虹膜组织非接触共培养:可见少量梭形BMSCs贴壁生长、细胞密度明显降低未见明显向多边形方向分化的趋势,NSE染色细胞内未见明显的棕色颗粒着染、NSE染色阴性。与虹膜组织直接接触共培养14d倒置相差显微镜拍摄:未见细胞生长、只见虹膜色素颗粒,行NSE染色只见恒河猴BMSCs细胞碎片和虹膜颗粒。恒河猴BMSCs与虹膜组织非接触共培养后Z0-1荧光染色细胞核被DAPI着染为蓝色但是细胞膜和胞浆未见明显染色,BMSC细胞与虹膜组织非接触共培养后Na+-K+-ATP荧光染色细胞膜和胞浆未见染色,荧光染色阴性。因为发现恒河猴BMSCs与虹膜直接触共培养后恒河猴BMSCs的生长明显受到抑制,未见存活细胞所以无法进行免疫荧光染色检查。2.6 恒河猴BMSCs与角膜内皮细胞条件培养基(CEC-CM:Corneal endothelial c ells Conditioned medium)接触共培养:恒河猴BMSCs与角膜内皮细胞条件培养基(CEC-CM)接触共培养后细胞形状变宽、排列变疏松,细胞外形有向多边形分化的趋向,NSE免疫组化染色细胞内可见粗大的棕色颗粒、NSE免疫组化染色结果阳性。Z0-1蛋白免疫荧光染色显示:细胞膜和胞浆轻度着染为绿色荧光、染色弱阳性,Na+-K+-ATP酶蛋白免疫荧光染色显示:细胞膜和胞浆见明显的红色荧光着染、染色阳性。[结论]恒河猴角膜内皮细胞能成功实现在体外的分离培养冻存,改进的揭膜联合蛋白酶消化法是一种可重复性高、可靠性强的CECs提取方法,并能够显着提高恒河猴CEC细胞培养和冻存复苏的成功率,为恒河猴CECs的体外培养、鉴定、冻存提供了成功的实验经验。在一定浓度范围内增加培养基中的房水浓度有利于BMSCs在向类角膜内皮样细胞方向分化;恒河猴BMSCs与CECs直接接触共培养后恒河猴BMSCs表现出向类角膜内皮样细胞分化的趋势和潜能;恒河猴B MSCs与CECs间接共培养后BMSCs有向类角膜内皮样细胞方向分化的潜能;恒河猴BMSCs与(CECs-CM)接触共培养后均有向类角膜内皮样细胞方向分化的趋势和潜能;BMSCs与晶体匀浆液共培养后向类角膜内皮样细胞方向分化的趋势不明显。恒河猴BMSCs培养基中加入虹膜提取物培养后,恒河猴BMSCs没有向类角膜内皮样细胞方向分化趋势和潜能,并且恒河猴BMSCs的生长增殖明显受到抑制。(本文来源于《昆明医科大学》期刊2018-03-01）
董婧婧[7]（2017）在《骨髓间充质干细胞体外诱导为角膜内皮样细胞的实验研究》一文中研究指出[目的]利用骨髓间充质干细胞多向分化潜能,将骨髓间充质干细胞诱导分化为角膜内皮样细胞;探讨体外分离提纯和培养树鼩及恒河猴骨髓间充质干细胞(BMSCs)的生物学特性:形态、生长曲线、活性,对其多向分化潜能和表型进行初步鉴定,并将树鼩及恒河猴各结果对比。将树鼩BMSCs与晶体、虹膜、角膜内皮细胞非接触性共培养,分析体外诱导成为角膜内皮样细胞的可行性,并进一步探讨恒河猴骨髓间充质干细胞诱导分化为角膜内皮样细胞的可能性及实验方案。[方法]取树鼩及恒河猴胫骨及股骨,去除骨骺端将骨髓冲出收集,采用密度梯度离心法和全骨髓贴壁培养法提取培养BMSCs,利用MTS检测细胞活性的方法绘制二代及七代细胞生长曲线,使用FITC Annexin V-PI细胞凋亡试剂盒双染法检测细胞凋亡情况,利用流式细胞仪分析法检测细胞表面标志物CD29、CD34、CD45、CD90、CD147 的表达。[结果]树鼩及恒河猴提取细胞多为长梭形,形态大小均一,少量细胞有大小数量不等的触角,或呈星形;第2代和第7代的细胞生长曲线呈S形,P7代细胞增殖能力弱于P2代;树鼩细胞凋亡检测可估算出活细胞的比例为90.120%,死亡细胞为8.77%,凋亡细胞为0.540%;成功培养出树鼩BMSCs第3代,流式细胞仪检测 CD34、CD45 阴性表达分别为 0.00%、0.00%,CD90、CD29、CD147阳性表达分别为96.4%,95.8%,91.3%。角膜内皮细胞诱导培养基诱导骨髓间充质干细胞两周后,细胞NSE染色阴性,油红0染色出现大量红色脂滴,证实为脂肪细胞。晶体匀浆共培养BMSCsNSE染色阳性,虹膜和角膜内皮细胞共培养BMSCs NSE染色阴性。恒河猴BMSCs细胞凋亡检测可估算出活细胞的比例为73.83%,死亡细胞为21.76%,凋亡细胞为4.27%;成功培养出恒河猴BMSCs第3代,恒河猴BMSCs流式细胞仪检测CD34、CD45阴性表达分别为0.00%、0.00%,CD90、CD29、CD147阳性表达分别为98.8%,96.4%,89.7%。[结论]本实验分离培养的细胞群与BMSCs的生物学特性及表型相吻合,成骨细胞和脂肪细胞诱导结果显示该细胞为具有多向分化潜能的间充质干细胞,说明分离的细胞为间充质干细胞;细胞凋亡检测说明细胞活性良好,证实树鼩及恒河猴BMSCs易于体外分离、培养和扩增。树鼩角膜内皮细胞诱导培养基、虹膜和角膜内皮细胞匀浆非接触共培养诱导BMSCs结果未能成为角膜内皮样细胞;晶体匀浆非接触共培养BMSCs NSE染色阳性,证实为角膜内皮样细胞。(本文来源于《昆明医科大学》期刊2017-05-01）
孙丰年[8]（2017）在《血管内皮生长因子165对心肌样细胞活性的影响》一文中研究指出目的:探讨携带血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)基因的腺病毒(Ad-VEGF165)转染至心肌样细胞对其表达VEGF165及增殖活性的影响。方法:提取、培养、鉴定骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs);体外诱导BMSCs为心肌样细胞。构建携带VEGF165基因的腺病毒载体并转染至心肌样细胞;实验分为3组:Ad-VEGF165转染心肌样细胞作为实验组;未携带VEGF165基因的腺病毒转染心肌样细胞作为空载体组;未处理的心肌样细胞作为空白对照组。在1周内检测各组VEGF165的表达及心肌样细胞的增殖活性和相关指标表达。结果:VEGF165在实验组可正常表达,与空载体组、对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05);心肌样细胞增殖活性在实验组中最佳,显着优于空载体组和对照组(P<0.05)。结论:成功将Ad-VEGF165转染至心肌样细胞,且表达的VEGF165可增强心肌样细胞的活性。(本文来源于《济宁医学院》期刊2017-04-07）
张灿伟[9]（2017）在《胚胎干细胞来源的角膜缘上皮样细胞及角膜内皮样细胞构建组织工程全厚角膜的研究》一文中研究指出角膜疾病占全世界致盲性眼病的第二位,全世界超过1000万人因为角膜疾病而致盲。目前,对于角膜盲患者来说,角膜移植仍然是唯一确切有效的治疗方法。但是因为目前捐献的角膜材料严重缺乏,而使很多因角膜疾病而致盲的患者很难获得及时而且有效的治疗。因角膜供体缺乏,我国每年实施手术的病人还不到4000例,而每年需行角膜移植的患者却达到约30万。在这种情况下,人造角膜替代品成为了当前研究的热点。人工角膜(Keratoprosthesis)虽然已被批准应用于临床,但因生物相容性差、术后并发症多,难以在临床上推广。组织工程角膜(Tissue-engineered cornea,TECs)角膜是将体外培养的角膜细胞接种于可降解的生物支架材料上构建的与天然角膜具有相似的功能和结构的角膜替代物。因为其生物相容性具良好的,而受到了广泛的关注。角膜组织工程在近几十年来研究取得了较大进展。脱细胞猪角膜基质(Acellular porcine cornea matrix,APCM)及重组的人胶原在临床或实验动物前板层角膜移植中取得良好效果。但对于多种角膜疾病来说,如圆锥角膜、角膜穿孔等,穿透性角膜移植仍是广泛应用的手术方式。由于传统观念的影响,在我国角膜捐献率较低,而角膜屈光手术的开展使适于穿透性移植的角膜供体进一步减少。构建组织工程全厚角膜植片是解决当前穿透性角膜移植供体不足问题的可行的方法。此外,角膜所包含的细胞类型相对较少,主要有内皮细胞、上皮细胞和角膜基质细胞。相对于其他器官来说,构建TECs角膜更简单、易行。TECs的两个关键成分是种子细胞以及其支架材料。脱细胞猪角膜基质(Acellular porcine cornea matrix,APCM)具有正常角膜的关键特性,如良好的透明性和生物相容性、与天然角膜相似的力学特性、低免疫原性、可耐受手术缝合等。对于TECs的构建来说,其是一种良好的支架材料。此外,猪角膜来源非常广泛。所以,在本研究中我们拟选用已经脱除了细胞的猪角膜基质(脱细胞猪角膜基质(Porcine cornea matrix,PCM)作为组织工程全厚角膜的支架。以往文献报道APCM在基质囊袋植入术后可维持一年不降解,且角膜基质细胞在移植术后3周可迁入其内。鉴于此,角膜基质细胞在组织工程全厚角膜构建中未接种。但猪角膜的厚度大于人角膜,经脱细胞程序后,其厚度进一步增加,而植片与植床厚度不匹配可影响角膜移植术后切口的愈合。因此,在以脱细胞猪角膜为支架的组织工程全厚角膜的构建中,如何制备与天然角膜厚度相似的脱细胞猪角膜片层是首先需要解决的问题。种子细胞作为构建TECs中的又一关键成分,需要具备来源广泛、可在体外大量扩增等特点。但原代培养的人角膜上皮和内皮细胞增殖能力有限,而经基因转染的角膜细胞系具有潜在的致瘤性,限制了其临床应用。胚胎干细胞(Human embryonic stem cells,hESCs)因具有强大的增殖能力和分化全能性,可向机体叁个胚层的细胞分化,近年来成为组织工程中种子细胞的一个重要的来源。在我们前期研究中已建立了人胚胎干细胞在体外向角膜缘上皮样细胞和角膜内皮样细胞的诱导分化的方法。诱导的角膜缘上皮样细胞和角膜内皮样细胞与原代培养的细胞具有相似的形态和功能,可作为TECs的种子细胞的来源。角膜的上皮细胞和内皮细胞分别位于角膜前后两面。因此,为了模拟正常角膜结构,建立一个可于支架前后两面同时培养细胞的叁维培养方案也是函待解决的问题。综上所述,在本研究中,我们首先开发了一个可制备与天然角膜厚度相似的APCM支架的切割工具。其次,建立了可用于APCM前后两面同时培养细胞的叁维培养方案。并通过该培养方案将胚胎干细胞来源的角膜缘上皮样(Limbal epithelial cell-like,LEC-like)细胞和角膜内皮样(Corneal endothelial cell-like)细胞作为种子细胞接种于APCM支架尝试构建组织工程全厚角膜,探讨该培养方案用于构建组织工程全厚角膜的可行性。本研究发现制备的脱细胞猪角膜支架与天然角膜具有相似的厚度和生物力学特性。以其为支架,通过我们建立的叁维培养方案构建的组织工程全厚角膜与天然角膜相似,可形成复层的上皮和单层的内皮,且分别表达角膜上皮和角膜内皮细胞标记物。TECs内皮细胞的密度和生物力学特性也与天然角膜相似,并在体内表现出一定的功能。但是该植片的透明度与天然角膜相比仍存在一定的差距,还需要在以后的研究中进一步改进。第一部分APCM支架的制备[目的]探讨使用我们自行设计的APCM切割工具制备的APCM片层是否可用作组织工程全厚角膜的支架。[方法]1.猪角膜脱细胞程序:首先新鲜的猪眼球放置于超净工作台中,使用含1%青霉素与1%链霉素的高温灭菌的PBS充分洗涤。使用角膜穿刺刀和角膜剪取下角膜,中央11mm的角膜使用环钻钻下,然后使用1.5mol/L的无菌氯化钠溶液及5U/ml的DNA/RNA酶处理,脱除猪角膜的细胞成分。2.脱细胞猪角膜片层的切割:将脱完细胞的猪角膜置于我们自行设计的切割工具内,通过加压排出脱细胞猪角膜内的水分,将切割工具的刻度调整至400μm,使用薄刀片沿右侧加压块切割猪角膜基质前板层(如第一部分图2所示),作为组织工程角膜的支架,-20℃无菌保存备用。3.APCM支架的生物学特性检测:HE及DAPI染色检测APCM支架中细胞脱除情况。免疫荧光法检测角膜上皮的基底膜成分collagen Ⅳ和laminin的表达,评价经脱细胞处理的支架的上皮基底膜是否完整。测量样品含水量,使用千分尺测量支架的厚度,分光光度计测量支架的透明度,Instron电子拉伸机测量支架的生物力学强度。[结果]HE和DAPI染色显示APCM支架内未见明显的细胞以及细胞核内物质残留,支架内胶原保存完好,无明显断裂。免疫荧光染色可在APCM支架前表面检测到连续的collagen Ⅳ和laminin表达。APCM支架的厚度和生物力学强度与正常兔角膜相似,含水量略高于正常兔角膜,但透光度略低于正常兔角膜,而经甘油脱水后其透光度增加,甚至略高于正常兔角膜。[结论]高渗盐联合DNA/RNA酶可有效去除猪角膜内的细胞成分,并保留了上皮细胞基底膜。切割后的APCM支架与正常兔角膜厚度和生物力学强度相似,可以用作组织工程全厚角膜构建的支架材料。第二部分hESCs体外分化为LEC-like和CEC-like细胞的实验研究[目的]体外诱导hESCs分化为LEC-like细胞和CEC-like细胞,并分选纯化ABCG2阳性的LEC-like细胞和N-cadherin阳性的CEC-like细胞。[方法]1.hESCs的培养和表型检测:将hESCs H1细胞株培养于Matrigel包被的培养板中,使用mmTeSRl培养基进行培养,每5天传代。免疫荧光法检测hESCs标记物OCT4及SSEA-3的表达。2.人角膜缘上皮细胞和基质成纤维细胞的培养和鉴定:(1)角膜缘上皮细胞(Limbal epithelial cells,LECs)培养:角膜移植术后剩余的角膜环经含1%青霉素-链霉素的PBS充分冲洗后,显微镜下剥除后弹力层,然后置于2.4U/ml的dispase Ⅱ中消化1.5小时,0.25%胰酶-0.02%EDTA消化10分钟,将消化下来的LECs置于2%去生长因子Matrigel包被的培养皿培养。荧光免疫法检测LEC细胞的标记物ABCG2、p63及CK3的表达;(2)角膜基质成纤维细胞(Corneal stromal fibroblasts,CSFs)培养:残余的组织块使用剪刀修剪成约1mm3大小,置于0.02%的胶原酶A中继续消化2小时,离心后接种于培养皿,使用含胎牛血清(FBS)的培养基培养。荧光免疫法检测CSF细胞标记物vimentin和α-SMA的表达。3.条件培养基的收集与配制:(1)LEC细胞条件培养基的配制:根据我们以前研究结果,将收集的LEC细胞培养基与其原培养基以3:1比例混合作为LEC细胞条件培养基;(2)角膜内皮细胞分化培养基的制备:根据我们以前研究结果,晶状体上皮细胞系生长到700%-90%融合时,每12小时收集培养基,与CSF细胞培养基以3:1比例混合作为CEC-like细胞分化培养基。两种条件培养基均经0.22μm滤器过滤除菌后,保存在-80℃冰箱备用。4.体外诱导hESCs分化为LEC-like细胞和CEC-like细胞:(1)hESCs经2mg/ml的dispase酶消化后置于低粘附培养皿中,使用拟胚体(Embryoid bodies,EBs)培养基培养形成EBs。(2)按照我们以往报道的方法诱导hESCs分化为LEC-like和CEC-like细胞。LEC-like细胞的诱导:Ⅳ型胶原包被培养板,24孔板每孔中接种10-15个EBs,使用角膜缘上皮细胞条件培养基培养9天,诱导其分化为LEC-like细胞。CEC-like细胞的诱导:纤连蛋白、层黏连蛋白以及硫酸软骨素包被液包被的六孔细胞培养板,每孔接种80个EBs,通过Transwell与CSF细胞共培养5天,随后去除CSF细胞,使用CEC-like细胞分化培养基继续培养2周,诱导其分化为CEC-like细胞。5.LEC-like细胞和CEC-like细胞的表型鉴定和纯化:(1)LEC-like细胞表型的鉴定和纯化:荧光免疫法检测ABCG2、p63和CK3的表达,流式细胞术分选ABCG2阳性的细胞,作为LEC-like细胞;(2)CEC-like细胞表型鉴定和纯化:免疫荧光法检测N-cadherin、ZO-1和Na+/K+ATP酶的表达,流式细胞术分选N-cadherin阳性的细胞作为CEC-like细胞。[结果]诱导的LEC-like细胞呈铺路石样,高表达ABCG2,p63和CK3,与原代培养的LEC细胞相似。诱导的CEC-like细胞呈多边形,在EBs周围形成内皮细胞单层,CEC细胞标记物N-cadherin、ZO-1和Na+/K+ATP酶荧光免疫染色呈阳性。流式细胞术分析显示诱导的LEC-like细胞中ABCG2阳性的细胞约为34.94%,诱导的CEC-like细胞中N-cadherin阳性的细胞约10.91%。流式细胞术分选的LEC-like 细胞共表达 ABCG2 和 p63,分选的 CEC-like 共表达 N-cadherin、ZO-1和 Na+/K+ ATP 酶。[结论]我们诱导的LEC-like细胞和CEC-like细胞分别与原代培养的角膜缘上皮细胞和角膜内皮细胞表现出相似的形态和标记物表达。通过细胞分选可获取纯度较高的LEC-like细胞和CEC-like细胞。第叁部分组织工程全厚角膜的构建和体内功能的检测[目的]探讨使用我们建立的叁维培养方案构建组织工程全厚角膜的可行性,并进一步检测构建的组织工程角膜的生物学特性和体内功能,评估其用于穿透性角膜移植(Penetrating keratoplasty,PKP)的可行性。[方法]1.CEC-like细胞和LEC-like细胞的接种:将APCM支架置于我们开发的培养系统的中空插件内(如第叁部分图1所示),基质面朝上,将CEC-like细胞按3000/mm2接种于基质面,培养两周。随后反转构建物,使其前弹力层面朝上,然后按照1.5×1 04/mm2的密度接种LEC-like细胞。培养基没过构建物培养1周,随后改为气液界面法继续培养1周,促进上皮形成复层。2.组织工程角膜形态及生物学特性检测:H&E染色观察组织工程角膜的组织形态。荧光免疫法检测组织工程角膜上皮及内皮标记物的表达。台盼蓝-茜素红染色,随后于显微镜下计数内皮细胞密度。使用千分尺测量组织工程角膜的厚度,分光光度计测量其的透光度,Instron电子拉伸机测量其生物力学强度。3.穿透性角膜移植:实验组以组织工程全厚角膜作为植片进行PKP手术。对照组:以APCM支架为植片,其余操作与实验组相同。术后行裂隙灯检查、眼压测量以及眼前节OCT检查,观察组织工程角膜植片透明度和厚度变化、角膜新生血管生长及术后免疫排斥反应。术后8周行共聚焦激光角膜显微镜检查观察内皮情况。4.组织学观察:术后1、2、4和8周分别摘除1只家兔角膜,H&E染色观察术后组织工程角膜和APCM支架上皮和内皮的变化、基质细胞长入和浸润的炎细胞。抗人核抗体追踪TECs内人角膜细胞在移植术后的变化。免疫荧光法检测移植术后TECs上皮及内皮标记物的表达。[结果]1.组织工程全厚角膜生物学特征的体外检测:HE染色可见构建物形成3-4层上皮和单层的内皮。免疫荧光染色显示:在构建物上皮层中,角膜上皮细胞标记物CK3呈阳性,部分基底部细胞中角膜缘干细胞标记物ABCG2呈阳性,但未检测到p63的表达。构建物内皮中CEC细胞标记物Na+/K+ATP酶、N-cadherin和ZO-1。组织工程角膜与正常兔角膜具有相似的内皮细胞密度、厚度和生物力学强度,但透光度略低于正常兔角膜。2.组织工程全厚角膜体内功能的检测:穿透性角膜移植术后实验组和对照组角膜植片厚度均增加,术后1周后,实验组植片开始变薄,透明度逐渐增加;对照组植片厚度逐渐增加,透明度随时间延长逐渐下降。2-4周时两组中家兔的植片中开始出现新生血管,但在对照组中,新生血管生长更快,至术后8周时新生血管已经长满植片,植片厚度平均为780μm,呈瓷白色,不透明。实验组至术后8周时新生血管长入植片边缘,厚度平均为460μm,透过植片可见虹膜。HE染色示:实验组植片各时间点均可见上皮和内皮细胞覆盖,对照组至术后4周时可见上皮细胞覆盖,但观察期内植片后表面未见内皮细胞。术后2周时两组植片中均可见炎细胞浸润,但在观察期内未见炎细胞明显增加。抗人核抗体染色显示:实验组在4周内可检测到抗人核抗体阳性的上皮细胞。术后8周时在植片上皮中未检测到抗人核抗体阳性的细胞,但在内皮还可以检测到抗人核抗体阳性的细胞,而对照组中没有检测到抗人核抗体阳性的细胞。免疫荧光染色显示:术后4周时,移植的组织工程角膜上皮中可检测到抗人CK3抗体染色阳性的细胞,但未检测到人ABCG2和p63的表达。术后8周时抗人CK3阳性的细胞消失,但在植片内皮面仍可检测到表达人角膜内皮细胞标记物的细胞。[结论]我们建立的叁维培养方案可用于组织工程全厚角膜的构建,构建的角膜与天然角膜具有相似的内皮细胞密度、厚度和生物力学强度。在体内,组织工程全厚角膜也表现出一定的天然角膜的生物学功能,且免疫排斥反应并不重,但其透明度仍低于天然角膜。如何提高构建的组织工程全厚角膜在体内的透明度还需要在以后的实验中再进一步研究。(本文来源于《山东大学》期刊2017-04-03）
陈龙[10]（2017）在《大鼠骨髓源神经干细胞向血管内皮细胞样细胞分化的实验研究》一文中研究指出目的:观察SD大鼠骨髓源神经干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells,BMSCs-NSCs)在血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VEC)培养条件下是否分化为内皮样细胞(endothelial-like cells,ELCs)。方法:本实验采用全骨髓培养法分离培养大鼠双侧股骨、胫骨以及肱骨的骨髓,利用骨髓源基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的贴壁生长特性和多次传代培养使其纯化。研究BMSCs的外形改变并绘制P3(Passage 3)代细胞的生长曲线,探讨BMSCs的最适接种密度,利用流式细胞仪检测BMSCs标志物CD34、CD44、CD45、CD90的表达情况。将所得P3代BMSCs消化形成单细胞悬液,调整细胞密度后置于神经干细胞(neural stem cells,NSCs)诱导培养基(20ng/mL bFGF、20ng/mL EGF、B27)中进行悬浮培养,通过免疫细胞化学染色观察神经球表面标志物CD133、Nestin的表达情况。培养所得神经球消化形成单细胞,并进行免疫细胞化学染色检测VEC表面标志物CD31、vWF的表达情况。将所得NSCs悬液置于Matrigel胶质培养基中培养,观察是否形成血管腔样结构。结果:1.BMSCs早期呈簇状生长,细胞呈梭形。P3 BMSCs流式细胞仪检测显示CD44阳性细胞比率为91.4%,CD90阳性细胞比率为93.7%;CD34、CD45的表达均呈阴性反应。2.P3代细胞生长曲线呈“S”型,其接种最佳密度区间在5×104~1×105/mL。3.BMSCs培养1-2天时细胞聚集呈团块状,随后呈“桑葚状”球形结构,免疫细胞化学染色显示CD133、Nestin的表达均呈阳性反应。4.骨髓源神经球在VEC培养基中培养7天时,细胞呈扁平状,叁角形或多角形,外观似“铺路石”状。在Matrigel胶质培养基中可形成管腔样结构。结论:1.体外利用无血清悬浮培养法,可将大鼠BMSCs诱导分化为NSCs。2.BMSCs-NSCs体外诱导可定向分化为ELCs,并且在Matrigel胶中可形成管腔样结构。(本文来源于《青海大学》期刊2017-03-01）
内皮样细胞论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
背景:牙髓的血管重建是为组织工程牙髓再生提供养分与能量供给的重要环节。干细胞的选择和血管内皮样细胞的定向分化已经成为真正实现牙髓再生的重要研究方向。目的:将小鼠成纤维细胞来源诱导性多能干细胞定向分化为血管内皮样细胞,探讨其与牙髓干细胞共培养促进血管新生的可行性。方法:(1)采用酶消化法制备小鼠睾丸支持细胞饲养层;(2)外源添加血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导小鼠皮肤成纤维细胞来源诱导性多能干细胞定向分化为血管内皮样细胞并进行鉴定;(3)建立血管内皮样细胞与牙髓干细胞共培养体系,荧光实时定量PCR检测CD34、血管内皮生长因子mRNA的表达。结果与结论:(1)诱导分化14 d后倒置显微镜下观察到细胞形态改变,呈现血管内皮形态;(2)流式细胞术鉴定诱导分化细胞CD31阳性,呈现内皮细胞表型;(3)诱导分化14 d后,培养液上清中内皮型一氧化氮合酶水平明显高于未分化细胞(P<0.01);(4)诱导分化14 d后,与未分化对照组相比,实验组细胞内皮素表达增高(P<0.01),前列环素表达降低(P<0.01);(5)血管内皮样细胞与牙髓干细胞共培养5 d后,与血管内皮样细胞单独培养组相比,共培养组CD34和血管内皮生长因子表达增高(P<0.01);(6)结果表明,小鼠成纤维细胞来源的诱导性多能干细胞可以定向分化为血管内皮样细胞,与牙髓干细胞共培养后有形成血管的倾向。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
内皮样细胞论文参考文献
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