全文摘要
本发明涉及一株副干酪乳杆菌配合CAR‑T细胞治疗应用，属于微生物技术领域，具体公开了一种副干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei，MIT‑16）及其在犬肿瘤免疫治疗过程中的应用。从小鼠肠道中分离、筛选到1株产酸能力较高的副干酪乳杆菌MIT‑16，该菌具有较好的耐酸性能和较强的抑菌能力，并且具有显著的免疫调节功能，尤其对肿瘤治疗中的免疫反应调节具有重要作用。所述菌株可用作免疫调节生物治疗剂。
主设计要求
1.一株副干酪乳杆菌，其特征在于，副干酪乳杆菌是从动物源中分离出来，得到新的副干酪乳杆菌，菌株命名为副干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei）MIT-16，该菌株纯培养物于2019年07月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCCNO.18077。
设计方案
1.一株副干酪乳杆菌，其特征在于，副干酪乳杆菌是从动物源中分离出来，得到新的副干酪乳杆菌，菌株命名为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei<\/i>）MIT-16，该菌株纯培养物于2019年07月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.18077。
2.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌，其特征在于，所述副干酪乳杆菌MIT-16有效物为菌株活体细胞或菌株的培养物。
3.根据权利要求1或2所述的副干酪乳杆菌，其特征在于，所述副干酪乳杆菌MIT-16配合CAR-T细胞治疗应用于制备免疫调节药物中。
4.一种菌剂，其特征在于，活性成分中含有权利要求1或2所述的副干酪乳杆菌MIT-16。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂制成药物，药物的剂型选自片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂或者乳剂中的至少一种。
6.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述副干酪乳杆菌MIT-16应用于抑制沙门氏菌，维持肠道菌群平衡。
7.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述副干酪乳杆菌MIT-16应用于肠道定植能力，调节肠道微生态。
8.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述副干酪乳杆菌MIT-16应用于制备免疫调节剂中。
9.根据权利要求8所述的菌剂，其特征在于，所述免疫调节剂降低促炎因子TNF-α、IL-6、IL-2的产生，改善Th1\/Th2平衡，应用于制备抗炎生物制剂中。
10.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述副干酪乳杆菌MIT-16的浓度大于等于106<\/sup>CFU\/g。
设计说明书
技术领域
本发明涉及一株副干酪乳杆菌配合CAR-T细胞治疗应用，尤其涉及一株性能优良的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei<\/i>）MIT-16及其配合CAR-T细胞技术应用，其属于微生物技术领域。
背景技术
近年来，犬肿瘤性疾病在临床上有日益增多的趋势，成为严危害宠物犬和工作犬最主要的疾病之一。目前关于犬肿瘤的治疗尚无有效的特异性免疫疗法。抗体(antibody)和过继细胞治疗(doptive cell therapy，ACT)是肿瘤免疫治疗目前最受关注的两个方向。CAR-T，即表达嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）修饰的T细胞，属于过继细胞治疗一种。和传统治疗方法相比，CAR-T免疫细胞治疗显示出更好的疗效和更低的副作用，可以作为犬肿瘤治疗的新途径。另外，研究犬的原发性肿瘤可以作为研究人类肿瘤极好的模型，利用犬的肿瘤来评估新的探索性疗法的有效性。然而，CAR-T细胞治疗在小动物临床应用过程中，仍需要解决细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）等不良反应，主要是指大量细胞因子IFN-r、IL-6、IL-2、IL-8、TNF-α的释放。
乳酸菌（Lactic acid bacteria<\/i>，LAB）是能发酵葡萄糖或可利用的碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称，在发酵食品中具有重要的应用。近些年，乳酸菌对人体免疫系统的调节作用成为研究热点之一。乳酸菌对机体细胞免疫的作用主要通过激活巨噬细胞、NK细胞和B淋巴细胞的活性，促进白介素和干扰素等细胞因子的产生而实现的，维持机体的免疫平衡。开发免疫调节相关乳酸菌制品，具有重要意义。
然而，上述研究很少探讨益生菌株是否可应用于肿瘤治疗后的免疫调节，尤其是CAR-T免疫治疗后CRS全身性炎症反应，也未提出益生菌株可能涉及的调控机制。
有鉴于此，亟需提供一种益生菌株在提供配合CAR-T免疫治疗的新用途，以开发益生菌株的其它应用面。
另外，本发明的其他方面提供了副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei<\/i>）MIT-16在抑制条件性致病菌，维持肠道菌群方面进行研究。
发明内容
本发明针对上述现有技术中存在的不足，提供一株副干酪乳杆菌及其应用。
本发明副干酪乳杆菌MIT-16配合CAR-T细胞治疗应用于制备免疫调节药物中。
所述副干酪乳杆菌是从动物源中分离出来，得到新的副干酪乳杆菌，菌株命名为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei<\/i>）MIT-16，该菌株纯培养物于2019年07月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.18077。
所述副干酪乳杆菌MIT-16以CaCO3<\/sub>-MRS培养基为筛选培养基，从小鼠肠道不同部位中分离筛选到55株单菌落，根据革兰氏染色以及全自动微生物鉴定系统实验结果，结合耐酸耐胆碱盐实验，粘附实验，筛选出一株具有耐酸耐胆碱及高黏附性的副干酪乳杆菌MIT-16。
本发明的另一个目的是提供一株副干酪乳杆菌MIT-16在肠道具有较强定植能力的应用。
本发明的另一个目的是提供了一株副干酪乳杆菌MIT-16在抑制沙门氏菌，维持肠道菌群平衡的应用。
本发明的另一个目的是提供了一株副干酪乳杆菌MIT-16用于制备免疫调节剂。
所述副干酪乳杆菌MIT-16的生物学特性，该菌株革兰氏阳性，具有较强的黏附性和耐酸耐胆碱能力。
所述副干酪乳杆菌MIT-16在肠道各部位具有较强的粘附性及定植率，粘附率高，且能稳定定植。
所述副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei<\/i>）MIT-16配合CAR-T细胞治疗技术，克服临床上的不良反应，增强肿瘤治疗过程中的免疫功能。
所述免疫调节降低促炎因子TNF-α、IL-6、IL-2的产生，改善Th1\/Th2平衡，应用于制备抗炎生物制剂中。
所述副干酪乳杆菌MIT-16，该菌株具有较强的耐酸耐胆碱能力、免疫调节活性，可以抑制炎症性细胞因子TNF-α的分泌，增强IL-10等免疫因子的表达，具有免疫调节功能；该菌株具有较强的黏附性，在肠道内进行定植，用于维持肠道菌群平衡。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：1、副干酪乳杆菌（Lactobacillus<\/i>paracasei<\/i>）MIT-16，分离自健康动物肠道组织中，来源比较安全；2、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei<\/i>）MIT-16，具有较强的免疫调节活性，增强免疫功能，刺激免疫细胞产生免疫因子，维持机体的免疫平衡，调控炎症反应；3、副干酪乳杆菌（Lactobacillus<\/i>paracasei<\/i>）MIT-16可以抑制条件性致病菌大肠杆菌、沙门氏菌等，调节肠道菌群平衡；4、本发明所述副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei<\/i>）MIT-16配合CAR-T细胞治疗技术，克服临床上的不良反应，增强肿瘤治疗过程中的免疫功能。
附图说明
图1是副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei<\/i>）MIT-16溶钙圈法筛选乳酸菌菌落示意图。
图2是副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei<\/i>）MIT-16革兰氏染色光学显微镜照片示意图。
图3是副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei<\/i>）MIT-16对HT-29细胞的粘附能力示意图。
图4是副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei<\/i>）MIT-16对沙门氏菌抑菌效果的示意图。其中，A，副干酪乳杆菌MIT-16的浓度为108<\/sup>CFU\/mL；B，副干酪乳杆菌MIT-16的浓度为107<\/sup>CFU\/mL；C，副干酪乳杆菌MIT-16的浓度为106<\/sup>CFU\/mL；D，副干酪乳杆菌MIT-16的浓度为105<\/sup>CFU\/mL。
图5是流式细胞术分析副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei<\/i>）MIT-16对小鼠免疫细胞Th1的影响示意图。其中A为对照组。
图6是流式细胞术分析副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei<\/i>）MIT-16对小鼠免疫细胞Th1的影响示意图。其中B为副干酪乳杆菌组。
图7是流式细胞术分析副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei<\/i>）MIT-16对小鼠免疫细胞Th1的影响示意图。其中C为CAR-T组。
图8是流式细胞术分析副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei<\/i>）MIT-16对小鼠免疫细胞Th1的影响示意图。其中D为CAR-T+副干酪乳杆菌组。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明副干酪乳杆菌MIT-16配合CAR-T细胞治疗应用于制备免疫调节药物中。
所述副干酪乳杆菌是从动物源中分离出来，得到新的副干酪乳杆菌，菌株命名为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei<\/i>）MIT-16，该菌株纯培养物于2019年07月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.18077。
所述副干酪乳杆菌MIT-16以CaCO3<\/sub>-MRS培养基为筛选培养基，从小鼠肠道不同部位中分离筛选到55株单菌落，根据革兰氏染色以及全自动微生物鉴定系统实验结果，结合耐酸耐胆碱盐实验，粘附实验，筛选出一株具有耐酸耐胆碱及高黏附性的副干酪乳杆菌MIT-16。
本发明的另一个目的是提供一株副干酪乳杆菌MIT-16在肠道具有较强定植能力的应用。
本发明的另一个目的是提供了一株副干酪乳杆菌MIT-16在抑制沙门氏菌，维持肠道菌群平衡的应用。
本发明的另一个目的是提供了一株副干酪乳杆菌MIT-16用于制备免疫调节剂。
所述副干酪乳杆菌MIT-16的生物学特性，该菌株革兰氏阳性，具有较强的黏附性和耐酸耐胆碱能力。
所述副干酪乳杆菌MIT-16在肠道各部位具有较强的粘附性及定植率，粘附率高，且能稳定定植。
所述副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei<\/i>）MIT-16配合CAR-T细胞治疗技术，克服临床上的不良反应，增强肿瘤治疗过程中的免疫功能。
所述免疫调节降低促炎因子TNF-α、IL-6、IL-2的产生，改善Th1\/Th2平衡，应用于制备抗炎生物制剂中。
所述副干酪乳杆菌MIT-16，该菌株具有较强的耐酸耐胆碱能力、免疫调节活性，可以抑制炎症性细胞因子TNF-α的分泌，增强IL-10等免疫因子的表达，具有免疫调节功能；该菌株具有较强的黏附性，在肠道内进行定植，用于维持肠道菌群平衡。
实施例1
副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei<\/i>）MIT-16的分离、纯化与鉴定。
1、副干酪乳杆菌菌株分离纯化
取小鼠肠道内容物，10倍系列稀释至10-6<\/sup>，每个稀释浓度取200μL涂布于含1%CaCO3<\/sub>的MRS乳酸菌筛选培养基上，37℃厌氧罐中培养72h，挑取平板上具有溶钙圈的单菌落，继续在MRS固体培养基上划线纯化，37℃厌氧罐中培养48h，获得较纯的菌落。MRS培养基筛选菌落见图1。本发明菌株在含CaCO3<\/sub>的MRS培养基上菌落直径1-2mm，白色，凸起，菌落周围透明圈为溶钙圈。对纯化后菌落进行革兰氏染色鉴定。菌体革兰氏染色特性见图2。该菌株革兰氏阳性，长杆状。
2、菌株筛选鉴定
对获得的菌株MIT-16利用微生物鉴定系统（梅里埃，VITEK 2）进行鉴定。微生物系统鉴定结果见表1。结合微生物系统鉴定，MIT-16为一株副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌MIT-16。该株菌可以分解D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖等，具有苯丙氨酸芳胺酶、L-脯氨酸芳胺酶、吡咯烷基芳胺酶等活性，不能水解D-纤维二糖、D-木糖、蔗糖等。
表1副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei<\/i>）MIT-16全自动微生物鉴定结果
申请码:申请号:CN201910799557.9 申请日:2019-08-28 公开号:CN110305821A 公开日:2019-10-08 国家:CN 国家/省市:37(山东) 授权编号:CN110305821B 授权时间:20191217 主分类号:C12N 1/20 专利分类号:C12N1/20;A61K35/747;A61P29/00;A61P31/04;A61P37/04;C12R1/225 范畴分类:18H; 申请人:鲁东大学 第一申请人:鲁东大学 申请人地址:264000 山东省烟台市芝罘区红旗中路184号 发明人:张兴晓;姜琳琳;张建龙;陈国忠;肖童;齐越;赵尘培;于馨;朱洪伟;黄清荣 第一发明人:张兴晓 当前权利人:鲁东大学 代理人:董宝锞 代理机构:37212 代理机构编号:青岛发思特专利商标代理有限公司 优先权:关键词:当前状态:审核中 类型名称:外观设计
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